梁佳文，魏鐵鎖，樊曉培，蒼 晶，張 達(dá)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

小麥?zhǔn)侨澜绶N植面積最大的糧食作物之一，低溫作為主要的非生物脅迫因子，限制小麥的種植范圍和產(chǎn)量。植物對低溫的應(yīng)答是一個(gè)涉及多基因、多信號途徑的復(fù)雜過程[1]。茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物體內(nèi)普遍存在的一類氧化脂類化合物，可調(diào)節(jié)植物發(fā)育和生物與非生物脅迫響應(yīng)過程[2]，誘導(dǎo)植物抗寒基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗寒性[3]。JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心模塊是COI1/JAZ/MYC2復(fù)合體[4]，轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ蛋白、MYC2轉(zhuǎn)錄因子和E3泛素連接酶SCFCOI1等相互作用，共同參與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[5]。

JAZ是一類阻遏蛋白，參與多個(gè)信號通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)JA應(yīng)答，在植物防御、生長發(fā)育、葉片衰老等方面發(fā)揮重要作用[6]。在JA濃度較低時(shí)，JAZ蛋白與轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2結(jié)合，通過抑制MYC2的活性來抑制JA早期應(yīng)答基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物內(nèi)源JA的合成與積累；高濃度的JA促使JAZ蛋白與SCFCOI1受體復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致JAZ蛋白被泛素化，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，從而解除JAZ蛋白對MYC2的轉(zhuǎn)錄抑制，激活JA早期應(yīng)答基因的表達(dá)[6]。

ICE-CBF-COR途徑是高等植物體內(nèi)主要的抗寒途徑。ICE1是ICE-CBF-COR通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，ICE1結(jié)合CBF3基因啟動子的MYC結(jié)合位點(diǎn)(CANNTG)，并在冷處理下激活CBF3基因的表達(dá)[7]。在擬南芥中，AtJAZ1、AtJAZ4與AtICE1蛋白互作，抑制AtICE1基因的轉(zhuǎn)錄；且過表達(dá)AtJAZ1或AtJAZ4基因的擬南芥抗凍性均降低，說明AtJAZ1、AtJAZ4蛋白負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的抗凍性[4]。然而JAZ蛋白是否參與調(diào)控小麥的抗寒性尚未見報(bào)道。小麥中已經(jīng)分離鑒定出14個(gè)JAZ基因，其中，TaJAZ7與AtJAZ1、TaJAZ12與AtJAZ4有較高的同源性[8]。小麥TaICE41是擬南芥AtICE1基因的同源基因[9]。趙 虎等[10]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯(MeJA)提高了東農(nóng)冬麥1號(Dn1)的抗寒性，TaMYC2基因正調(diào)控Dn1的抗寒性；樊曉培等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MeJA處理提高了低溫脅迫下Dn1中冷響應(yīng)基因TaWcor14、TaWcor15、TaWcor18、TaWcor413和TaICE41的表達(dá)量。為進(jìn)一步探究JAZ蛋白在冬小麥抗寒中的作用，本研究檢測低溫脅迫下外源MeJA對TaJAZ7和TaJAZ12基因在Dn1中表達(dá)模式的影響，并對低溫脅迫下響應(yīng)程度較為明顯的TaJAZ7(以TaJAZ7D為例)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，同時(shí)采用酵母雙雜技術(shù)對TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白之間的互作進(jìn)行初步分析，以期為解析JA在調(diào)控冬小麥抗寒性的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(Dn1，可耐-30～-35 ℃)，返青率大于85%，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥?zhǔn)姨峁?。?018年9月8日將材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)地，完全區(qū)組設(shè)計(jì)，共10行區(qū)，小區(qū)行長約2 m，行距 0.2 m。每行播種150粒，播深5 cm，田間常規(guī)管理。于小麥三葉期(2018年9月24日)，用1 mmol·L-1的MeJA噴施小麥葉片，以噴施等量蒸餾水為對照。待大田自然降溫、連續(xù)10 d平均最低溫度分別為5 ℃(2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月2日)、-10 ℃(2018年11月24日)和-25 ℃(2019年1月14日)時(shí)，取長勢一致的麥苗，蒸餾水洗凈，將分蘗節(jié)和葉片剪成0.5 cm小段，錫箔紙分別包裝，液氮速凍后，置于 -80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用Trizol法提取冬小麥分蘗節(jié)和葉片總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金，北京)合成cDNA第一條鏈。用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)TaJAZ7(TraesCS4D02G295900.1)和TaJAZ12(TraesCS6D02G274700.1)基因的qRT-PCR特異引物，以小麥TaActin為內(nèi)參基因，引物序列見表1。按照TransStart TOP Green qPCR SuperMix試劑盒說明書(全式金，北京)的反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，操作系統(tǒng)為Mx3000p Real-Time PCR Systerm(Stratagene，美國)。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，40個(gè)循環(huán)；94 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s， 94 ℃變性15 s。反應(yīng)結(jié)束后，觀察曲線峰值是否單一以驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。采取2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，3次生物學(xué)重復(fù)，采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與顯著性分析。

