曾佑成，周彥倫，曹國棟，林靚，郭立春，趙宇含，程青虹，3

(1.石河子大學醫(yī)學院，石河子 832061；2.南華大學醫(yī)學院，衡陽 421200；3.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，石河子 832061)

膿毒癥心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy，SIC)是由膿毒癥導致的可逆性心功能障礙疾病，若不能得到及時有效的治療，可導致患者死亡。由于其居高不下的病死率，SIC是研究者們重點關(guān)注的疾病之一[1-2]。目前，已知的膿毒癥心肌功能障礙的機制包括循環(huán)中介質(zhì)改變、細胞形態(tài)功能異常、線粒體功能障礙等[3]。近年來，鐵死亡作為一種鐵依賴性的新的細胞死亡形式，逐步走入研究者們的視野，已有研究表明它參與了心肌缺血-再灌注損傷、糖尿病心肌病、阿奇霉素誘導的心肌病等多種心血管疾病的發(fā)生[4-5]，但其在SIC中的發(fā)病機制、信號傳導通路等尚未完全闡明。白藜蘆醇是研究最多的具有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的多酚，主要存在于毛葉藜蘆、虎杖、葡萄等植物中，具備免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等多種生物學效應，且具有心肌保護作用[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡影響疾病結(jié)局[9]。針對病因復雜的SIC，白藜蘆醇具有多靶點和多環(huán)節(jié)的治療優(yōu)勢，基于鐵死亡探索白藜蘆醇抗SIC的作用機制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g。購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心[生產(chǎn)許可證編號：SYXK(新)2011-010101]，實驗大鼠在石河子大學第一附屬醫(yī)院動物中心進行飼養(yǎng)[動物許可證編號：SYXK(新)2011-0002]，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境下由專人添加食物與水，相對溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～70%，室內(nèi)通風良好，進食、飲水及籠內(nèi)活動不設限。本實驗的動物實驗方案均得到石河子大學動物保護與使用委員會的批準(批號：A2018-018-01)。

1.1.2藥物與試劑 白藜蘆醇購自上海麥克林生物科技有限公司，批號：817263，含量≥99%；Ex527(SIRT1抑制劑)購自上海羅恩試劑公司，批號：312666，含量≥98%；SIRT1(貨號：ab32441)、FTH-1(貨號：ab183781)購自美國Abcam公司；GPX4(貨號：T56959)購自上海Abmart公司；RIPA組織裂解液(貨號：R0010)、Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG熒光二抗(貨號：K1034G-AF594)購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；DHE染色試劑盒(貨號：D1008)購自蘇州宇恒生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗(貨號：GB23301)、山羊抗兔二抗(貨號：GB23303)、抗β-actin抗體(貨號：GB11001)均購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；高敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(貨號：E412-01/02)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號：A0202-2)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)試劑盒(貨號：H197-1～2)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(貨號：A006-2-1)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(貨號：A003-1～2)購自南京建成生物工程研究所；鐵離子比色法檢測試劑盒(貨號：E1042)購自北京普利萊生物公司。

1.1.3儀器 Z323K低溫離心機(德國HERMILE公司)，多功能酶標儀Elx-800(美國Bio-Bad公司)，石蠟包埋機、輪轉(zhuǎn)式切片機(德國LEICA公司)，光學顯微鏡(日本OPAGmpus公司)，全自動化學發(fā)光成像儀5200(中國上海天能公司)。

1.2方法

1.2.1分組與模型處理 48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量分層隨機法分為假手術(shù)組、模型對照組、白藜蘆醇組、Ex527組(每組12只)。模型對照組、白藜蘆醇組、Ex527組采用盲腸結(jié)扎穿孔法制作大鼠膿毒癥模型[10]，具體方法：術(shù)前禁食12 h，不禁水，麻醉后仰臥位固定。備皮，消毒后行腹中線切口，長度 1～1.5 cm，尋找到盲腸后，移出腹腔，在距根部1/4處用4號絲線結(jié)扎，用18號針對穿腸壁刺兩次，擠出少量內(nèi)容物，將腸管回納入腹腔，使得腸內(nèi)容物持續(xù)溢出，逐層關(guān)腹，術(shù)后立即皮下注射乳酸鈉林格液 50 mL·kg-1，所有大鼠經(jīng)靜脈給予營養(yǎng)支持。假手術(shù)組小鼠用同樣的方法處理，但不結(jié)扎和穿孔盲腸，不使用抗菌藥物或類似物，術(shù)后大鼠放回籠中，禁止攝入食物，可以自由獲得水。觀察造模前和造模后大鼠的肛溫、呼吸頻率、心率、反應、飲食情況和有無豎毛、腹瀉及出血等情況，評價模型是否成功。

