程芳，李強(qiáng)，王靜林，張玉 ，黎緯明，曾芳

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022；2.湖北省重大疾病精準(zhǔn)用藥醫(yī)學(xué)研究中心，武漢 430022；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，武漢 430022)

達(dá)沙替尼是靶向于BCR-ABL的第2代酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，臨床主要用于治療對(duì)于伊馬替尼耐藥或不耐受的費(fèi)城染色體陽性的慢性髓細(xì)胞白血病(CML)慢性期、加速期和急變期的成年患者[1]，常見的不良反應(yīng)包括體液潴留(胸腔積液)、皮疹、骨骼疼痛和腹瀉等[2]。

達(dá)沙替尼在連續(xù)給藥28 d后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，達(dá)沙替尼峰濃度(服藥后2 h的血藥濃度，Cmax)與其藥-時(shí)曲線下面積(AUC)密切相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)患者療效[3]。前期研究常選擇測(cè)定谷濃度(C0)和Cmax來預(yù)測(cè)達(dá)沙替尼的治療效果[4]。達(dá)沙替尼血藥濃度具有明顯的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的差異，且與臨床療效密切相關(guān)[5]。研究表明服用同等劑量(100 mg，qd) 達(dá)沙替尼的患者中C0和Cmax的差異較大，在中國(guó)人群中達(dá)沙替尼的體內(nèi)暴露量和半衰期等明顯高于服用同等劑量的歐美人群[6-7]，提示達(dá)沙替尼的藥動(dòng)學(xué)過程可能與基因和種族等因素密切相關(guān)。同時(shí)食物以及合并用藥也會(huì)影響達(dá)沙替尼的血藥濃度[8]。因此服用達(dá)沙替尼治療的患者，建議定期進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測(cè)，對(duì)提高臨床療效和降低其不良反應(yīng)具有重要意義。

根據(jù)歐洲白血病網(wǎng)的建議，應(yīng)在接受TKI治療3，6和12個(gè)月后評(píng)估CML患者的臨床治療效果。對(duì)于在3個(gè)月內(nèi)未獲得滿意療效的患者，建議考慮監(jiān)測(cè)TKI血藥濃度。在針對(duì)CML患者的TKI治療中，治療藥物監(jiān)測(cè)是劑量?jī)?yōu)化方法，以期獲得更快，更有效的臨床治療新策略。本研究旨在運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，建立一種穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)下限低、能夠滿足臨床患者血漿中達(dá)沙替尼濃度的檢測(cè)方法，為后續(xù)血藥濃度與臨床療效的關(guān)系、藥動(dòng)學(xué)及體內(nèi)外代謝相關(guān)研究提供方法學(xué)支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 三重四極桿質(zhì)譜儀(型號(hào)：API4000+，美國(guó)AB SCIEX公司)；超高壓液相色譜儀(型號(hào)：ACQuity H，美國(guó)Waters 公司)；低溫高速離心機(jī)(型號(hào)：5804R，德國(guó)Eppendorf公司)；渦旋混合器(型號(hào)：Vortex-5，海門市其林貝爾儀器廠)；十萬分之一電子分析天平(型號(hào)：AB135-S，瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2試劑 達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：19-SEP-19-00，含量：99.4%，加拿大TRC公司)；伊馬替尼-D8內(nèi)標(biāo)(批號(hào)：I267987，含量：98.4%，加拿大TRC公司)；甲酸銨(批號(hào)：173132，含量：99%，美國(guó)Sigma公司)；乙腈、甲醇溶液(色譜級(jí)，美國(guó)TEDIA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1液相色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)una?C18柱(2.0 mm×20 mm，3 μm)；流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1甲酸銨緩沖液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫方式，洗脫程序見表1；流速：0.6 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序 Tab.1 The determination gradient elution conditions

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；干燥溫度：500 ℃；噴霧電壓：5500 V；離子源氣體1(N1)與氣體2(N2)壓力均為55 psi；氣簾氣壓力為25 psi；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的其他檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù) Tab.2 Mass spectrometric parameters of analytes and internal standards

2.1.3儲(chǔ)備液及工作液的配制 精密稱取達(dá)沙替尼10 mg，用甲醇-水(V/V=1：1)溶解達(dá)沙替尼，稱取伊馬替尼-D81 mg，用純甲醇溶解伊馬替尼-D8，然后分別定容至10 mL，搖勻，即得到1 mg·mL-1達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液，以及0.1 mg·mL-1伊馬替尼-D8內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液，4 ℃避光保存。