1.2.2 TaJAZ7D蛋白的生物信息學(xué)分析

用在線軟件ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析TaJAZ7D蛋白的理化性質(zhì)；用在線工具NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測TaJAZ7D蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[12]；用在線程序ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測TaJAZ7D蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū)；用MEGA 7.0的鄰接法(neighbor-Joining)對TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)[13]和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[14]預(yù)測TaJAZ7D蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 TaJAZ7D蛋白的亞細(xì)胞定位

采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP-F/R引物(表1)，以TaJAZ7D基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對pCAMBIA2300-EGFP載體進(jìn)行酶切，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物回收純化后，用一步克隆試劑盒(諾唯贊，南京)進(jìn)行同源重組并轉(zhuǎn)化將期至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，然后送庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的重組載體pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP、空載體pCAMBIA2300-EGFP(對照)分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，挑取陽性單克隆， 28 ℃震蕩培養(yǎng)(220 r·min-1)12 h后離心收集菌體，用適量緩沖液(100μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸和10 mmol·L-1氯化鎂的懸浮液)重懸菌體，調(diào)整菌液濃度使其OD600=0.6～0.8，黑暗靜置4～6 h，然后將菌液注射至4周苗齡且長勢一致的本氏煙草葉片中，將注射過的煙草黑暗放置24 h后，弱光下培養(yǎng) 24 h，然后正常光照培養(yǎng)24 h。取干凈的載玻片，在載玻片上滴加幾滴4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液，用鑷子撕取注射過的煙草表皮葉片，放在DAPI染液中展平，蓋好蓋玻片，避光染色10 min。然后用蒸餾水沖去染液，濾紙吸除多余水分，利用正置熒光顯微鏡(OLYMPUS BX53)觀察細(xì)胞熒光定位情況。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 酵母雙雜交試驗(yàn)(驗(yàn)證蛋白互作)

在Ensemble Plant在線網(wǎng)站獲得TaJAZ7D(Traes CS4D02G295900.1)、TaMYC2(Traes CS1D02G 196900)和TaICE41(Traes CS3A02G442200)基因的編碼區(qū)序列，用Primer premier 6.0設(shè)計(jì)引物(表1)。分別以提取的 -10 ℃和-25 ℃時(shí)的分蘗節(jié)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠回收試劑盒(全式金，北京)進(jìn)行目的條帶回收，并連接至pClone007 載體，將得到的重組載體pClone007-TaJAZ7D、pClone007-TaMYC2、pClone007-TaICE41轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌送測序。使用DNAMAN 6.0軟件比對測序結(jié)果，若序列一致，表明這三個(gè)基因已成功被克隆，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

挑取酵母菌株AH109劃線于YPDA平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右，挑取單克隆酵母制備酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞。用EcoRⅠ分別酶切載體pGBKT7和pGADT7，按照Clon ExpressII One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊，南京)說明書將TaJAZ7D、TaMYC2、TaICE41基因分別與pGBKT7和pGADT7載體連接，然后轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109中，點(diǎn)涂于二缺培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。待二缺培養(yǎng)基上長出適當(dāng)大小的菌落后，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，然后點(diǎn)涂在三缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu和四缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu-Ade上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。同時(shí)設(shè)pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照，根據(jù)菌斑生長情況檢測轉(zhuǎn)錄自激活活性及其互作關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MeJA對低溫脅迫下冬小麥 TaJAZ7、 TaJAZ12基因表達(dá)模式的影響

