李玉豪，余周源，佟·烏日娜，廖明莉，國鈺環(huán)，魏淑紅，楊在君，彭正松

(1.西華師范大學生命科學學院，四川南充 637009； 2.西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，四川南充 637009； 3.西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川西昌 615013)

小麥是全球最重要的糧食作物之一[1-2]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，2020年全世界小麥種植面積約2.33億hm2，總產(chǎn)量7.77億t(http://www.amis-outlook.org/#jfmulticontent_c363419-2)。然而由于人口的激增，預計到2060年，小麥產(chǎn)量需增加70%方能滿足人類的消費需求[3]。因此，高產(chǎn)育種仍然是小麥育種的主要目標。在長期的進化演變過程中，由于人工選擇和自然進化，導致小麥的遺傳多樣性日趨狹窄，遺傳脆弱性逐漸增加[4]。創(chuàng)制新的小麥突變體不僅有利于拓寬小麥育種材料的遺傳基礎，而且為小麥基因功能研究提供材料。

在自然條件下，生物突變的概率很低，而人工誘導的突變率相對較高。人工誘導突變可分為物理誘變、化學誘變、生物誘變等。物理誘變是通過紫外線、射線、離子束等方法使基因發(fā)生突變，其突變具有染色體畸變頻率高、結構變異廣、染色體組紊亂、后代不育率高、分離類型廣、純合世代長等特點[4]。生物誘變是通過T-DNA和轉座子插入實現(xiàn)基因突變[5]。但小麥是異源六倍體植物，基因組較大，T-DNA插入后突變體的鑒定工作量大，因此獲得優(yōu)良的突變資源相對困難[6]。而化學誘變劑則能夠使植物體產(chǎn)生可遺傳變異，其中甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)的應用最為廣泛，且誘導效果較好。利用EMS構建突變體庫有不需要遺傳轉化、容易誘發(fā)形成點突變、不易造成染色體畸變等優(yōu)點[7]。

EMS誘變在小麥遺傳育種中已得到了廣泛的應用，為小麥品質育種提供了優(yōu)質的種質資源。趙天祥等[8]利用EMS誘導六倍體小麥偃展4110種子，獲得了在自然變異中少見的的特矮變異類型(株高僅10～15 cm)。孫玉龍等[9]通過EMS誘導小麥盛農(nóng)1號，從4 500個M2代中篩選出174個突變體株系，經(jīng)過M3代驗證及生物學性狀和農(nóng)藝性狀調(diào)查，獲得了18個可穩(wěn)定遺傳的株系。于利偉等[10]以小麥西昌69的EMS誘變系M6代為試驗材料，進行HMW-GS分析，獲得了101份HMW-GS變異誘變系，其中28份誘變系的多個籽粒品質性狀及不溶性蛋白聚合體含量優(yōu)于親本，且千粒重相對穩(wěn)定。

利用EMS誘變六倍體小麥構建突變體庫已有不少研究報道，但小麥的基因組非常龐大，構建的突變體庫還沒有達到飽和[11]，尤其是利用EMS誘導雄蕊和雌蕊突變體尚未見研究報道。“三粒小麥”最早由陳濟世等[12]發(fā)現(xiàn)，但其親本不能確定。Peng等[13]對三粒小麥進行了多年選育，培育出能穩(wěn)定遺傳、遺傳背景清楚(三雌蕊性狀由一對顯性核基因控制)的三雌蕊小麥(TP)種子。TP具有正常的雄蕊和三個可育的雌蕊，可結3粒種子，具有穗粒數(shù)多、稃片開張、角度大等特點[14]。本研究通過對TP進行EMS誘變處理，獲得能夠穩(wěn)定遺傳的雌、雄蕊突變體，并對其進行SSR分析和農(nóng)藝性狀分析，以期獲得與TP具有顯著差異的突變體，為小麥三雌蕊性狀基因的克隆和基因功能驗證奠定基礎，同時也為小麥花發(fā)育研究和雜交育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 TP種子的EMS誘變處理