取達(dá)沙替尼對(duì)照品儲(chǔ)存液適量，甲醇-水(V/V=1：1)稀釋至相應(yīng)濃度(10，5，2.5，1，0.5，0.1，0.05，0.01 μg·mL-1) ，質(zhì)控低濃度(0.025 μg·mL-1)、中(1.0 μg·mL-1) 、高(8.0 μg·mL-1) 。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控血漿樣品的制備 180 μL空白血漿中分別加入20 μL達(dá)沙替尼工作液，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為1，5，10，50，100，250，500，1000 ng·mL-1；質(zhì)控對(duì)照品低濃度(2.5 ng·mL-1) 、中濃度(100 ng·mL-1) 、高濃度(800 ng·mL-1)，定量下限(1 ng·mL-1)。

2.1.5樣品前處理 精密吸取血漿樣品180 μL，依次加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液20 μL，甲醇800 μL除蛋白，渦旋混合均勻，在10 625×g相對(duì)離心力下離心10 min，取上清液上樣分析，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.6臨床應(yīng)用 收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2020年5月—2022年1月服用達(dá)沙替尼治療的CML患者血漿標(biāo)本共30例。該研究已通過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批([2021]倫理字(0784))，納入研究的患者均自愿簽署知情同意書。所有患者接受口服達(dá)沙替尼治療，每次100 mg，一天一次。達(dá)沙替尼在連續(xù)治療28 d后血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)，給藥2 h后血藥濃度達(dá)到峰值。服用達(dá)沙替尼的患者需要同時(shí)測(cè)定谷濃度和峰濃度用來評(píng)估療效與不良反應(yīng)?；颊叻眠_(dá)沙替尼達(dá)穩(wěn)態(tài)后，在下一次服藥前空腹采血2～5 mL，此時(shí)的濃度為谷濃度；服藥2 h后再一次采血2～5 mL，這時(shí)的濃度為峰濃度。血樣置于乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝管中，離心取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS 法檢測(cè)。

2.2結(jié)果

2.2.1方法專屬性考察 達(dá)沙替尼和伊馬替尼-D8的保留時(shí)間分別為1.99和1.93 min，空白血漿不干擾達(dá)沙替尼和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定。色譜圖見圖1。

A.空白血漿；B.定量下限的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品；C.服用達(dá)沙替尼患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣本。圖1 達(dá)沙替尼典型質(zhì)譜圖 A.blank plasma；B.standard plasma at the limit of quantitation；C.plasma sample at steady state of patients receiving dasatinib.Fig.1 Typical mass spectrum of nilotinib and dasatinib

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取達(dá)沙替尼的標(biāo)準(zhǔn)曲線混合血漿樣品上樣，達(dá)沙替尼與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)分別對(duì)血漿中的濃度進(jìn)行加權(quán)線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X2，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.000 561X+0.000 174，r2=0.997 4，結(jié)果表明達(dá)沙替尼血藥濃度在1～1000 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng·mL-1。

2.2.3準(zhǔn)確度和精密度 取達(dá)沙替尼定量下限(1 ng·mL-1) 、低(2.5 ng·mL-1) 、中(100 ng·mL-1) 、高(800 ng·mL-1)質(zhì)控4個(gè)濃度的血漿樣品，每一樣品配制6份，同一天內(nèi)上樣，分別計(jì)算準(zhǔn)確度，日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD) 表示，準(zhǔn)確度以樣品測(cè)定均值對(duì)理論值的相對(duì)偏差(RE)表示。結(jié)果見表3。

表3 達(dá)沙替尼測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與精密度 Tab.3 Accuracy and precision of determination for dasatinib

2.2.4提取回收率 分別配制低、中、高質(zhì)控樣品各6份，上樣分析記錄峰面積為A1，另外取6份空白血漿，甲醇提取后分別再加入達(dá)沙替尼以及內(nèi)標(biāo)質(zhì)控對(duì)照品，上樣分析記錄峰面積為A2，提取回收率(%)= A1/A2× 100%。結(jié)果見表4。

表4 達(dá)沙替尼提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) Tab.4 Extraction recovery and matrix effect of dasatinib

