任 偉 ， 尹 君 ， 范俊兵 ， 任宏振 ， 蘇振堯

(1.河南省科研平臺(tái)服務(wù)中心 ， 河南 鄭州 450000 ； 2.尉氏縣職業(yè)技術(shù)教育中心 ， 河南 尉氏 475500 ； 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642)

我國(guó)是畜牧業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，抗生素在促進(jìn)生長(zhǎng)和預(yù)防疾病方面效果突出，已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。然而，抗生素在動(dòng)物飼料中的過(guò)度使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)，影響了動(dòng)物和人類健康、食品安全、生態(tài)系統(tǒng)以及畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。2020年7月飼料端開始全面禁用抗生素，很多科研工作者和企業(yè)在積極探索有效的替代產(chǎn)品，來(lái)滿足禁用抗生素后對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和健康的影響。

硫酸鋅(ZnSO4)長(zhǎng)期以來(lái)被用作飼料中的主要營(yíng)養(yǎng)源，但利用率低，需要大量添加；而有機(jī)鋅源的生物利用度相對(duì)高于無(wú)機(jī)鋅源，可降低飼料中鋅的添加濃度[3-5]?？Х人崾且环N從五味子根莖中分離的白色針狀酚羥基類有機(jī)酸，有潛在的藥用價(jià)值，具有多種生物和藥理活性，如抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌和神經(jīng)保護(hù)作用[6-8]。該研究通過(guò)評(píng)價(jià)咖啡酸螯合鋅的體外生物活性，為提高鋅的有效利用率和開發(fā)理想替抗產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥品、試劑及耗材

咖啡酸螯合鋅，斯卡恩動(dòng)物保健品(商丘)有限公司；硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；人工胃液、人工腸液，上海信帆生物科技有限公司；透析袋(3.5 kDa)，蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；96孔培養(yǎng)板，貝蘭伯生物技術(shù)(杭州)有限公司；EMB固體培養(yǎng)基以及LB 液體、固體培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司。

1.1.2儀器設(shè)備

超聲波清洗器，上海菁華科技儀器有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；無(wú)菌超凈臺(tái)、單人單面凈化工作臺(tái)、水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市振興儀器廠；臺(tái)式微量高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1體外消化吸收率測(cè)定

1.2.1.1體外模擬胃消化

分別稱取含有效鋅離子1 000 mg的咖啡酸螯合鋅和硫酸鋅，用100 mL蒸餾水完全溶解，配制成含鋅離子濃度為10 g/L的咖啡酸螯合鋅溶液和硫酸鋅溶液；用濃度為1 mol/L 的鹽酸溶液將上述兩種溶液的pH 值調(diào)至2.0；準(zhǔn)確量取5 mL模擬人工胃液，加入上述兩種溶液中，置于37 ℃水浴中振蕩 2 h，結(jié)束后，再將上述兩種溶液置于 100 ℃ 水浴中 10 min 對(duì)消化酶滅活，即模擬的胃消化液。

1.2.1.2體外模擬腸吸收

取1.2.1.1制備的模擬胃消化液，用濃度0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)胃消化液pH值至7.0，再向溶液中加入5 mL模擬人工腸液，混合均勻；將混合均勻的溶液裝入透析袋(3.5 kDa)，置于37 ℃水浴中振蕩 2 h，結(jié)束后，將溶液置于100 ℃水浴中10 min對(duì)消化酶滅活。

1.2.1.3鋅離子吸收率的測(cè)定

取1.2.1.1、1.2.1.2中制備的含有咖啡酸螯合鋅溶液或硫酸鋅溶液的模擬胃消化液和模擬腸消化液各20 mL，15 000 r/min離心10 min，測(cè)定3個(gè)重復(fù)。按照《飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測(cè)定 原子吸收光譜法》(GB/T 13885—2017 )中鋅含量測(cè)定方法，分別測(cè)定上清液中鋅離子的含量和1.2.1.1中咖啡酸螯合鋅溶液、硫酸鋅溶液中鋅離子的含量。按照公式(1)計(jì)算鋅離子溶解率。