挑選飽滿的TP種子6 300粒，100粒為一組。利用pH =7.0的磷酸緩沖液配制濃度分別為0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的EMS溶液，在室溫下(25 ℃左右)對TP種子進行浸泡處理，每個濃度分別處理3、5和8 h，設置3個重復[11,15]。TP種子經(jīng)EMS溶液處理后，用無菌水沖洗15 min。將濾紙平鋪于培養(yǎng)皿中，用清水浸潤，將每份種子平鋪于培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿上標記處理時間及濃度。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)催芽，統(tǒng)計發(fā)芽率；利用半致死EMS濃度及處理時間處理5 000粒飽滿的TP種子。將EMS處理后的種子以及對照種子(未經(jīng)EMS處理)種植于西華師范大學生命科學學院試驗田中，行長1 m，行距20 cm，株距10 cm，常規(guī)田間水肥管理。M1代植株嚴格套袋自交，成熟后每株取1粒種子，形成M2代單粒傳群體。M2代種植條件同上，套袋自交后每株取1粒種子，形成M3代單粒傳群體。

1.2 農(nóng)藝性狀測定

于小麥灌漿期前后，測定M3代突變株系的農(nóng)藝性狀，各株系隨機選擇10個單株進行測定，取平均值進行分析。測定的農(nóng)藝性狀包括株高、穗長、穗下節(jié)間長、旗葉長、旗葉寬、倒二葉長、倒二葉寬、小穗數(shù)和穗粒數(shù)。

1.3 SSR分析

使用GENEOUTTM植物DNA提取試劑盒(LABGENE，中國)提取M3代突變體植株和對照TP葉片的DNA。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用NANODROP 2000c微型紫外-可見分光光度計(Thermo，美國)檢測DNA的濃度和純度。

普通小麥含有A、B、D三個染色體組，每個染色體組有7條染色體，為了檢查誘變植株的多態(tài)性，分別在每條染色體上隨機挑選5個微衛(wèi)星標記(SSR)設計引物，引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。SSR的PCR擴增體系為10 μL，包括模板DNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，2×PCR Taq Master Mix 5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，50～61 ℃(根據(jù)不同的引物設置不同的退火溫度)退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。在正式試驗前，用TP的葉片DNA對105個SSR標記進行了篩選，篩選出22個條帶清晰、重復性好的標記對突變體進行檢測(表1)。

表1 SSR引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of SSR markers

用毛細管電泳系統(tǒng)(capillary electrophoresis，CE)對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。PCR擴增出的條帶按有或無記錄，有擴增帶時記為1，無擴增帶記作0，將所有引物擴增條帶的結果統(tǒng)計為0和1的矩陣[16]。不同材料之間的遺傳相似系數(shù)(GS)按Nei等[17]的方法進行計算，公式為GS=2Nij/(Ni+Nj)。其中Ni和Nj為2份材料獨有的條帶數(shù)，Nij為2份材料共有的條帶數(shù)。利用NTSYSpc 2.10e聚類分析軟件來計算各個突變體之間的遺傳相似系數(shù)，在獲得矩陣數(shù)據(jù)之后再對20個突變株系和對照TP通過非加權配對算術平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 EMS對TP種子發(fā)芽率的影響

從表2可以看出，未經(jīng)EMS處理的TP種子，在不同處理時間其發(fā)芽率均大于90%。隨著EMS濃度的升高以及處理時間的延長，種子發(fā)芽率逐漸降低。當EMS濃度為1.2%或1.5%、處理時間為8 h時，種子全部死亡。EMS的半致死濃度和處理時間為0.8%的EMS處理8 h。后續(xù)TP種子的誘變處理則選用該半致死條件進行。

表2 不同EMS濃度及處理時間對TP種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effect of different EMS concentrations and treatment time on germination rate of TP seeds %

2.2 突變體類型及突變頻率調(diào)查結果

經(jīng)EMS浸泡的5 000粒種子共長出2 740個M1植株，在其M2單傳群體中共發(fā)現(xiàn)39個突變植株，突變率為1.42%。其中，三雌蕊性狀回復成單雌蕊性狀(single pistil，SP)的有22個植株，占所有突變植株的56.4%；雄蕊同源突變成雌蕊(pistillody，PI)的有6個植株，占所有突變植株的15.3%。其他突變類型包括發(fā)育不良(1株)、分蘗減少(1株)、矮化(2株)、發(fā)育遲緩(2株)、穗長變長(1株)、穗形尖銳(1株)、麥芒變長(1株)、穗殼蟹爪狀對鉤(1株)和葉片卷曲(1株)。

本研究主要分析22個SP株系和6個PI株系。由于部分突變植株自交結實率低，在M3代中能穩(wěn)定遺傳的SP株系和PI株系分別有15(SP1～SP15)和5個(PI1～PI5)。后續(xù)均基于這20個株系進行分析。SP株系表現(xiàn)為一個雌蕊，三個雄蕊，如圖1中的SP7。PI株系表現(xiàn)為雄蕊數(shù)量減少，雌蕊數(shù)量增加，如PI2有四個雌蕊，無雄蕊；PI5有五個雌蕊，一個雄蕊(圖1)。