2.2.5基質(zhì)效應(yīng) 取6例不同患者的空白血漿各180 μL，分別加入適量的達(dá)沙替尼制備低、中、高3個(gè)濃度的樣品，上樣分析記錄峰面積為A3。取180 μL的超純水，相同處理后直接進(jìn)樣，峰面積為A4?；|(zhì)效應(yīng)= A3/A4×100%。結(jié)果表明血漿對(duì)達(dá)沙替尼的測(cè)定沒有干擾影響，結(jié)果見表4。

2.2.6殘留效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了進(jìn)樣高濃度樣品后的殘留問題，計(jì)算進(jìn)樣高濃度點(diǎn)后的殘留峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)峰面積的比值。結(jié)果表明達(dá)沙替尼殘留為0.08%，殘留分析物不影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度。

2.2.7穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)考察了達(dá)沙替尼質(zhì)控品在室溫放置24 h；-20 ℃凍融3次；以及4 ℃避光放置3 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。結(jié)果表明該方法具有很好的穩(wěn)定性。

表5 達(dá)沙替尼穩(wěn)定性考察結(jié)果 Tab.5 Stability inspection results of dasatinib

2.2.8臨床應(yīng)用 分別收集本院30例服用達(dá)沙替尼的CML患者進(jìn)行峰濃度與谷濃度測(cè)定。達(dá)沙替尼谷濃度為4.75(0.85～35.8)ng·mL-1，峰濃度為168.8(75.3 ～583.6)ng·mL-1。由此可見，筆者在本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-MS/MS 法能滿足臨床對(duì)達(dá)沙替尼血藥濃度檢測(cè)的需求。

3 討論

之前報(bào)道的達(dá)沙替尼血藥濃度測(cè)定方法普遍存在靈敏度低、樣本前處理復(fù)雜、樣本分析時(shí)間長(zhǎng)等弊端，而且檢測(cè)下限過高，無法滿足臨床需求[9-10]。本研究結(jié)合國(guó)內(nèi)外推薦的藥物有效治療窗，設(shè)置合理的濃度范圍，采用HPLC-MS/MS法檢測(cè)人血漿中達(dá)沙替尼的藥物濃度，前處理采用甲醇沉淀，高速離心的方法除蛋白，方法簡(jiǎn)單，出峰時(shí)間短。由于結(jié)構(gòu)相似，保留時(shí)間接近，該方法采用伊馬替尼-D8作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均說明伊馬替尼-D8可以最大限度避免基質(zhì)效應(yīng)。該方法檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)限低，可滿足臨床對(duì)于達(dá)沙替尼血藥濃度檢測(cè)的需求。

目前TKI類藥物濃度監(jiān)測(cè)在臨床上仍處于起步階段，但現(xiàn)有證據(jù)表明，基于藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的劑量調(diào)整對(duì)大多數(shù)接受TKI治療的CML患者有益[11]。研究表明每日劑量為100 mg的患者C0和Cmax的變異系數(shù)(CV)值分別為26%和56%[12]，說明達(dá)沙替尼Cmax的個(gè)體間差異較大。CML患者主要的細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)(CCyR)與達(dá)沙替尼平均穩(wěn)態(tài)血漿濃度顯著相關(guān)[13]，胸腔積液發(fā)生率與達(dá)沙替尼C0顯著相關(guān)(危險(xiǎn)比為1.22)[14]。對(duì)于達(dá)沙替尼，建議每天服用一次，維持較高的Cmax(≥50 ng·mL-1)可以獲得良好的臨床治療效果[15]，而較低的C0(<2.5 ng·mL-1)可以避免胸腔積液。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)服用達(dá)沙替尼的中國(guó)CML患者血藥濃度個(gè)體差異性大，結(jié)合部分患者的臨床療效也發(fā)現(xiàn)谷濃度較高的患者更易發(fā)生不良反應(yīng)，但是需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

本研究建立的達(dá)沙替尼血藥濃度檢測(cè)方法最大特點(diǎn)在于前處理操作簡(jiǎn)便，采用同位素內(nèi)標(biāo)避免基質(zhì)效應(yīng)，檢測(cè)范圍合理，可滿足臨床大樣本檢測(cè)以及藥動(dòng)學(xué)分析要求。本方法為后續(xù)進(jìn)一步研究達(dá)沙替尼血藥濃度與臨床療效和不良反應(yīng)的關(guān)系提供了很好的方法學(xué)支撐。