(1)

式中：c1為上清液中鋅離子的濃度，g/L，c2為咖啡酸鋅溶液、硫酸鋅溶液中鋅離子的濃度，g/L。

1.2.1.4鋅離子透過(guò)率的測(cè)定

測(cè)定模擬腸吸收的溶液經(jīng)過(guò)透析袋后溶液中鋅離子的含量，3次重復(fù)，測(cè)定鋅離子的透過(guò)率。按照公式(2)計(jì)算鋅離子透過(guò)率。

(2)

式中：c1為透析袋外鋅離子的濃度，g/L，c2為模擬腸吸收的溶液中鋅離子的濃度，g/L。

1.2.2體外抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1菌株分離

采集新鮮的雞糞、豬糞，用濃度為0.85%的生理鹽水50倍稀釋，量取稀釋液0.1 mL，涂布到EMB固體培養(yǎng)基平板；37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察固體培養(yǎng)基平板上菌落的形態(tài)；用接種針挑取單個(gè)菌落接種斜面培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，分別鑒定篩選豬源大腸桿菌、雞源大腸桿菌、豬源沙門菌和雞源沙門菌各5株備用。

1.2.2.2菌懸液的制備

從1.2.2.1中分離的4種細(xì)菌中，每種各隨機(jī)選取1株在斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆玫膯蝹€(gè)菌落，接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)6～8 h，取20 μL菌液入5 mL肉湯培養(yǎng)基，搖勻備用，此時(shí)菌液濃度為1×1011～2×1011CFU/L。使用前作1 000倍稀釋，此時(shí)菌液濃度為1×108～2×108CFU/mL。

1.2.2.3抑菌液的制備

取2個(gè)滅菌過(guò)的100 mL容量瓶，再分別稱取0.102 4 g(有效含量以咖啡酸計(jì))的咖啡酸螯合鋅、咖啡酸于容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入50 mL滅菌蒸餾水溶解完全，混勻，再用滅菌蒸餾水定容至100 mL，作為濃度為1 024 mg/L的儲(chǔ)備液置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫礊橐志骸?/p>

1.2.2.4抑菌試驗(yàn)

取滅菌處理后的96孔培養(yǎng)板，用移液槍量取100 μL LB液體培養(yǎng)基加入第1排第1孔到第12孔；再量取100 μL 抑菌液，加入第1排第1孔中混勻，從第 1孔吸 100 μL抑菌液加入第2孔混勻，從第2孔吸100 μL抑菌液加入第3孔混勻；依次稀釋至第10孔，并從第10孔吸取100 μL 棄去。此時(shí)各孔的抑菌液濃度依次為：512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L。稀釋完成后，每孔加入濃度為108CFU/L的菌懸液100 μL ，第11孔是菌液不加抑菌液的陽(yáng)性對(duì)照孔，第12孔是加抑菌液不加菌液的陰性對(duì)照孔。將96孔板在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察孔內(nèi)液體是否透明， 以肉眼觀察的無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)(透明)孔對(duì)應(yīng)的抑菌液濃度作為最低抑菌濃度(MIC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示，P<0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化吸收率測(cè)定結(jié)果

咖啡酸螯合鋅在模擬體外胃腸道環(huán)境條件下消化吸收率的測(cè)定結(jié)果見表1?？Х人狎箱\在模擬胃、腸環(huán)境下的鋅離子吸收率顯著(P<0.05)高于硫酸鋅；在模擬腸吸收的溶液經(jīng)過(guò)透析袋后，溶液中的鋅離子透過(guò)率顯著(P<0.05)高于硫酸鋅。

