魯斌，程加峰，汪洋，冀林，王巖松，趙平*

(1.蕪湖市第一人民醫(yī)院骨一科，安徽 蕪湖 241000；2.哈爾濱市第一醫(yī)院骨一科，黑龍江哈爾濱 150081；3.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科，黑龍江 哈爾濱 150081)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的關節(jié)疾病，大約50%的65歲以上和12%的25歲以上人群患有此種疾病[1]。OA的主要病理機制是軟骨細胞炎癥、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解、關節(jié)軟骨喪失、軟骨下骨增殖和骨贅形成，最終導致關節(jié)功能喪失[2]。目前，確定的OA危險因素包括衰老、肥胖或體重、關節(jié)損傷史、遺傳、性別和解剖因素[3]。但是，OA的確切分子發(fā)病機制仍不清楚[4]。關節(jié)軟骨沒有自我修復能力，其穩(wěn)態(tài)受到一系列因素的精確調控，因此了解OA過程中軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)機制對于尋找OA有效治療方案具有重要意義。研究表明，炎癥參與了OA軟骨細胞的病理過程[5]。關節(jié)腔微環(huán)境中的炎癥因子如白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α可能會降低軟骨細胞的活力并增加壞死和凋亡[6-7]。有研究已經(jīng)確定了某些分子對OA的作用，例如OA期間乙?；?(Sirtuin 1，SIRT1)活性和水平的降低會促進軟骨的逐漸喪失，SIRT1抑制人OA軟骨細胞中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13，減少軟骨基質的丟失[8]。對OA軟骨細胞分子功能的不斷探索將有助于本研究找出潛在的新型治療靶點。

牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein，DMP-1)是一種酸性細胞外基質蛋白，在牙本質和骨組織中高表達，在牙本質和骨形成中起到了重要的作用[9]。然而，目前尚未有研究DMP-1在OA軟骨細胞中的作用。本研究評估了DMP-1在OA軟骨細胞中的表達，并確定了其對軟骨細胞的生物學作用。使用體外和體內(nèi)模型評估DMP-1水平，測定了DMP-1對ECM合成、炎癥、細胞凋亡的影響。這些發(fā)現(xiàn)揭示了DMP-1對OA發(fā)病機理，為治療OA尋找潛在新型治療靶點提供線索。

1 材料和方法

1.1 Affymetrix微陣列分析 作者從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫下載GSE42295基因表達數(shù)據(jù)集[(Rat230_2) Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array]，選取3例手術誘發(fā)的8周大鼠OA模型以及相應的對照組，通過DESeq軟件包篩選對照組8周和OA組8周之間鑒別差異表達基因(differential gene expression，DEG)(P<0.05)[10]，進而分析OA大鼠模型中軟骨細胞的DMP-1的水平。

1.2 建立體外OA模型 挑選新生的SD大鼠(體重5～6 g)，處死大鼠，膝關節(jié)獲取關節(jié)軟骨，將軟骨組織切成1～3 mm3的小塊。在37 ℃下用2 mg/mL膠原酶Ⅱ(Sigma)消化3 h，將消化的軟骨細胞懸浮在Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)中，該培養(yǎng)基中添加了1%青霉素/鏈霉素(碧云天)和10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Sciencell公司)。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，將第3代細胞用于后續(xù)的實驗。使用IL-1β(10 ng/mL；Merk公司)刺激軟骨細胞，建立體外OA模型[11]。

1.3 質粒的構建和細胞轉染 DMP-1過表達質粒和陰性對照質粒通過上海吉瑪基因設計合成。將軟骨細胞以每孔5×106個細胞的密度接種到6孔板中過夜，當融合達到70%～80%的密度時，使用Lipofectamine?3000試劑進行轉染。實驗分為以下四組：對照組(軟骨細胞，未經(jīng)任何處理)；IL-1β組(用IL-1β處理的軟骨細胞)；IL-1β+pcDNA組(用IL-1β處理并用陰性對照質粒轉染的軟骨細胞)和IL-1β+DMP-1組(用IL-1β處理并用DMP-1過表達質粒轉染的軟骨細胞)。

1.4 細胞活力測定 將軟骨細胞以每孔8×103個細胞的密度接種到96孔板中，進行不同的處理，并培養(yǎng)6、12、24、48或72 h。細胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(Dojindo分子技術公司)法用于測量細胞活力。向每個孔中添加20 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)將細胞在37 ℃下培養(yǎng)4 h。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，并繪制生長曲線。

1.5 糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)檢測 將處理過的軟骨細胞更換10% FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)細胞10 h，抽取上清液，使用大鼠GAG的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒(EIAab公司)進行檢測，并使用酶標儀(瑞士Tecan)在450 nm處測量吸光度，計算出樣品濃度。

