張影，石剛，李彬，杜宗利，辛?xí)苑?，徐穎華

鉤端螺旋體（簡稱鉤體）屬按照致病性不同可分為問號鉤體和腐生性鉤體，前者主要分離于病人和動物，具有寄生性；而腐生性鉤體通常對人或動物不致病，常存在于環(huán)境土壤和水中[1]。人感染鉤體病主要通過直接或間接接觸了受問號致病性鉤體污染的水、土壤或帶菌動物的尿液。據(jù)統(tǒng)計報道每年全球仍有約 200 萬鉤體感染病例，其中大多數(shù)來自熱帶及亞熱帶地區(qū)的發(fā)展中國家和不發(fā)達國家，給當(dāng)?shù)厝嗣窠】岛托竽翗I(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響[2-3]。為了更好預(yù)防和控制該傳染病，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于研究鉤體病的快速和早期診斷，例如建立了以腐生性鉤體 Potoc 菌株為抗原的玻片凝集試驗，并被證實該方法對鉤體病的診斷具有一定幫助[4-5]，但其方法內(nèi)在機制尚未完全清楚。為了進一步了解其內(nèi)在分子機制，本研究將腐生性鉤體Potoc 菌株滅活菌液與國內(nèi) 15 種不同血清群致病性鉤體代表菌株血清進行免疫印跡分析，同時對Potoc 菌株進行全基因組測序，分析菌株的全基因組特征，并與已公布不同基因種的致病性鉤體進行比較基因組學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而為解析鉤體屬不同種基因組多樣性和進化等研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 腐生性鉤體 Potoc 型菌株（65-15）來源于中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.1.2 主要儀器和試劑 細(xì)菌培養(yǎng)箱為北京中儀國科科技有限公司產(chǎn)品；Vitek 全自動微生物鑒定儀為梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；EMJH培養(yǎng)基為美國 BD 公司產(chǎn)品；DNA 提取試劑盒為德國 Qiagen 公司產(chǎn)品；國內(nèi) 15 種不同血清群致病性鉤體代表菌株的兔血清來源于中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將腐生性鉤體 Potoc 菌株接種至含 10% EMJH 培養(yǎng)基中，28 ℃ 培養(yǎng) 7～10 d，收集菌體；同時按照 DNA 試劑盒推薦操作步驟，提取菌株全基因組 DNA，DNA 樣品放置于 -70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全基因組序列測定與生物信息學(xué)分析 應(yīng)用 Solexa 測序技術(shù)進行全基因組測序，并分別使用生物信息分析軟件 velvet 1.2.03 和 glimmer 3.02 對獲得下機數(shù)據(jù)進行拼裝和基因預(yù)測，參考SEED 蛋白數(shù)據(jù)庫進行測序基因組所包含的基因功能注釋與直系同源簇（COG）分類。應(yīng)用 CARD耐藥抗性數(shù)據(jù)庫（https://card.mcmaster.ca/）和VFDB 毒力基因分析數(shù)據(jù)庫（http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi?func=VFanalyzer）在線工具對測序基因組進行耐藥性和毒力基因預(yù)測分析。將測序獲得全基因組序列與已發(fā)表的腐生性 Ames菌株（NCBI 登錄號：NC_010842.1、NC_010845.1和 NC_010846.1）進行比較基因組學(xué)分析，并與已發(fā)表致病性鉤體問號基因種 56601 菌株（NCBI 登錄號：NC_004342.2 和 NC_004343.2）、波氏基因種 56142 菌株（NCBI 登錄號：SRX673783）和中間型L.licerasiaeVAR010 菌株（NCBI 登錄號：NZ_AHOO00000000.2）基因組進行共有與特有的基因比較分析。同時將上述 4 株鉤體基因組與其他鉤體菌株包括致病性鉤體衛(wèi)氏基因種 56679 菌株（NCBI 登錄號：SRX673810）、L.kirschneri56611菌株（NCBI 登錄號：SRX673784）、L.santarosai56180 菌株（NCBI 登錄號：SRX673799）、L.noguchii56189 菌株（NCBI 登錄號：SSRX673792）、L.alexanderi56159 菌株（NCBI 登錄號：SRX672003）、L.alstonii56661 菌株（NCBI 登錄號：SRX673771）、L.kmetyiBejo-Iso9T 菌株（NCBI 登錄號：AHMP000000002）和中間型Leptospira johnsoniiE8T菌株（NCBI 登錄號：BFAY00000000）進行核心基因的系統(tǒng)進化樹分析。1.2.3 免疫印跡分析 按參考文獻[6]方法進行Potoc 菌株滅活菌液與 1∶20 稀釋的國內(nèi) 15 種不同血清群致病性鉤體代表菌株的兔血清進行免疫印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 全基因組的特征