TP：三雌蕊小麥；PI1～PI5：雄蕊同源轉化為雌蕊突變體；SP7：單雌蕊突變體。

2.3 M3代突變株系的農(nóng)藝性狀

對M3代中的15個SP株系和5個PI株系以及對照TP的主要農(nóng)藝性狀進行調(diào)查和分析，結果如表3所示。所有SP株系和PI株系的穗粒數(shù)均極顯著降低。大部分SP株系的株高未出現(xiàn)明顯變化，只有SP4、SP11和SP13株系的株高顯著升高；SP7株系的株高顯著下降，出現(xiàn)了明顯的植株矮化現(xiàn)象，與TP相比，株高平均降低 38.27%；PI株系中，PI1株系的株高顯著降低，PI4株系的株高顯著提高。此外，與TP相比，SP4、SP6和PI4株系的穗下節(jié)間長顯著或極顯著伸長，SP7、SP8、SP12、SP14、SP15、PI1、PI2和PI5株系的穗下節(jié)間長顯著或極顯著變短；大部分SP株系和PI株系的旗葉長和旗葉寬均顯著或極顯著降低(除SP5和PI5株系的旗葉寬與TP差異不顯著)；SP2和SP7株系的倒二葉長顯著增加，SP3、SP4、SP10、SP12、SP13、PI1、PI2和PI4株系的倒二葉長顯著降低；除SP2、SP5、SP6和PI2株系外，其他株系的倒二葉寬均顯著降低(表3)。

表3 M3代突變體株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 3 Agronomic traits of M3 mutant lines

2.4 M3代突變株系的SSR標記分析

2.4.1 M3代突變體DNA的提取結果

各突變體的DNA濃度均在50～200 ng·μL-1之間，且OD260/OD280在1.8～1.9之間。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，DNA條帶單一、清楚、無明顯的降解。這說明所提取的DNA質量較高，可用于后續(xù)分析。

2.4.2 SSR標記的多態(tài)性

部分SSR標記的擴增結果如圖2所示。可以看出，22個標記共擴增出61個條帶(等位基因位點)，每個標記可擴增出1～7個等位基因，共含有42條多態(tài)性條帶，多態(tài)性率達68.85%。平均每個標記擴增出2.77個等位基因。其中，2B染色體上的標記Xgwm257-2B擴增的條帶數(shù)最多，為7個。22個標記中有4個標記的擴增條帶只有1個，分別是Xgwm136-1A、Xgwm403-1B、 Xgpw3238-4A和Xgwm66-4B。這些數(shù)據(jù)表明，SSR標記可用于EMS誘變后突變體遺傳多樣性的檢測。

圖2 SSR標記Xgwm257-2B的擴增結果

2.4.3 突變株系間的遺傳相似性系數(shù)

20個突變株系與TP對照之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.352 9～0.956 5之間。說明20個小麥突變株系在SSR基因座上具有較高的遺傳多樣性，這些突變體具有豐富的遺傳基礎。

使用UPGMA法進行聚類分析，結果(圖3)表明，樣本可以被SSR標記相互區(qū)分。當遺傳相似系數(shù)為0.61時，21份材料(20個突變株系和TP對照)被分為兩大類。其中第Ⅰ大類包含14份材料，除TP和PI1外，大部分SP株系被劃分到第一類，同時第一大類又被分為兩個亞類，分別為Ⅰ-1和Ⅰ-2，而Ⅰ-2亞類全部為SP株系。第Ⅱ大類包含剩下的7個突變株系，包括3個SP株系(SP2、SP14和SP15)，4個PI株系(PI2～PI5)。雖然這7個突變株系的農(nóng)藝性狀差異較大(表3)，但聚類分析結果表明這7個突變株系在DNA水平上具有一定的相似性。

圖3 TP與M3代突變株系UPGMA聚類圖

3 討 論

3.1 EMS誘變對種子發(fā)芽率的影響

EMS誘變發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)和編碼區(qū)，主要引發(fā)G/C突變成A/T或A/T突變成G/C，引起錯義突變、無義突變或更罕見的移碼突變，導致基因表達量、mRNA穩(wěn)定性以及蛋白質結構發(fā)生改變[18]。EMS誘變已成功應用于燕麥[19]、大麥[20]、玉米[21]、小麥[22-23]等多種作物，可用于篩選耐鹽、抗病、抗倒伏等突變體，亦可從中直接篩選出感興趣的突變基因。