1.6 免疫熒光檢測 將處理過的軟骨細胞使用4%的多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后加入牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)稀釋的Col2a1一抗(Proteintech公司)，37 ℃下孵育2 h后，加入山羊抗兔紅色熒光二抗(Abcam公司)，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細胞核后，加入抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下進行拍照。

1.7 軟骨細胞mRNA的檢測 進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測DMP-1、Sox9、Acan、Col2a1的基因表達水平。提取細胞中總RNA。使用逆轉錄試劑盒(Takara)將RNA反轉錄為cDNA。使用2×Greenstar qPCR Master Mix(Vazyme)進行RT-PCR。根據(jù)結果計算基因表達。

1.8 ELISA分析 根據(jù)制造商的說明，使用特定的ELISA試劑盒(R&D Systems)，收集經(jīng)過不同處理的軟骨細胞培養(yǎng)基，檢測炎性細胞因子(IL-6和TNF-α)的水平。使用酶標儀(瑞士Tecan)測量450 nm處的吸光度。

1.9 蛋白質印跡法(western blot，WB) WB用于定量分析DMP-1、Sox9、Acan、Col2a1。提取總蛋白，使用蛋白質定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)檢測蛋白質的濃度。將每組總共50μg蛋白質滴加到10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)凝膠上，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離并轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上(Biosharp Life Sciences)。在室溫下，使用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h。將膜與一抗在4℃下孵育過夜，然后與二抗共同孵育1h。最后進行顯色檢測相應目的蛋白的表達情況。

1.10 活細胞/死細胞雙染(Calcein-AM/PI)染色 提前配制Calcein-AM/PI染色工作液，用PBS洗滌處理過的細胞，每孔中加入200 μL染色工作液，在室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌細胞后，熒光顯微鏡檢測染色結果。

2 結 果

2.1 體內(nèi)和體外OA模型的軟骨細胞中DMP-1表達 使用微陣列分析在OA的體內(nèi)模型中檢測軟骨細胞中DMP-1的表達，與對照組相比，8周OA體內(nèi)模型中DMP-1表達明顯降低(P<0.05；見圖1a～b)，表明DMP-1的下調可能與OA的嚴重程度有關。IL-1β處理用于建立體外OA模型，RT-qPCR(見圖1c)和WB(見圖1d)檢測DMP-1表達，結果IL-1β處理后軟骨細胞中的DMP-1表達明顯降低。這些結果表明，在OA中軟骨細胞中的DMP-1表達降低。

a 8周OA和對照組差異性基因表達火山圖 b DMP-1在OA組和對照組基因表達差異 c 體外OA模型DMP-1的mRNA的表達 d 體外OA模型DMP-1蛋白的表達

2.2 DMP-1可提高IL-1β處理后的軟骨細胞活力 為了觀察DMP-1對IL-1β處理后的軟骨細胞的作用，使用了DMP-1過表達質粒轉染軟骨細胞。在過表達DMP-1質粒轉染后，經(jīng)過DMP-1處理的軟骨細胞中DMP-1的mRNA和蛋白表達均顯著增加，而陰性對照組質粒對DMP-1表達沒有顯著影響(見圖2a～c)。CCK-8分析用于評估細胞的生存能力，結果表明DMP-1+pcDNA陰性對照組質粒和對未轉染質粒軟骨細胞的生長速度沒有顯著區(qū)別。但是，DMP-1的過表達增加了用IL-1β處理的軟骨細胞的生長速度(見圖2d)。

2.3 DMP-1減輕IL-1β誘導的軟骨細胞變性 軟骨細胞的變性主要表現(xiàn)為GAG水平降低和軟骨特異性基因(包括Col2a1、Sox9和Acan)的表達降低。而且，ELISA檢測表明與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中GAGs水平增加(見圖3a)。細胞免疫熒光染色也表明，與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中Col2a1的表達增加(見圖3b)。另外，軟骨特異性基因的表達與上述結果一致。與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中Sox9、Acan和Col2a1(見圖4a)mRNA的表達水平均增加，還評估了Sox9、Acan、Col2a1的蛋白質表達水平也同時上調(見圖4b)。結果表明，DMP-1的過表達減輕了IL-1β誘導的軟骨細胞變性。

a 未經(jīng)IL-1β處理的軟骨細胞轉染DMP-1后mRNA表達水平 b 經(jīng)過IL-1β處理的軟骨細胞轉染DMP-1后mRNA表達水平 c 經(jīng)過IL-1β處理的軟骨細胞轉染DMP-1后的蛋白表達水平 d 轉染DMP-1后不同條件下軟骨細胞生長速度比較