胃的消化是在酸性(pH值<4.0)環(huán)境下進(jìn)行的，特定的酸性環(huán)境有利于金屬離子的釋放和吸收，因此，咖啡酸螯合鋅和硫酸鋅模擬胃環(huán)境下的鋅離子都表現(xiàn)出較好的吸收率[16]。腸的消化是在堿性環(huán)境條件下進(jìn)行的，無(wú)機(jī)鋅容易形成不溶性的金屬絡(luò)合物，影響金屬離子的吸收和利用，因此，在咖啡酸螯合鋅在模擬腸環(huán)境下鋅離子的吸收率和透過(guò)率都高于硫酸鋅[17]。

表1 體外消化吸收率測(cè)定結(jié)果 %

2.2 體外抑菌試驗(yàn)MIC測(cè)定結(jié)果

咖啡酸和咖啡酸螯合鋅的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖1和表2?？Х人釋?duì)豬源大腸桿菌MIC值為64 mg/L，禽源大腸桿菌MIC值為64 mg/L，豬源沙門菌MIC值為128 mg/L，禽源沙門菌MIC值為64 mg/L；咖啡酸螯合鋅對(duì)豬源大腸桿菌MIC值為32 mg/L，禽源大腸桿菌MIC值為16 mg/L，豬源沙門菌MIC值為64 mg/L，禽源沙門菌MIC值為16 mg/L。

圖1 咖啡酸和咖啡酸螯合鋅體外抑菌試驗(yàn)MIC值比較

表2 咖啡酸和咖啡酸螯合鋅體外抑菌試驗(yàn)MIC測(cè)定結(jié)果

圖1可以看出，咖啡酸螯合鋅對(duì)豬源大腸桿菌、沙門菌的體外抑菌MIC值均低于咖啡酸；咖啡酸螯合鋅對(duì)豬源大腸桿菌的MIC值低于豬源沙門菌，對(duì)禽源大腸桿菌和禽源沙門菌的MIC值相同；咖啡酸螯合鋅對(duì)禽源大腸桿菌的MIC值低于豬源大腸桿菌，對(duì)禽源沙門菌的MIC值低于豬源沙門菌，可見咖啡酸螯合鋅對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源的病原菌MIC值有一定差異。

3 結(jié)論

據(jù)觀察，蛋氨酸鋅(Zn-Met)中鋅的生物利用度為228%，相對(duì)于硫酸鋅(ZnSO4)(100%)，而氧化鋅的生物利用度僅為61%[11]。

本研究咖啡酸螯合鋅在模擬胃環(huán)境下的鋅離子溶解率為(92.46±1.23)%，優(yōu)于硫酸鋅；而在模擬腸環(huán)境下的咖啡酸螯合鋅溶解率為(67.68±1.92)%，與硫酸鋅相比增加77.12%；而咖啡酸螯合鋅透過(guò)率為(36.32±1.18)%，與硫酸鋅相比增加108.18%，可見咖啡酸螯合鋅的生物利用度高于硫酸鋅。

咖啡酸螯合鋅是由咖啡酸上的酚羥基與鋅離子形成配位鍵，增加了咖啡酸與鋅離子之間的穩(wěn)定性，在胃腸環(huán)境條件下不易受胃的酸性環(huán)境、腸道的堿性環(huán)境的破壞，因此在胃腸環(huán)境條件下咖啡酸螯合鋅在吸收率和透過(guò)率表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)?？Х人狎箱\以分子狀態(tài)更容易穿透腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物利用度。

咖啡酸是富含羥基肉桂酸的一種重要天然衍生物，咖啡酸通過(guò)羧酸基團(tuán)與鋅離子螯合，會(huì)影響配體的生物學(xué)特性，包括抗氧化和抗菌活性?？Х人狎箱\對(duì)大腸桿菌、沙氏菌的體外抑菌的MIC值明顯優(yōu)于咖啡酸的MIC值，可能跟脂溶性有關(guān)。

咖啡酸螯合鋅中鋅離子的利用率高和抑菌活性強(qiáng)，為一種新型的鋅源和替抗產(chǎn)品的研究提供了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。