李鸝，賀蓓蓓，黃良永，杜士明，3

[1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)藥學(xué)部，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，十堰 442000；3.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北醫(yī)藥學(xué)院)，十堰 442000]

固腎丸是我院自制的中藥制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20210292)。該制劑在我院臨床使用了近30年，已被證明具有很好的療效。其主要成分為淫羊藿、白芍、制何首烏、女貞子、熟地、菟絲子、當(dāng)歸等17味中藥。具有養(yǎng)血健脾、溫腎固本、補(bǔ)陰助陽(yáng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡的作用。用于肝腎虧虛所致的四肢無(wú)力，腰膝酸軟；女子垂體功能障礙、宮冷不孕、男子腎虛不育等癥。該制劑標(biāo)準(zhǔn)收載于《湖北省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》(2011版)，標(biāo)準(zhǔn)中僅有淫羊藿苷的含量測(cè)定項(xiàng)[1]。而組方中女貞子、白芍、制何首烏、淫羊藿均為固腎丸的君藥。為了提升該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，全面反映君藥的有效成分，保證制劑的有效性，本研究建立一種新的高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫-多波長(zhǎng)切換法，同時(shí)對(duì)淫羊藿中主要成分淫羊藿苷、白芍的主要成分芍藥苷、制何首烏的主要成分二苯乙烯苷、女貞子的主要成分紅景天苷的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定4種測(cè)定成分的含量限度，為修訂和提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，也為下一步該制劑的HPLC指紋圖譜研究提供方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 ThermoFisher Ultimate 3000 HPLC(美國(guó)賽默飛公司，LPG-3400泵、WPS-3000SL analyt進(jìn)樣器、TCC-3000柱溫箱、VWD-3400四波長(zhǎng)檢測(cè)器)；變色龍色譜工作站v6.8中文版；色譜柱：OMNIBond HPLC column Orca ( C18，4.6 mm×250 mm，5μm )；科盟牌超聲清洗機(jī)(KM-36C，40 kHz，0～250 W可調(diào)，廣州科潔盟科技公司)；SHIMADZU AUW120D電子分析天平(感量：0.01 mg，日本島津公司)；GWA-UN Pure Water system(北京普析通用儀器公司)等。

1.2藥品與試劑 紅景天苷對(duì)照品(批號(hào)：200605，含量：98%)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-202044，含量：96.8%)、二苯乙烯苷對(duì)照品(批號(hào)：110844-201109，含量：94.7%)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)：110737-200415，110737-200413，含量：100%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。中藥飲片：熟地(批號(hào)：20210401)、鹽菟絲子(批號(hào)：20210301)白芍(批號(hào)：20210401)、川芎(批號(hào)：20210401)、醋延胡索(批號(hào)：20210301)、砂仁(批號(hào)：20200701)、黨參(批號(hào)：20210401)、當(dāng)歸(批號(hào)：20210301)、醋香附(批號(hào)：20210101)、枸杞子(批號(hào)：20210301)、覆盆子(批號(hào)：20201001)、女貞子(批號(hào)：20210301)、烏附片(批號(hào)：20200601)、佛手(批號(hào)：20200801)、制何首烏(批號(hào)：20210401)、淫羊藿(批號(hào)：20200801)由湖北清大中藥飲片有限公司生產(chǎn)；黃芪(批號(hào)：20210401)由湖北藥昇中藥科技有限公司生產(chǎn)。固腎丸3批次(批號(hào)：20210806，批號(hào)：20210506，批號(hào)：20210320，規(guī)格：10.5 g×45丸/盒)均由我院制劑室生產(chǎn)。乙腈(德國(guó)默克公司)為色譜純；磷酸、乙醇、甲醇等試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1固腎丸的制備 處方：淫羊藿420 g、白芍225 g、何首烏280 g、女貞子280 g、熟地420 g、當(dāng)歸225 g、川芎140 g、醋延胡索225 g、砂仁84 g、黨參252 g、黃芪420 g、覆盆子225 g、鹽菟絲子280 g、枸杞子225 g、烏附片140 g、佛手225 g、香附225 g。

制備：按處方取中藥材，洗凈后烘干，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩(80目)，鈷60輻照滅菌，與蜂蜜混勻(1：1)，制成大蜜丸，即得。