研究表明，適宜的誘變濃度和誘變時間是提高EMS誘變率的關鍵[24]，一般以誘變后植株存活50%所需的EMS濃度(半致死劑量)作為誘變敏感性指標[25]。本研究利用不同濃度的EMS溶液(0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%和 1.5%)和浸泡時間(3、5、和8 h)處理小麥種子，結果表明，濃度為0.8%的EMS溶液處理TP種子8 h時接近半致死劑量。當濃度過高，時間過長時，EMS會對種子產(chǎn)生嚴重損傷，種子發(fā)芽率出現(xiàn)明顯下降，當EMS濃度達到1.2%或1.5%，且處理時間為8 h時，種子的發(fā)芽率為0。當EMS濃度上升到一定程度時，突變率不會隨著濃度增加而增加，反而可能因為植株大量死亡出現(xiàn)突變率下降的情況。

3.2 EMS誘變類型與頻率

本研究從2 740個誘變植株中，共發(fā)現(xiàn)39個表型發(fā)生明顯變異的突變體，突變頻率為 1.42%。低于前人研究的突變頻率(9.17%[26]、 6.6%[8]和3.87%[9])，原因可能是除了品種和遺傳背景差異外，本研究用EMS誘導的小麥很大一部分突變是非表型突變或大部分植株為雜合體，而導致突變性狀未被統(tǒng)計。因此，想要獲得更多的突變體，應該在M3及以上世代中進行篩選。有些突變體性狀(例如植株高度、成熟快慢等)除受遺傳因素影響外，很大程度上也受環(huán)境以及出現(xiàn)雄性不育情況的影響，這也是本研究在M2代中發(fā)現(xiàn)有28個雌蕊和雄蕊突變植株，但在M3代中能穩(wěn)定遺傳的只有20個株系的原因。

3.3 SSR標記分析

由于SSR標記在小麥中的多態(tài)性高且具有染色體特異性[27-28]，能夠克服RFLP、RAPD等標記的不足，所以在小麥中的應用越來越廣泛[29]。本研究從105個標記中挑選出了22個條帶清晰、重復性好的標記，對包括TP在內(nèi)的21份材料(20個M3變異株和TP對照)進行SSR分析和聚類分析。聚類結果表明，不同突變性狀之間可以較好地被區(qū)分開，相同突變性狀可以被較好地聚在同一簇下，說明即使只使用相對較少的SSR標記，也可以檢測小麥種質資源間的遺傳多樣性，這和Plaschke等[30]的研究結果一致。

研究表明，從20世紀90年代開始，中國小麥的多樣性指數(shù)和遺傳距離有所下降，原因可能是缺少新的突破性育種親本，以及大量使用一些相同骨干親本所導致[29,31]。本研究SSR分析結果表明，誘變植株的遺傳距離及遺傳多樣性相對豐富，在缺少育種親本的情況下，誘變育種是一個較好的增加遺傳多樣性的方法。

3.4 M3代突變株系的農(nóng)藝性狀分析

本研究通過EMS誘變TP構建了EMS突變體庫。從M3代中獲得了20個農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯變異的SP和PI株系。從突變體的雌雄蕊表型可以看出，這些突變體與對照TP具有明顯差異，這對研究小麥花發(fā)育奠定了基礎。其中，SP和PI株系均發(fā)生了花器官改變，SP株系是由三雌蕊回復突變?yōu)閱未迫?，PI株系是由雄蕊同源突變?yōu)榇迫?，兩種突變類型的產(chǎn)量均明顯低于TP，尤其在PI株系中，出現(xiàn)了不育現(xiàn)象，但是創(chuàng)制出了與TP的三雌蕊性狀具有顯著差異的對照材料，為后續(xù)小麥雄蕊和雌蕊發(fā)育機制研究提供了理想的試驗材料。雖然大部分誘導植株的突變方向不好，但在本試驗中，出現(xiàn)了個別相對優(yōu)良的性狀，如SP7株系的平均株高比對照TP下降了38.27%，平均株高僅為67.10 cm。前人發(fā)現(xiàn)控制小麥株高的基因有20余個，其中只有5個是自然突變，其余均為誘導突變[8]，SP7植株矮化可能與上述某個基因有關，也可能與新的突變基因有關，但還需要進一步深入研究。