朱俊訪，李博，潘曉瑜，楊悅

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520)

延胡索為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬Corydalis Vent.植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，其主要活性成分是生物堿類成分，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對(duì)冠心病、心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的臨床效果[1-2]。延胡索生物堿的提取純化多采用水提醇沉、大孔樹脂純化等方法[3]，但這些方法成本高、耗時(shí)費(fèi)力，難以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。為提高產(chǎn)品質(zhì)量及綠色中藥的發(fā)展要求，有必要對(duì)延胡索生物堿提取純化工藝進(jìn)行深入研究。膜技術(shù)是一種新型分離技術(shù)，具有高效、節(jié)能、無污染、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，在傳統(tǒng)中藥提取方面已經(jīng)取得了很好的研究成果，目前在中藥的生產(chǎn)過程中應(yīng)用的膜技術(shù)主要包括微濾、超濾和納濾[4-5]。分子印跡技術(shù)是一種高選擇性的分離技術(shù)，在物質(zhì)分離純化領(lǐng)域有著極大的發(fā)展?jié)摿头浅Ｖ匾膽?yīng)用前景[6]。目前的膜分離都是以篩分機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的分離，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)特定物質(zhì)的選擇性分離。而分子印跡膜則將分子印跡聚合物對(duì)模板分子的專一識(shí)別特性與膜分離的可連續(xù)化操作特點(diǎn)相互結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)特定物質(zhì)的特異性分離提供了有效途徑。膜技術(shù)、分子印跡技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用在延胡索生物堿類物質(zhì)的分離筆者尚未見報(bào)道。本文將膜分離技術(shù)與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，加以改進(jìn)，以節(jié)約能耗、降低生產(chǎn)成本為目的，并為膜分離技術(shù)在藥物分離方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

實(shí)驗(yàn)用膜分離裝置MSM2013(上海摩速科學(xué)器材有限公司)；AUY120萬分之一電子天平(日本島津儀器公司，感量：0.1 mg)；UV2600紫外分光光度計(jì)(尤尼科儀器有限公司)；聚醚砜平板膜(截留分子量10 000，5000，3500，1000，中科瑞陽膜技術(shù)有限公司，批號(hào)：2020UE001)；延胡索乙素(THP)對(duì)照品(含量≥98%，西安沃森生物科技有限公司，批號(hào)：20181226)；葡萄糖(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190706)；甲基丙烯酸(分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180808)；偶氮二異丁氰(分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2019003)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(含量：98%，阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)：D1629145)。延胡索購自廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院梁永樞副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1延胡索總生物堿與多糖的含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素50 mg置于50 mL量瓶中，加入5%硫酸溶液1 mL溶解，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得對(duì)照液母液。精密量取對(duì)照液母液1 mL至10 mL量瓶，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得對(duì)照儲(chǔ)備液。

2.1.2延胡索生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液0，0.2，0.5，0.6，0.8，1.0，1.3，1.5 mL至5 mL量瓶，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液1.0 mL置于分液漏斗中，各加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液12.0 mL，再加0.04%溴甲酚綠溶液3.0 mL，用三氯甲烷9.0 mL振搖提取2 min，靜置40 min，取三氯甲烷層置于有0.2 g無水硫酸鈉的具塞試管中，在409 nm處測(cè)定吸光度(A)[7-8]。得吸光度(A)與濃度(C)的線性關(guān)系為A=0.054 6C+0.038 4，R2=0.999 0。

2.1.3多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖，配制0.1 mg·ml-1葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL具塞試管，加純化水至2 mL，分別加入5%苯酚1 mL，98%硫酸5 mL，搖勻靜置30 min，于489 nm測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]，得吸光度(A)與濃度(C)的線性關(guān)系為A=7.082C+0.013 2，R2=0.999 1。

2.2延胡索生物堿樣品制備

2.2.1延胡索提取液的制備 稱取經(jīng)粉碎過孔徑約0.25 mm(60目)篩的延胡索粉末300 g，加水10 L浸泡，浸泡3次，每次24 h，過濾，合并濾液，得延胡索提取液。

2.2.2膜分離延胡索生物堿研究[10-13]