對小麥TaJAZ7、TaJAZ12蛋白與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn) TaJAZ7蛋白與AtJAZ1蛋白聚為一個(gè)分支，同源性為100%； TaJAZ12蛋白與AtJAZ4蛋白也高度同源。因此，對低溫脅迫下冬小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因的表達(dá)模式進(jìn)行檢測，結(jié)果(表2)表明，Dn1分蘗節(jié)中，TaJAZ7基因的相對表達(dá)量隨著溫度的降低表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在-25 ℃，最小值出現(xiàn)在-10 ℃；TaJAZ12基因的相對表達(dá)量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在0 ℃，最小值出現(xiàn)在 -25 ℃。外源MeJA處理降低了Dn1分蘗節(jié)中TaJAZ7和TaJAZ12基因的相對表達(dá)量(5 ℃時(shí)TaJAZ12基因的表達(dá)量除外)，TaJAZ7基因的相對表達(dá)量隨著溫度的降低而降低，最大值出現(xiàn)在5 ℃，最小值出現(xiàn)在 -25 ℃；TaJAZ12基因的相對表達(dá)量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在 5 ℃，最小值出現(xiàn)在0 ℃。

表2 外源MeJA對低溫脅迫下Dn1分蘗節(jié)及葉片中 TaJAZ7、 TaJAZ12基因相對表達(dá)量的影響Table 2 Effect of MeJA on the relative expression level of TaJAZ7 and TaJAZ12 genes in Dn1 tillers and leaves under low temperature

Dn1葉片中，TaJAZ7基因的相對表達(dá)量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢，TaJAZ12基因的相對表達(dá)量表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢，最大值均出現(xiàn)在-25 ℃，最小值均出現(xiàn)在-10 ℃。外源MeJA處理降低了TaJAZ7基因在-10 ℃和-25 ℃時(shí)的相對表達(dá)量以及TaJAZ12基因在0 ℃時(shí)的相對表達(dá)量。定量分析發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理下Dn1葉片中TaJAZ7基因的表達(dá)量隨溫度降低呈明顯負(fù)相關(guān)。因此，本研究選取TaJAZ7蛋白做后續(xù)分子機(jī)制研究。

2.2 TaJAZ7D蛋白的生物信息學(xué)

2.2.1 TaJAZ7蛋白的結(jié)構(gòu)域

蛋白序列進(jìn)化樹分析表明，TaJAZ7A蛋白與TaJAZ7D蛋白的同源性為100%， TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白均具有JAZ家族典型的TIFY和CCT_2結(jié)構(gòu)域，但所處的位置均不同，屬于TIFY轉(zhuǎn)錄因子超家族(圖1)。本研究以TaJAZ7D蛋白為研究對象進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 TaJAZ7蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

2.2.2 TaJAZ7D蛋白的理化性質(zhì)

序列分析結(jié)果表明，TaJAZ7D基因編碼區(qū)全長為633 bp，可編碼210個(gè)氨基酸。TaJAZ7D蛋白的相對分子量為21635.51Da，等電點(diǎn)(pI)為7.73，分子式為C946H1493N281O284S9，為弱堿性蛋白，屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白。

2.2.3 TaJAZ7D蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)

用SOPMA對TaJAZ7D蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果(圖2)顯示，TaJAZ7D蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種成分組成,分別占總蛋白的27.62%、14.29%、 6.67%和51.43%。預(yù)測結(jié)果表明，TaJAZ7D蛋白的二級結(jié)構(gòu)為混合型。用SWISS-MODEL同源建模在線預(yù)測分析TaJAZ7D蛋白的三維模型，結(jié)果(圖2)表明，構(gòu)建模板蛋白為7cvo.1[15]， TaJAZ7D與模板蛋白的氨基酸序列同源性為66.67%，無配體，低聚糖狀態(tài)為異源二聚體，屬于TIFY家族。