2.2色譜條件 以O(shè)MNIBond HPLC Orca C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；以0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行梯度洗脫；按表2中規(guī)定時(shí)間-波長(zhǎng)程序檢測(cè)，波長(zhǎng)分別為：220，230，320，270 nm；柱溫：30 ℃；流速1.0 mL·min-1，理論塔板數(shù)以芍藥苷的峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

表1 梯度洗脫程序 Tab.1 Program of gradient elution

表2 時(shí)間-檢測(cè)波長(zhǎng)程序 Tab.2 Program of time-wavelength

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液的制備 分別取3批次(批號(hào)：20210806，20210506，20210320)固腎丸，各10丸，剪碎成細(xì)粒狀，混勻，取3.0 g，精密稱(chēng)定，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇35 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，熱水浴中將樣品充分溶散后，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷至室溫，擦干錐形瓶外水分后再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷對(duì)照品溶液配制：分別精密稱(chēng)取芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷對(duì)照品11.9，10.87，10.73 mg，各置10 mL量瓶中，避光操作，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成單一對(duì)照品貯備液 (1.1519，1.0294，1.073 mg·mL-1)，冷藏，備用。

紅景天苷對(duì)照品溶液配制：取紅景天苷對(duì)照品13.64 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.5347 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，冷藏，備用。

2.3.3陰性樣品溶液 按處方比例分別稱(chēng)取缺女貞子、白芍、制何首烏、淫羊藿的飲片粉末共約1.5 g，蜂蜜1.5 g，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，即得4種陰性樣品溶液。

2.4系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取紅景天苷對(duì)照品溶液 0.5 mL、芍藥苷對(duì)照品溶液0.5 mL、二苯乙烯苷對(duì)照品溶液0.35 mL、淫羊藿苷對(duì)照品溶液0.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即成質(zhì)量濃度分別為26.735，57.595，36.029，42.92 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20210806)、混合對(duì)照品溶液及4種陰性樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。可知，紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的保留時(shí)間分別是17.20，28.00，35.16，51.27 min；理論塔板數(shù)均不低于8000；各待測(cè)成分的色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5；陰性樣對(duì)照品色譜圖中均無(wú)干擾成分。

1:紅景天苷；2.芍藥苷；3.二苯乙烯苷；4.淫羊藿苷；A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺女貞子陰性樣品；D.缺白芍陰性樣品；E.缺何首烏陰性樣品；F.缺淫羊藿陰性樣品。圖1 固腎丸中4種成分的色譜圖 1.Salidroside；2.paeoniflorin；3.2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside；4.Icariin；A.mixed refernce;；B.test solution；C.negative sample without privet；D.negative sample without white peony；E.negative sample without polygonum multiflorum；F.negative sample without herba epimedii.Fig.1 Typical chromatograms of 4 components in Gushen wan

2.5線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，置同一量瓶中，加甲醇稀釋成5組混合對(duì)照品溶液，濃度分別為紅景天苷(267.350，133.675，26.735，5.347，2.674 μg·mL-1)，芍藥苷(575.95，287.975，57.595，11.519，5.7595 μg·mL-1)，二苯乙烯苷(360.29，180.145，36.029，7.205 8，3.602 9 μg·mL-1)，淫羊藿苷(429.2，214.6，42.92，8.584，4.292 μg·mL-1)。分別按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄各待測(cè)成分峰面積。分別以4個(gè)待測(cè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg·mL-1)、相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 固腎丸中4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 Tab.3 Linear relationships of four constituents in Gushen wan

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批固腎丸(批號(hào)：20210806)10丸，剪碎，混勻，平行稱(chēng)取6份，每份3.0 g，精密稱(chēng)定，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，然后按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，精密吸取各供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣2次，記錄各待測(cè)成分峰面積平均值。結(jié)果，紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷峰面積的RSD(n=6)分別為1.91%，1.21%，0.91%，0.79%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.5”項(xiàng)下第三組混合對(duì)照品溶液(中間濃度)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各待測(cè)成分峰面積。結(jié)果紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷峰面積RSD(n=6)分別為1.37%，1.77%，1.27%，1.39%，表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：20210806)適量，于室溫下避光放置，在分別經(jīng)過(guò)1，2，4，8，12，24 h后，精密吸取該供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各待測(cè)成分峰面積。結(jié)果，紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的峰面積RSD(n=6)分別為0.99%，0.76%，0.43%，0.67%，表明供試品溶液在室溫下避光放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 將已知含量的同一批固腎丸(批號(hào)：20210806)10丸，剪碎，混勻，稱(chēng)取6份，每份約1.5 g，精密稱(chēng)定，分別置于100 mL具塞錐形瓶瓶中。向6個(gè)錐形瓶中各精密加入“2.3.3”項(xiàng)下紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液液0.80，0.95，0.60，0.75 mL，用50%乙醇補(bǔ)充至35.0 mL，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，然后按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各待測(cè)成分峰面積，將峰面積代入線性方程計(jì)算各成分的含量及加樣回收率。結(jié)果紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的平均加樣回收率分別為 101.41%，98.47%，101.32%，101.55%，RSD(n=6)均小于2%，表明該方法準(zhǔn)確度好，見(jiàn)表4。