(1)不同截留分子量超濾膜分離研究。量取延胡索提取液4份，每份5 L，室溫下用孔徑5 μm微孔濾膜抽濾，得延胡索微濾液。取4份延胡索微濾液，分別使用截留分子量為10 000，5000，3500，1000的聚醚砜平板膜進(jìn)行錯(cuò)流循環(huán)超濾(圖1)，膜有效面積為70 cm2，得4份延胡索超濾液。按“2.1.2”項(xiàng)方法測(cè)定微濾液、4份超濾液中生物堿含量，并計(jì)算各濾液的固形物含量、生物堿轉(zhuǎn)移率和除雜率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，隨著超濾膜截留分子量的減小，料液中固形物含量、生物堿總量和轉(zhuǎn)移率都依次降低，但隨著除雜率不斷提高，生物堿含量先增大后減小。其中分子量為10 000超濾液中的生物堿總量最高，但由于除雜率較低導(dǎo)致其生物堿含量不及分子量為5000超濾液。綜合考慮生物堿轉(zhuǎn)移率、除雜率以及生物堿含量，初步選定截留分子量為5000的超濾膜分離效果較好。

表1 延胡索提取液、微濾液和超濾液結(jié)果 Tab.1 Results of yanhusuo extract，microfiltration and ultrafiltration

圖1 錯(cuò)流循環(huán)超濾裝置 Fig.1 Cross flow circulating ultrafiltration device

(2)超濾膜動(dòng)態(tài)分離研究。量取延胡索提取液5 L，室溫下先用孔徑5 μm微孔濾膜抽濾，再使用截留分子量為5000的聚醚砜平板膜進(jìn)行錯(cuò)流循環(huán)超濾，每超濾600 mL收集一份超濾液，共收集6份，按“2.1.2”項(xiàng)和“2.1.3”項(xiàng)方法分別測(cè)定超濾液中THP和多糖含量，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，THP能較好地穿過超濾膜，而大部分的多糖則被截留，說明該超濾膜能穩(wěn)定有效地截留大分子物質(zhì)。

圖2 不同時(shí)間超濾液中THP和多糖含量 Fig.2 Contents of THP and polysaccharide in ultrafiltration at different times

(3)料液超濾溫度研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，操作壓力設(shè)為0.35 MPa，過膜速率為400 mL·min-1，測(cè)定不同溫度下膜通量的變化，結(jié)果見圖3。由圖中曲線可以看出，當(dāng)溫度在<30 ℃，膜通量隨溫度的升高而明顯升高，這可能與溶液溫度的升高降低了溶液粘度并且提高了超濾膜兩側(cè)的溶質(zhì)的擴(kuò)散速度有關(guān)。溫度>30 ℃，膜通量隨溫度的升高增加緩慢。綜合考慮溫度對(duì)膜通量影響和實(shí)際操作性，初步選定料液超濾溫度為30 ℃。

圖3 料液溫度對(duì)膜通量的影響 Fig.3 Effect of feed liquid temperature on membrane flux

(4)超濾操作壓力研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，溶液溫度設(shè)定為30 ℃，過膜速率為400 mL·min-1，測(cè)定不同操作壓力下膜通量的變化，結(jié)果見圖4。由圖中曲線可以看出，膜通量隨著操作壓力的增大迅速增大，壓力是超濾膜的傳質(zhì)推動(dòng)力，料液中的溶劑和小分子物質(zhì)在壓力推動(dòng)作用下通過膜，壓力越大推動(dòng)力越強(qiáng)通量越大。當(dāng)操作壓力達(dá)到0.3MPa后膜通量增加緩慢變化趨于穩(wěn)定，這可能與操作壓力增大促進(jìn)超濾膜表面形成凝膠層有關(guān)，膜表面的凝膠層增大了料液的透過阻力。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際操作條件，初步選定最佳操作壓力為0.35 MPa。

圖4 操作壓力對(duì)膜通量的影響 Fig.4 Effect of operating pressure on membrane flux

(5)超濾過膜速率研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，溶液溫度設(shè)定為30 ℃，操作壓力設(shè)為0.35 MPa，測(cè)定不同過膜速率下膜通量的變化，結(jié)果見圖5。由圖中曲線可以看出，膜通量隨著過膜速率的增大迅速增大，增大流速可以起到邊滲透邊洗膜的作用，當(dāng)過膜速率達(dá)到400 mL·min-1后膜通量增加緩慢變化趨于穩(wěn)定，這可能與流速加快增加了組件壓力損失有關(guān)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際操作條件，初步選定最佳過膜速率為400 mL·min-1。