圖2 TaJAZ7D蛋白的二級(左)、三級(右)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 TaJAZ7D蛋白的亞細(xì)胞定位

從圖3可見，在綠色熒光通道下，pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP融合蛋白在細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光信號，表明TaJAZ7D蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖3 煙草表皮細(xì)胞中TaJAZ7D蛋白的亞細(xì)胞定位

2.4 目的基因克隆及重組載體構(gòu)建結(jié)果

用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE- 41-F/R引物對目的基因TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41進(jìn)行擴(kuò)增，如圖4所示，PCR擴(kuò)增條帶大小分別為633、2 088和1 152 bp。將目的基因分別連接至pClone007載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中搖培并測序，若測序成功，表明目的基因已成功克隆。然后將目的基因分別連接至pGADT7和pGBKT7載體上，用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE41-F/R引物對目的基因TaJA27D、TaMYC2和TaICE41進(jìn)行驗(yàn)證，如圖5所示，pGBKT7-TaICE41和pGADT7-TaICE41能擴(kuò)增出1 152 bp的條帶，pGBKT7-TaJAZ7D和pGADT7-TaJAZ7D能擴(kuò)增出633 bp的條帶，pGBKT7-TaMYC2和pGADT7-TaMYC2能擴(kuò)增出2 088 bp的條帶，與目的基因條帶大小均一致，表明連接成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41蛋白的體外自激活驗(yàn)證結(jié)果

從圖6可以看出，pGBKT7-53與pGADT7(陽性對照)共轉(zhuǎn)的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上均生長良好。pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7、pGBKT7-TaICE41與pGADT7共轉(zhuǎn)的酵母菌在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上均生長良好，表明外源載體成功轉(zhuǎn)入酵母菌。在SD/-Trp-His-Leu培養(yǎng)基上，pGBKT7-TaJAZ7D能正常生長，而pGBKT7-TaICE41不能生長，pGBKT7-TaMYC2的生長也受到抑制。在SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上，pGBKT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaMYC2和pGBKT7-TaICE41均不能正常生長，表明TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41蛋白在酵母細(xì)胞中無自激活活性。

M:DL5000; 1 and 2:pGBKT7- TaICE41(1 152 bp); 3 and 4:pGADT7- TaICE41(1 152 bp); 5:pGBKT7- TaJAZ7D(633 bp); 6:pGADT7- TaJAZ7D(633 bp);7:pGBKT7-TaMYC2 (2 088 bp); 8:pGADT7- TaMYC2(2 088 bp).

100、10-1、10-2和10-3為4種不同稀釋液濃度的酵母菌液。圖7同。pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照組，pGBKT7-TaJAZ7D+pGADT7、pGBKT7-TaMYC2+pGADT7和pGBKT7-TaICE41+pGADT7為試驗(yàn)組。

2.6 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白互作的酵母雙雜交鑒定結(jié)果

從圖7可以看出，pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaMYC2、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaICE41、pGBKT7-TaICE41與pGADT7-TaJAZ7D共轉(zhuǎn)的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上均能正常生長，說明TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白均存在相互作用。