a 不同條件下軟骨細胞分泌的GAG定量分析 b 不同條件下軟骨細胞Col2a1免疫熒光表達情況(免疫熒光，×400)

a 不同處理條件下軟骨細胞Sox9、Acan、Col2a1 mRNA的表達

b 不同處理條件下軟骨細胞Sox9、Acan、Col2a1蛋白的表達

2.4 DMP-1減少IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥 檢測DMP-1對軟骨細胞炎癥的影響。ELISA法顯示，與IL-1β組相比，IL-1β+DMP-1組中OA中關鍵炎癥因子(如IL-6和TNF-α)的含量均降低(見圖5a)。此外，IL-1β+DMP-1組中細胞的凋亡率低于IL-1β組(見圖5b～c)。結果表明，DMP-1的過表達減輕了用IL-1β刺激處理的軟骨細胞的炎癥和凋亡。

a 不同處理條件下IL-6、TNF-α表達水平 b Calcein-AM/PI染色檢測細胞活力(免疫熒光，×200)

c 不同組軟骨細胞凋亡率

3 討 論

OA是關節(jié)最常見的疾病，其特征是關節(jié)軟骨受損。關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和軟骨基質組成。軟骨細胞的主要功能是分泌ECM蛋白，例如Acan和Col2a1，以維持關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)[12]。軟骨細胞功能的改變伴隨著軟骨基質的變性，并最終導致OA的發(fā)生和發(fā)展。保護或拯救軟骨細胞的功能可有助于減輕OA的進展[13]。盡管有研究報道了OA軟骨細胞潛在靶點和機制，但由于缺乏敏感性和特異性，因此探索OA軟骨細胞新的靶點及發(fā)病機制顯得刻不容緩。本研究發(fā)現(xiàn)DMP-1在OA軟骨細胞中下調，DMP-1的過度表達減輕了IL-1β誘導的軟骨細胞變性、炎癥、細胞凋亡。因此，突出了DMP-1對OA軟骨細胞的潛在作用，結果表明DMP-1可能是有治療前景的OA新靶點。細胞外基質蛋白對軟骨發(fā)育有重要調控作用。有研究表明DMP-1是軟骨發(fā)育過程中特異性表達的基質蛋白，在DMP-1轉基因小鼠的關節(jié)軟骨層增厚，其軟骨細胞數(shù)量增加，Sox9、Col Ⅱ、Col X、Acan等軟骨細胞分化相關基因表達上調[14]。有學者研究表明，在OA患者的膝關節(jié)樣本中觀察到了DMP-1蛋白的分級特異性抑制，在半月板切除術誘導的OA模型中，Mankin評分的增加伴隨著DMP-1表達的逐漸減少，DMP-1可能在維持軟骨生成表型中發(fā)揮重要作用，并可能參與骨關節(jié)炎等疾病條件下軟骨基質重構和降解的改變[15-16]。另外有學者研究DMP-1可通過降低氧化應激和抑制轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β信號通路激活來減緩大鼠糖尿病腎病損傷的病理過程，保護腎臟[16]。

在本研究中，DMP-1在OA的軟骨細胞中表達降低，這表明DMP-1參與了OA的發(fā)病。在正常情況下軟骨基質的合成和分解處于一個動態(tài)平衡中，轉錄因子Sox9是維持軟骨細胞表型的重要分子，能激活一系列下游信號分子，以促進Col2a1、Acan和GAG的沉積[17]。在OA患者中有許多炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α可以抑制Sox9的表達并降低軟骨的細胞外基質[18]。所以降低炎癥水平和恢復軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)是延緩OA進展的重要措施。本研究中用IL-1β處理的軟骨細胞，觀察到炎癥刺激降低了GAG的水平，而DMP-1的過表達恢復了GAG的沉積。DMP-1的過表達降低了IL-1β對軟骨細胞中Sox9、Acan和Col2a1表達的抑制作用。此外，DMP-1過表達可以減輕IL-6和TNF-α的水平，同時抑制IL-1β處理的軟骨細胞的凋亡。這些結果表明，DMP-1對軟骨細胞穩(wěn)態(tài)、炎癥和細胞凋亡均具有保護作用。

綜上所述，DMP-1在OA中表達降低，并且與OA的進展有關。本研究發(fā)現(xiàn)DMP-1參與了軟骨細胞的動態(tài)平衡，DMP-1的過表達恢復了OA中軟骨細胞的表型、減輕了炎癥和細胞凋亡。因此，DMP-1可能是OA研究和治療中的潛在重要靶點。