圖5 過膜速率對(duì)膜通量的影響 Fig.5 Effect of membrane passing rate on membrane flux

(6)超濾工藝優(yōu)化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溫度、壓力和過膜速率為影響因素，應(yīng)用中心組合實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-15]，以延胡索生物堿透過率和高分子截留率為響應(yīng)值，采用綜合評(píng)分(Y)評(píng)價(jià)超濾工藝，延胡索中含有大量的多糖類物質(zhì)，因此延胡索生物堿透過率與多糖截留率均為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并予以相同的權(quán)重，由此制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為Y=生物堿透過率×0.5+多糖截留率×0.5。星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素水平見表2。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 設(shè)計(jì)因素及水平 Tab.2 Table of design factors and levels

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果 Tab.3 Response surface experimental design scheme and results

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-expert對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸分析結(jié)果見表4。當(dāng)Prob>F值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)對(duì)模型影響顯著，從回歸分析結(jié)果看，整體模型的Prob>F值=0.001 5，表明該二次方程顯著。操作壓力(Prob>F=0.001 1)和料液溫度(Prob>F=0.017 3)與Y的線性關(guān)系顯著。從Prob>F值可推斷出各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)椋簤毫?溫度>過膜速率。失擬項(xiàng)的Prob>F值為0.615 2，不顯著，該模型擬合程度較好，從而說明該模型能夠?qū)Τ瑸V膜分離延胡索生物堿進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和分析。進(jìn)行多元回歸擬合，得Y對(duì)A、B和C的二次多元回歸方程。Y=66.56-0.72A+1.24B+0.33C+0.94AB-0.29AC+0.022BC-1.74A2-1.44B2-0.97C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.942 4。

表4 回歸分析結(jié)果 Tab.4 Regression analysis results

圖6分別為3個(gè)影響因素兩兩之間相互作用的響應(yīng)面曲線，圖中顯示了溫度、壓力和流速之間存在交互作用，隨著其中兩個(gè)因素的增大，綜合評(píng)分先增大后減小，影響因素B>A>C，3個(gè)因素中超濾壓力對(duì)綜合評(píng)分的大小影響最顯著。經(jīng)計(jì)算確定截留分子量為5000的超濾膜分離延胡索生物堿的最佳工藝為料液溫度29.5 ℃，操作壓力為0.37 MPa，過膜流速為419 mL·min-1，預(yù)測(cè)綜合評(píng)分Y結(jié)果為66.87。

圖6 各因素的相互影響 Fig.6 Interaction of various factors

(7)膜分離驗(yàn)證試驗(yàn)。按上述工藝進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，所得超濾液按“2.1.2”項(xiàng)和“2.1.3”項(xiàng)方法測(cè)定延胡索生物堿和多糖含量，計(jì)算延胡索生物堿透過率、多糖截留率和綜合評(píng)分Y，結(jié)果見表5。延胡索生物堿平均透過率為60.8%，多糖截留率為72.7%，綜合評(píng)分Y為66.78與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說明該實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)學(xué)模型可靠，其工藝參數(shù)準(zhǔn)確可信，具有良好的預(yù)測(cè)性。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab.5 Results of validated experimental%

2.3分子印跡膜分離延胡索生物堿研究

2.3.1分子印跡膜制備 按文獻(xiàn)[16]所述過程，采用紫外光引發(fā)聚合，制備延胡索乙素分子印跡復(fù)合膜，步驟如下：取模板分子THP 溶解在三氯甲烷中，加入5倍量功能單體MAA，超聲混勻，加入20倍量的交聯(lián)劑EDMA，最后加入AIBN，超聲溶解，得預(yù)聚液，將PVDF膜浸泡于預(yù)聚液中20 min，取出通過紫外光引發(fā)聚合，制備THP分子印跡復(fù)合膜。非印跡復(fù)合膜的制備除不加模板分子THP外，其余操作同印跡復(fù)合膜的制備[16]。

2.3.2THP印跡復(fù)合膜分離延胡索生物堿 自制2個(gè)一側(cè)帶圓孔的玻璃池，將THP印跡復(fù)合膜(直徑1.5 cm)固定于兩玻璃池的圓孔之間，一個(gè)為滲透池，另一個(gè)為透過池，組成滲透裝置。滲透池中放入截留分子量為5000的超濾液100 mL，透過池中放入2%醋酸溶液100 mL，磁力攪拌器攪拌24 h，分別在6，12和24 h取樣，按“2.1.2”項(xiàng)方法測(cè)定生物堿含量和24 h后透過液固形物中生物堿含量，考察THP印跡復(fù)合膜對(duì)超濾液中生物堿成分的透過性能，重復(fù)3次，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示在滲透6，12和24 h后 PVDF膜的透過液生物堿透過率最高，非印跡復(fù)合膜的透過液生物堿透過率最低，THP印跡復(fù)合膜膜透過液固形物中生物堿含量最高，達(dá)到7.5%。