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，將測序菌株數(shù)據(jù)拼接，分析發(fā)現(xiàn)腐生性鉤體 65-15 菌株染色體全基因組序列全長為 3 942 789 bp，預(yù)測基因組中所含編碼基因為 3685 個，基因的平均長度為 997 bp，預(yù)測編碼基因占整個基因組序列的 93.2%，其平均 GC含量為 39.0%。所含非編碼區(qū)域大小為 267 456 bp，平均 GC 含量為 37.4%。此外還含有兩個插入元件（ISLbi1 和 ISLbi2）。

以已發(fā)表的腐生性 Ames 菌株為參考進行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩株之間平均核苷酸一致性（ANI）為 99.98%，僅存在 179 個單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）和 46 個插入或缺失（Indel）。SNP 包括103 個非同義 SNP 和 34 個同義 SNP，其中絕大多數(shù)非同義 SNP 影響轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞運動相關(guān)編碼蛋白。其余 42 個 SNP 均位于非編碼區(qū)。

2.2 全基因組序列基因功能分析

應(yīng)用 COG 數(shù)據(jù)庫注釋上述已獲得的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)腐生性鉤體 65-15 菌株中共有2052 個基因具有明確的生物學(xué)功能，其中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)基因數(shù)量高達 261 個，占總注釋基因的12.7%，其次為細(xì)胞膜合成、氨基酸轉(zhuǎn)運代謝、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶相關(guān)的基因（表 1）。此外，仍有 306 個（14.9%）的基因無法獲得功能注釋，有待后續(xù)進一步的分析。

表1 腐生性鉤體 Potoc 菌株基因組的 COG 比較分析Table 1 Comparative analysis COG of the genomes of Leptospira saprophytic Potoc strains

2.3 比較基因組學(xué)分析

應(yīng)用比較基因組學(xué)分析與當(dāng)前中國主要流行群菌株黃疸出血群 L45 菌株（NCBI 登錄號：U61226.2）和波摩那群 L170 菌株（NCBI 登錄號：AF316500）中負(fù)責(zé) O 抗原生物合成基因簇（rfb）序列進行相似度比對分析，在測序的腐生性鉤體65-15 菌株基因組中并沒有發(fā)現(xiàn)類似rfb基因序列或相似基因。

同時，維恩圖分析結(jié)果顯示，與已發(fā)表致病性鉤體問號基因種 56601 菌株、波氏基因種56142 菌株和中間型L.licerasiaeVAR010 菌株基因組存在共有基因 1110 個（圖 1）。這些基因COG 功能分類主要集中在氨基酸代謝、生物合成等。而腐生性鉤體 65-15 菌株含有 2278 個特有基因，COG 功能注釋顯示其中大部分基因與細(xì)菌適應(yīng)不同環(huán)境相關(guān)。

圖1 腐生性鉤體 Potoc 菌株與 3 株不同基因種鉤體代表株的共有和特有基因維恩圖（兩種顏色交接處的數(shù)字表示顏色所指菌株的共有基因數(shù)）Figure 1 Venn diagram of common and unique genes between Leptospira biflexa Potoc strain and three different representative strains of Leptospira species (The figures in the two junction colors represents the number of common genes of both strains)

2.4 免疫印跡分析結(jié)果

免疫印跡分析顯示，Potoc 菌株滅活菌液抗原與 15 種不同血清群致病性鉤體代表菌株的兔血清呈現(xiàn)不同條帶圖譜。例如與拜倫群兔血清在65 kD 和 45 kD 處出現(xiàn)特異性條帶，而波摩那群在 75 kD 處存在特異性條帶。但與 15 種代表性菌株的兔血清在 25～50 kD 處均有明顯的相同特異性結(jié)合條帶（圖 2），提示 Potoc 菌株中存在種屬特異性的蛋白抗原成分。

圖2 腐生性鉤體 Potoc 菌株滅活菌液與國內(nèi) 15 種不同血清群致病性鉤體代表菌株兔血清的免疫印跡分析Figure 2 Results of Western blot analysis of inactivated bacteria solution of Leptospira biflexa Potoc strain and rabbit sera from fifteen Chinese representative different serogroup pathogenic Leptospira