1.2.2藥物處理 選取造模成功大鼠納入實驗，模型對照組：采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備SIC大鼠模型，術(shù)后0.5 h予以腹腔注射等同溶劑對照劑量的0.9%氯化鈉溶液；白藜蘆醇組：CLP術(shù)后0.5 h予以腹腔注射白藜蘆醇(50 mg·kg-1)；Ex527組：CLP術(shù)前0.5 h腹腔注射Ex527(5 mg·kg-1)，術(shù)后0.5 h予以腹腔注射白藜蘆醇(50 mg·kg-1)；假手術(shù)組：術(shù)后0.5 h予以腹腔注射等同溶劑對照劑量的0.9%氯化鈉溶液[11-13]。待術(shù)后各組大鼠實驗觀察點結(jié)束，即術(shù)后24 h后麻醉取腹主動脈血4 mL，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑6 cm)，取血清分裝后存放于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)檢測。各組大鼠處死后，留取心臟標本，制作染色病理切片及用于后續(xù)檢測。

1.2.3心肌組織蘇木精-伊紅(HE)染色 手術(shù)取出心臟組織后洗凈殘余血液，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定保存48 h后行石蠟包埋，使用切片機將組織切片厚度5 μm，60 ℃烤片30 min進行脫蠟，水洗后行HE染色，梯度乙醇脫水，透明，滴加適量中性樹膠后加蓋玻片封片，待切片干燥后光學顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.4透射電鏡觀察 透射電子顯微鏡采用武漢賽維爾生物技術(shù)公司的標準程序進行。大鼠處死后3 min內(nèi)取樣，心臟組織取下后洗凈切片面積2 mm×2 mm，投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃冷藏保存運輸。之后使用1%瓊脂糖包埋細胞，脫水，用超微切片機切割成超薄切片(厚度70 nm)。切片用乙醇配制的醋酸鈾染色15 min，然后用檸檬酸鉛染色15 min。使用透射電子顯微鏡(HT7700，HITACHI)拍攝圖像，每組至少拍攝圖像5張。

1.2.5生化指標檢測 取大鼠腹主動脈血3 mL離心血清，分別檢測LDH和CK-MB的變化水平。通過研磨取左心室心肌組織勻漿上清液檢測GSH和MDA的變化水平。操作步驟均按照對應試劑盒說明書方法操作。

1.2.6心臟組織鐵離子濃度檢測 采用亞鐵嗪比色法定量檢測鐵離子濃度。心臟組織稱質(zhì)量后使用RIPA組織裂解液冰上裂解30 min。設置空白對照管、標準品管和樣品管，加入鐵離子檢測劑30 μL，混勻，室溫孵育30 min。樣品在波長 550 nm 處讀取吸光度(A值)，以標準曲線取值。

1.2.7DHE染色檢測組織活性氧自由基(realtive axygen species，ROS) 采用新鮮組織冰凍切片進行DHE染色。取下心臟后，使用含乙醇-干冰的OCT化合物包埋心臟組織，待冰凍切片機至最佳切割溫度，將其切成切片厚度5 μm，并置于載玻片上，儲存在-80 ℃冰箱。在每個組織切片上滴加DHE(10 mol·L-1)，37 ℃避光濕盒中30 min，熒光顯微鏡觀察和拍攝紅色發(fā)射圖像，ROS陽性細胞在整個核區(qū)被染成紅色(激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為610 nm)。