圖7 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗(yàn)證

3 討 論

研究表明，低溫提高了水稻[16]和擬南芥[4]內(nèi)源JA的水平。JA參與植物CBF抗寒途徑，JA信號和CBF抗寒途徑元件間存在復(fù)雜的互作關(guān)系[17]。JAZ蛋白通過Jas結(jié)構(gòu)域與ICE1和ICE2蛋白的C端結(jié)構(gòu)域相互作用。如在擬南芥中，AtJAZ1和AtJAZ4蛋白通過抑制AtICE1基因的轉(zhuǎn)錄功能進(jìn)而抑制下游AtCBF3基因的表達(dá)[4]，MeJA處理顯著提高了ICE-CBF/DREB1信號因子下游AtCOR基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了擬南芥的抗凍性；而阻斷內(nèi)源JA的合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，則導(dǎo)致植物存活率降低、電導(dǎo)率升高以及對凍害敏感[4]。在香蕉中，MaMYC2s蛋白可通過與MaICE1蛋白互作，激活CBF途徑相關(guān)基因的表達(dá)，而JA作為ICE-CBF/DREB1途徑上游的關(guān)鍵信號因子，可正調(diào)控植物的抗寒性[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，JA提高了Dn1中冷響應(yīng)基因和JA合成基因的表達(dá)量[10-11]，增強(qiáng)了Dn1的抗寒性[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這主要與降低Dn1分蘗節(jié)和葉片中TaJAZ7基因的相對表達(dá)量相關(guān)，且在-10 ℃時(shí)作用最明顯。因?yàn)?10 ℃是Dn1抗寒的重要溫度節(jié)點(diǎn)，分蘗節(jié)是其順利越冬的主要部位[10]，推測JAZ基因表達(dá)量的降低及JAZ蛋白的降解有利于解除對MYC2轉(zhuǎn)錄活性的阻遏，從而激活JA響應(yīng)基因及下游靶基因的表達(dá)。

JAZ蛋白是JA信號從SCFCOI1受體復(fù)合物向下游JA應(yīng)答基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的紐帶[19]。本研究生物信學(xué)分析表明，Dn1中TaJAZ7D蛋白具有典型的TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域，這與前人的報(bào)道結(jié)果一致[17,20]；亞細(xì)胞定位表明， TaJAZ7D蛋白位于細(xì)胞核中，這為與其他蛋白的互作提供了條件。TIFY結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA(NOVEL INTERACTOR OF JAZ，JAZ接頭蛋白)相互作用或與其他JAZ接頭蛋白形成二聚體，共同抑制JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]；而Jas結(jié)構(gòu)域則介導(dǎo)JAZ蛋白直接與JA信號通路上轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制JA應(yīng)答基因的表達(dá)[22]。擬南芥中已分離鑒定出12個(gè)JAZ基因[20]，小麥中已分離鑒定出14個(gè)JAZ基因[8]，本研究進(jìn)化分析表明，小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因分別與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4基因高度同源?；跀M南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白分別與AtICE1、AtICE2蛋白互作可調(diào)控?cái)M南芥的抗寒性[4]，我們推測TaJAZ蛋白可能有類似的功能，而TaJAZ7蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗(yàn)證是首先需要解決的問題。

蛋白與蛋白互作在許多生物進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，酵母雙雜交試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于互作蛋白的研究中。前人研究發(fā)現(xiàn)，JAZ蛋白與轉(zhuǎn)錄因子MYB21和MYB24互作，可特異調(diào)控雄蕊發(fā)育[23]；JAZ1蛋白可與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子TT8、GL3和EGL3以及MYB類轉(zhuǎn)錄因子MYB75和GL1互作，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制毛狀體的發(fā)生和花青素的積累[24]；JAZ1和JAZ4蛋白分別與ICE1和ICE2蛋白互作，可調(diào)節(jié)擬南芥的耐凍性[4]；JAZ4和JAZ8蛋白與WRKY57蛋白互作，可調(diào)節(jié)JA誘導(dǎo)的葉片衰老[25]；JAZ1蛋白與TOE1和TOE2蛋白互作，可調(diào)節(jié)開花時(shí)間[26]；JAZ1、JAZ3和JAZ9蛋白與EIN3/EIL1蛋白互作，可介導(dǎo)JA和乙烯之間的激素串?dāng)_[27]；赤霉素也可通過JAZ蛋白與DELLAs蛋白的互作來調(diào)節(jié)JA信號途徑[28]。小麥TaJAZ1蛋白(AtJAZ3的同源類似物)與TaABI5蛋白互作，通過ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正調(diào)控小麥種子萌發(fā)和ABA響應(yīng)基因的表達(dá)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dn1 中 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白存在互作關(guān)系，推測這3個(gè)蛋白相互作用可調(diào)節(jié)Dn1的抗寒性。后續(xù)還需要結(jié)合雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)、GST pull down等技術(shù)對蛋白互作進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。