表6 PVDF膜、THP印跡復(fù)合膜和非印跡復(fù)合膜不同時(shí)間透過結(jié)果 Tab.6 Transmission results of PVDF membrane，THP imprinted membrane and non imprinted membrane at different times

3 討論

延胡索主要成分為生物堿，此外還含有大量的淀粉、樹脂和多糖等大分子物質(zhì)，其中延胡索總生物堿在水中略溶，溶解度大約10 mg·mL-1[17]，基于操作便捷與經(jīng)濟(jì)環(huán)?？紤]本文采用水浸泡提取。超濾中膜的截留分子量越小，除雜率越高，但有效成分損失也越大，并且滲濾速度和膜通量下降明顯。提高壓力能增加膜通量，但也會(huì)促進(jìn)膜表面形成凝膠層增加滲透阻力。升高溫度能促進(jìn)膜表面溶質(zhì)向主體運(yùn)動(dòng)，提高過濾速度，但也會(huì)相應(yīng)加速超濾膜老化。增大流速能減小膜表面凝膠層的厚度，但也會(huì)增加膜表面的磨損。本研究采用截留分子量為5000的超濾膜可獲得較好的生物堿轉(zhuǎn)移率和較高的膜通量，并能有效除去延胡索提取液中的大分子物質(zhì)。延胡索提取液使用孔徑5 μm微濾膜抽濾，然后在溶液溫度為29.5 ℃，操作壓力為0.37 MPa，過膜流速為419 mg·min-1，使用截留分子量為5000的超濾膜對(duì)延胡索提取液進(jìn)行錯(cuò)流循環(huán)超濾，所得超濾液中生物堿含量最高。鐘蓮等[18]研究了石硫法、水提醇沉法、D101大孔樹脂和732型陽離子樹脂對(duì)延胡索乙素的純化工藝，延胡索乙素含量分別為0.41%，0.30%，1.08%和1.19%，與本文結(jié)果比較顯示，超濾法具有一定優(yōu)勢(shì)。超濾法與傳統(tǒng)方法比較，不僅操作簡單、省時(shí)高效、節(jié)能，且無二次污染，如果清洗使用得當(dāng)超濾膜可長期循環(huán)使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)性。膜分離在中藥化學(xué)成分分離中應(yīng)用，需面臨膜污染與膜吸附的問題，一般可通過膜改性來解決此方面問題，這也是筆者進(jìn)一步研究的方向。

THP印跡復(fù)合膜和非印跡復(fù)合膜在聚合過程中在PVDF膜表面形成了聚合物，膜的孔徑變小，而THP印跡復(fù)合膜表面存在延胡索乙素三維結(jié)構(gòu)空穴，3種膜的孔徑大小為PVDF膜>THP印跡復(fù)合膜>非印跡復(fù)合膜，因此印跡膜分離延胡索生物堿試驗(yàn)中PVDF膜的生物堿透過率最高，非印跡復(fù)合膜的生物堿透過率最低。經(jīng)過24 h膜滲透，由于延胡索中生物堿成分的結(jié)構(gòu)與模板分子THP的結(jié)構(gòu)相似，相對(duì)其他成分更容易通過印跡膜的空穴結(jié)構(gòu)，而PVDF膜和非印跡復(fù)合膜不存在印跡空穴，料液中各種成分的透過率差異小，因此THP印跡復(fù)合膜的透過液固形物中生物堿含量最大。

本文首先對(duì)延胡索提取液進(jìn)行超濾，所得超濾液中生物堿含量比原提取液中生物堿含量提高了23%，超濾液利用分子印跡膜進(jìn)一步純化，最終生物堿含量提高了3倍。綜上，膜分離技術(shù)能有效去除延胡索水提液中的大分子雜質(zhì)，明顯提高生物堿含量，且分子印跡膜分離實(shí)驗(yàn)顯示其在分離延胡索生物堿的可行性，本研究為膜技術(shù)和分子印跡技術(shù)聯(lián)用分離中藥有效物質(zhì)奠定了一定的基礎(chǔ)。