1.2.8Western blotting檢測心肌SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表達 心肌組織冰上研磨至勻漿，加入RIPA組織裂解液裂解30 min，12 000 r·min-1離心(離心半徑6 cm)，取上清液，測定蛋白濃度。蛋白加上樣緩沖液后煮沸上樣，進行凝膠電泳，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，BSA封閉液封閉2 h，使用SIRT1、GPX4、FTH-1(1：1000)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，對應二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，滴加ECL發(fā)光液與膜作用后進行顯影。

2 結(jié)果

2.1HE染色心臟病理組織結(jié)果 見圖1。大鼠心肌HE結(jié)果顯示，24 h后所有假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊有序，未見明顯異常。模型對照組心肌細胞水腫、變性，部分橫紋肌模糊(黑色箭頭所示)，間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂(紅色箭頭所示)，炎性細胞浸潤(綠色箭頭所示)。與模型對照組比較，白藜蘆醇組偶見炎癥細胞浸潤，病理損傷程度明顯減輕。而Ex527組損傷程度較白藜蘆醇組明顯加重。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組。圖1 4組大鼠心臟組織HE染色結(jié)果 A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group.Fig.1 HE staining results of heart tissues in four groups of rats

2.2線粒體形態(tài)觀察 見圖2。鐵死亡典型的形態(tài)學改變?yōu)榧毎て屏寻殡S同質(zhì)異形的小線粒體(嵴減少，膜凝聚，外膜破裂)[4]。圖2中，假手術(shù)組心肌細胞線粒體膜和嵴結(jié)構(gòu)清晰完整，排列整齊。與假手術(shù)組比較，模型對照組心肌線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)外膜破裂、空泡樣改變、嵴溶解斷裂、肌纖維排列紊亂等改變。白藜蘆醇組仍可見正常線粒體結(jié)構(gòu)，僅小部分線粒體膜和嵴結(jié)構(gòu)缺如。Ex527組類似模型對照組改變，可見線粒體膜凝聚、嵴減少。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組。圖2 4組大鼠心肌電子顯微鏡結(jié)果 A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group.Fig.2 Electron microscopic results of myocardium in four groups of rats

2.3LDH、CK-MB檢測結(jié)果 見圖3。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠血清中LDH和CK-MB均顯著升高(P<0.01)，表明模型對照組大鼠心肌功能受損。造模后使用白藜蘆醇腹腔注射，該組大鼠LDH和CK-MB均顯著降低(P<0.01)。與白藜蘆醇組比較，Ex527組LDH和CK-MB均顯著升高(P<0.01)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組；①與假手術(shù)組比較，t=10.71，26.60，P<0.01；②與模型對照組比較，t=10.98，25.95，P<0.01；③與白藜蘆醇組比較，t，5.18～6.36，P<0.01。圖3 4組大鼠血清中LDH、CK-MB水平A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group；①Compared with sham group，t=10.71，26.60，P<0.01；②Compared with model control group，t=10.98，25.95，P<0.01；③Compared with resveratrol group，t=5.18，6.36，P<0.01.Fig.3 LDH and CK-MB levels in the serum of rats in four

2.4GSH、MDA檢測結(jié)果 見圖4。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠GSH含量顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，白藜蘆醇組大鼠的GSH含量顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.01)。與白藜蘆醇組比較，Ex527組GSH水平明顯降低，而MDA明顯升高(P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組；①與假手術(shù)組比較，t=11.13，17.83，P<0.01；②與模型對照組比較，t=7.52，8.70，P<0.01；③與白藜蘆醇組比較，t=4.51，6.35，P<0.05。圖4 4組大鼠心肌組織中GSH、MDA水平A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group；①Compared with sham group，t=11.13，17.83，P<0.01；②Compared with model control group，t=7.52，8.70，P<0.01；③Compared with resveratrol group，t=4.51，6.35，P<0.05.Fig.4 GSH and MDA levels in myocardial tissue of rats in four