2.5 進化分析

系統(tǒng)發(fā)育進化分析顯示，不同致病性鉤體分成不同進化分支，其中腐生性鉤體菌株位于進化最外端，兩株中間型鉤體菌株L.johnsoniiE8T和L.licerasiaeVAR010 屬于同一個進化分支內(nèi)。9 種不同基因種的致病性鉤體位于同一大進化分支中，并在進化過程中又分成不同亞分支。L.noguchii56189、L.kirschneri56611 和問號基因種 56601 菌株進化關(guān)系近，屬于同一亞分支內(nèi)。其他兩株L.alstonii56661 菌株和L.kmetyiBejo-Iso9T 菌株形成獨立亞分支，較其他 7 種基因種致病性鉤體進化距離較遠(yuǎn)（圖 3）。

圖3 腐生性鉤體與致病型、中間型鉤體全基因組系統(tǒng)發(fā)育進化分析Figure 3 Genome-wide phylogenetic analysis of Leptospira biflexa,pathogenic and intermediate Leptospira

3 討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，快速、低成本的高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛用于不同微生物的基因組學(xué)研究，在全基因組水平揭示其基因信息及生物學(xué)特征，推動了相關(guān)學(xué)科的深入研究[7-9]。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)首次對我國使用多年用于玻片凝集試驗抗原制備的 Potoc 菌株進行分析，獲得該菌種的全基因組特征，以此進行基因組 COG 聚類分析發(fā)現(xiàn)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（261 個基因）和細(xì)胞外膜合成（234 個基因）是高度富集的，推測可能與腐生性鉤體在外界環(huán)境生存能力強，可在普通環(huán)境中長期存活的特性相關(guān)[10-12]。腐生性鉤體 Potoc 株在我國被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過 40 年，其來源與歷史不清楚[4-6]。將本研究獲得的全基因測序數(shù)據(jù)與國外發(fā)表的腐生性 Ames 菌株的全基因序列比較，發(fā)現(xiàn)這兩種菌株基因組之間的 ANI 高達 99.98%，僅存在179 個 SNP 和 46 個 Indel，提示國內(nèi)這株腐生性鉤體 Potoc 菌株與國外已發(fā)表的可能為同一來源，在各自實驗室傳代保存過程中，發(fā)生隨機突變，從而產(chǎn)生一些堿基變化[13]。

致病性鉤體 O 抗原是其重要的表面抗原，其結(jié)構(gòu)多樣性構(gòu)成了不同血清群分類的基礎(chǔ)[7]。不同血清型鉤體之間，例如問號鉤體哥本哈根型與哈焦型，兩者rfb之間僅有 16 個基因相似，而相同血清型菌株整個rfb基因相似度可高達 90% 以上[7-8]。將本研究獲得的 Potoc 菌株全基因組序列與國內(nèi)最主要流行兩個血清群黃疸出血群和波摩那群rfb基因序列比較分析，發(fā)現(xiàn) Potoc 菌株基因組中并沒有相類似rfb基因序列，提示 Potoc菌株中與致病性鉤體發(fā)生特異性結(jié)合的并非 O 抗原。Western blot 分析顯示的 25～50 kD 處的共同特異性結(jié)合條帶進一步支持種屬特異性可能是其他類型蛋白抗原成分[14]。事實上，我國研究人員發(fā)現(xiàn)三種不同毒力鉤體外膜蛋白能與 Potoc 菌株特異性抗血清在 31 kD 出現(xiàn)特異性反應(yīng)的陽性條帶，建議這種 31 kD 外膜蛋白為潛在的種屬特異性抗原之一[6]。這些種屬特異性抗原不僅可作為鉤體病實驗室診斷方法的潛在靶標(biāo)，同時也為未來鉤體通用型疫苗的開發(fā)提供新的線索[15-16]。

比較基因組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐生性鉤體與其他中間型和致病性鉤體的共有基因僅有 1100 余種，主要是維持微生物生存基本所需的，例如，氨基酸代謝、生物合成等[17]。而腐生性鉤體特有的2278 個基因中，大部分與細(xì)菌適應(yīng)不同環(huán)境相關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育進化樹進一步證實腐生性鉤體位于系統(tǒng)進化樹最外圍，為致病性鉤體種屬的近祖先，而致病性和中間型鉤體的遺傳發(fā)育關(guān)系較近，在進化過程獲得不同基因，形成不同的寄生能力和致病性[9-10]。

綜上所述，本研究獲得了我國的腐生性鉤體Potoc 菌株的基本特征，探究了鉤體屬特異性抗原，揭示了不同基因種鉤體基因組多樣性，為后續(xù)致病性鉤體的診斷和進化等研究奠定一定基礎(chǔ)。