表4 固腎丸中4種成分的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab.4 Recovery rates of 4 components in Gushen wann=6

2.10樣品測(cè)定 取“2.3.1” 項(xiàng)下制備好的3批供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各待測(cè)成分峰面積，將峰面積代入線性方程計(jì)算樣品中各成分的含量。以干燥品計(jì)算，3批固腎丸(批號(hào)分別為20210806，20210506，20210320)的水分含量分別是7.3%，5.0%，6.1%)；結(jié)果3批供試品溶液中紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的平均含量見(jiàn)表5。

表5 3批固腎丸中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果 Tab.5 Results of content determination in Gushen wanmg·g-1，n=3

3 討論

3.1色譜條件的選擇 本研究采用HPLC梯度洗脫、多波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定固腎丸中4種成分的含量。前期流動(dòng)相考察了乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同流動(dòng)相體系，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相按表2進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜圖的基線平穩(wěn)，各色譜峰能較為完全分離，各測(cè)定成分峰型較好。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇，依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》一部中[2]女貞子、白芍、制何首烏、淫羊藿藥材含量測(cè)定項(xiàng)下，紅景天苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220，230，320，270 nm，因此本研究選擇采用多波長(zhǎng)切換法，結(jié)合色譜圖中的各測(cè)定成分保留時(shí)間采用時(shí)間-波長(zhǎng)程序控制最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，提高各測(cè)定成分的檢測(cè)靈敏度。

3.2提取方法的選擇 本研究前期考察了超聲提取[3-8]、加熱回流提取[3-4，9]、SPE提取[10-14]，提取時(shí)間均為60 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述方法提取時(shí)，樣品中的測(cè)定成分含量無(wú)明顯差異，對(duì)固腎丸中測(cè)定成分提取效率基本相同，考慮到操作的簡(jiǎn)便性，故采用超聲提取法(40 kHz，250 W)；采用單因素優(yōu)化法，對(duì)超聲提取的超聲時(shí)間(30，60，90 min)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲60，90 min時(shí)提取效率差異較小，但均優(yōu)于超聲30 min，故采用60 min作為超聲時(shí)間。提取溶劑的選擇，《中國(guó)藥典》中[2]女貞子、白芍、制何首烏、淫羊藿藥材的含量測(cè)定均采用50%乙醇提取，本研究也對(duì)提取溶劑單因素優(yōu)化，采用40%，50%，70%，100%乙醇及相同濃度的甲醇超聲比較，結(jié)果顯示50%乙醇對(duì)測(cè)定的4種成分提取效率均最高，故本研究最終采用50%乙醇為溶劑超聲提取(40 kHz，250 W)60 min作為提取方法。

3.3含量測(cè)定結(jié)果分析 本研究采用HPLC梯度洗脫多波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定了固腎丸中的4種成分含量，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。測(cè)定結(jié)果表明，3批樣品中4種待測(cè)成分的平均含量從高到低依次為芍藥苷(0.65～0.72 mg·g-1)、淫羊藿苷(0.35～0.56 mg·g-1)、二苯乙烯苷(0.30～0.56 mg·g-1)、紅景天苷(0.19～0.36)mg·g-1，各批間4種成分的含量有明顯差異，這可能與飲片的質(zhì)量差異有關(guān)，為保證制劑成品的質(zhì)量，中藥飲片的來(lái)源應(yīng)統(tǒng)一，質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)；結(jié)果也表明多成分測(cè)定對(duì)控制固腎丸質(zhì)量的必要性。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，按測(cè)定成分的平均含量的80%作為含量限度指標(biāo)，本品中芍藥苷、淫羊藿苷、二苯乙烯苷、紅景天苷含量按干燥品計(jì)算須≥0.56，0.36，0.35，0.20 mg·g-1。