2.5鐵離子濃度檢測結(jié)果 見圖5。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠心肌細胞中鐵離子含量顯著升高(P<0.01)。在使用白藜蘆醇干預后，該組大鼠鐵離子含量顯著降低(P<0.01)。與白藜蘆醇組比較，Ex527組鐵離子含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組；①與假手術(shù)組比較，t=13.20，P<0.01；②與模型對照組比較，t=6.59，P<0.01；③與白藜蘆醇組比較，t=2.74，P<0.05。圖5 4組大鼠心肌組織鐵離子濃度 A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group；①Compared with sham group，t=13.20，P<0.01；②Compared with model control group，t=6.59，P<0.01；③Compared with resveratrol group，t=2.74，P<0.05.Fig.5 Concentration of iron ions in myocardial tissue of rats in four groups

2.6檢測組織ROS結(jié)果 見圖6。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠心肌ROS表達顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，白藜蘆醇組ROS表達受到抑制(P<0.01)。在使用Ex527之后，ROS表達水平明顯升高(P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組；①與假手術(shù)組比較，t=12.21，P<0.01；②與模型對照組比較，t=14.41，P<0.01；③與白藜蘆醇組比較，t=8.94，P<0.05。圖6 4組大鼠心肌ROS染色結(jié)果(×400) A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group；①Compared with sham group，t=12.21，P<0.01；②Compared with model control group，t=14.41，P<0.01；③Compared with resveratrol group，t=8.94，P<0.05.Fig.6 ROS staining results of rat myocardium in four groups(×400)

2.7Western blotting實驗結(jié)果 見圖7。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠心肌中SIRT1、GPX4、FTH-1顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，白藜蘆醇給藥組能顯著提高SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表達水平(P<0.05)。在使用Ex527之后，SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表達水平明顯減少(均P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白藜蘆醇組；D.Ex527組；①與假手術(shù)組比較，t=16.48，7.32，3.80，P<0.05；②與模型對照組比較，t=13.75，9.84，5.03，P<0.05；③與白藜蘆醇組比較，t=7.74，4.90，6.17，P<0.05。圖7 4組大鼠心肌組織SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表達水平 A.sham group；B.model control group；C.resveratrol group；D.Ex527 group；①Compared with sham group，t=16.48，7.32，3.80，P<0.05；②Compared with model group，t=13.75，9.84，5.03，P<0.05；③Compared with control resveratrol group，t=7.74，4.90，6.17，P<0.05.Fig.7 Expression levels of SIRT1，GPX4 and FTH-1 protein in myocardial tissue of rats in four groups

3 討論

SIC是嚴重膿毒癥常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機制的復雜性增加了臨床治療的難度，目前仍沒有有效的治療方式來早期干預 SIC 的進展[14-15]。鐵死亡作為一種新的細胞死亡方式，有研究表明鐵蛋白自噬參與的鐵死亡介導了SIC的發(fā)生[16]。鐵死亡在形態(tài)學、遺傳學和生物化學等方面均不同于以往的細胞凋亡、焦亡或壞死等細胞死亡方式，它受多種代謝途徑調(diào)控，有兩大特征：一是鐵依賴性，各種原因所致細胞內(nèi)亞鐵離子增多可致ROS生成增加，進一步與細胞內(nèi)蛋白、核酸等發(fā)生反應；二是脂質(zhì)過氧化物過度累積，當細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)(Cystine/GSH/GPX4)活性下調(diào)后，多不飽和脂肪酸長鏈與過多的ROS反應，生成丙二醛(malondialdelyde，MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)等氧化產(chǎn)物，最后造成細胞膜破裂[17-19]。本研究采用線粒體形態(tài)學觀察、鐵死亡標志物檢測、過氧化產(chǎn)物測定，多類別多層次證實鐵死亡是SIC的發(fā)生機制之一，并進一步研究了天然多酚類藥物白藜蘆醇通過SIRT1/GPX4通路途徑提供心肌保護作用。

白藜蘆醇可通過抗炎、抗氧化、調(diào)控免疫、凋亡等多種生物途徑改善不同類型的心肌病變，進而對心血管系統(tǒng)起到保護作用。白藜蘆醇被認為是強有力的羥基自由基、超氧化物和金屬誘導基團的分子清除劑，可減輕ROS引起的細胞膜脂質(zhì)過氧化和DNA損傷[20]。研究發(fā)現(xiàn)，通過白藜蘆醇膳食干預可逆轉(zhuǎn)肝病小鼠中的FoxO1的乙?；黾覵IRT1水平，減輕鐵代謝異常所致肝損傷和慢性肝病發(fā)展[21]。MO等[22]用聚合納米顆粒封裝白藜蘆醇，其良好的生物相容性提高了白藜蘆醇的生物利用度，結(jié)果表明封裝后的白藜蘆醇能夠抑制由erastin誘導的HT22小鼠海馬細胞的鐵死亡，但LEE等[23]在頭頸部腫瘤的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中，使用SIRT1基因沉默或Ex527藥物處理可減輕細胞鐵死亡，從而抑制腫瘤的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，使用白藜蘆醇和SIRT誘導劑SRT1720可增加細胞鐵死亡。目前的研究并未完全闡明白藜蘆醇對鐵死亡的調(diào)控機制，因此本研究構(gòu)建SIC大鼠模型，并在該模型中進一步探究白藜蘆醇在鐵死亡進展過程中所扮演的角色。此外，白藜蘆醇是SIRT1的天然激動劑[24]，SIRT1作為依賴NAD+的去乙?；?，能修飾轉(zhuǎn)錄因子和DNA修復蛋白等在內(nèi)的50多個非組蛋白靶標，在維持組織的代謝平衡中發(fā)揮著重要功能，已被證明在膿毒癥所致的肝、腎、腦等多臟器功能障礙中起到保護作用[25-27]。在該SIC模型中，與假手術(shù)組比較，模型組SIRT1蛋白表達顯著減少，但是在CLP術(shù)后予以白藜蘆醇處理后，SIRT1蛋白表達增加，鐵死亡信號降低，心臟損傷程度也得以減輕。此外，在使用SIRT1的特異性抑制劑Ex527預處理大鼠后，白藜蘆醇對大鼠SIC的保護作用明顯減弱，這也證實SIRT1激活參與白藜蘆醇對大鼠SIC的保護機制，這可能與SIRT1能抑制鐵死亡通路相關(guān)。

谷胱甘肽過氧化酶-4(GPX4)在鐵死亡進展過程中起重要作用，它的失活可導致脂質(zhì)過氧化物的積累并導致鐵死亡[28]。鐵重鏈蛋白-1(FTH-1)表達降低說明細胞內(nèi)鐵離子儲存減少，而增多的鐵離子可能通過芬頓反應產(chǎn)生ROS，進而影響正常的細胞代謝活動。因此，GPX4和FTH-1可以一定程度上反映心肌組織鐵死亡的程度。本研究中，CLP模型組心肌GPX4、FTH-1蛋白表達均受到抑制，鐵死亡的相關(guān)信號——GSH消耗、ROS增加、脂質(zhì)過氧化也都被觀察到，這與參考文獻[29-30]中的結(jié)果一致。此外在實驗過程中，CLP模型組予以白藜蘆醇腹腔注射后，鐵死亡相關(guān)的信號受到抑制，線粒體損傷明顯減輕。之后使用SIRT1抑制劑(Ex527)阻斷SIRT1信號表達，大鼠的心臟鐵死亡程度增加，心肌損傷明顯加重。以上結(jié)果表明，鐵死亡參與了SIC的進展，且白藜蘆醇引起的SIRT1的激活可使GPX4蛋白表達水平明顯上升，起到抑制鐵死亡，減少心肌損傷的作用。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)SIRT1/GPX4信號通路抑制心肌鐵死亡，改善CLP誘導的SIC，其分子機制可能與上調(diào)GPX4蛋白表達、減少ROS積累，減輕線粒體損傷有關(guān)。本研究也存在一定局限性，第一，上述討論機制可能是白藜蘆醇對大鼠SIC的治療作用的一方面，與其他細胞死亡死亡形式，如自噬、凋亡、焦亡等協(xié)同作用值得深入研究；第二，未使用細胞或者基因敲減等方法進一步驗證加強證據(jù)鏈，是否存在其他的中間調(diào)控靶點參與SIRT1對鐵死亡的調(diào)控也需進一步闡明。