孫世東，趙文紅

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

番茄紅素(Lycopene)是來源于植物性食物的一種類胡蘿卜素，也是一種含有多不飽和鍵的異戊二烯類化合物，廣泛存在于番茄、番石榴、西瓜等植物果實中[1]。番茄紅素具有較強(qiáng)的抗氧化活性[2]，以及高效猝滅單線態(tài)氧[3]、抗癌抑癌[4]、清除過氧自由基[5]、預(yù)防心血管疾病[6]、調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊[7]、增強(qiáng)免疫力[8]等多種生理功能。但因易受光、氧、熱等因素的影響而產(chǎn)生降解損失[9]，限制了番茄紅素的工業(yè)化應(yīng)用。

復(fù)合制劑是利用物理、化學(xué)、生物等方法，將兩種或兩種以上物質(zhì)進(jìn)行復(fù)合，以達(dá)到保護(hù)其中一種物質(zhì)或提升整體價值的目的[10]。研究表明，通過復(fù)合制劑可以增強(qiáng)番茄紅素的穩(wěn)定性。李萬茸等[11]制備的β-酸-番茄紅素復(fù)合物對其中番茄紅素的光、熱、酸、堿穩(wěn)定性有積極影響；劉會曉等[12]研發(fā)的番茄紅素納米脂質(zhì)體具有良好的儲藏穩(wěn)定性；此外，番茄紅素與多糖類、蛋白類、脂類等結(jié)合制成的復(fù)合物制劑均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[13-15]。淀粉對人體血糖影響較大，而淀粉-配體復(fù)合物具有抗消化性[16]，且直鏈淀粉作為一種良好的壁材在保護(hù)功能性分子方面已得到廣泛應(yīng)用[17-18]。本課題組前期基于直鏈淀粉的回生特性制備得到直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物(ALCs)，并對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步表征[19]。本文擬對該ALCs進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，研究 O2和 N2條件下ALCs中的番茄紅素保留率和抗氧化活性，構(gòu)建其降解動力學(xué)模型以評價ALCs的氧穩(wěn)定性變化規(guī)律，以期為番茄紅素穩(wěn)定制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)與參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

直鏈淀粉(來源于土豆，標(biāo)準(zhǔn)品)、番茄紅素(純度為 90%)，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度為 96%)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)；二甲基亞砜、丙酮、HCl(純度為 36.5%)、NaOH，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；N2(純度為 98%)，鄭州新豐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；蒸餾水、ALCs，實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800-BPC 型紫外可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)；MX-S型渦旋振動器、MS-H280-Pro型磁力攪拌器，美國SCILOGEX公司產(chǎn)；YM-120S型超聲波儀，廣東潔盟電器有限公司產(chǎn)；BT-9300ST型激光粒度分析儀，丹東百特儀器有限公司產(chǎn)；AVANCE(3)400WB型超導(dǎo)(固體)核磁共振儀，德國布魯克公司產(chǎn)；BWS465-785S型便攜式拉曼光譜儀，美國BWTEK公司產(chǎn)；202-00T 型鼓風(fēng)干燥箱，上海力辰科技儀器有限公司產(chǎn)；JXDC-10 型氮氣吹掃儀，上海凈信科技儀器有限公司產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1ALCs樣品的制備參照R.Lyu 等[20]的方法,并稍作修改。稱取直鏈淀粉300 mg，均勻分散于0.4 mL無水乙醇中，加30 mL蒸餾水溶解并于95 ℃水浴5 min；取番茄紅素15 mg溶于15 mL二甲基亞砜中，于50 ℃保溫備用；將直鏈淀粉溶液降溫至50 ℃后與番茄紅素溶液混合，500 r/min 攪拌 2 h，程序降溫后放入 4 ℃冰箱冷藏 6 h；冷藏結(jié)束后1500 r/min離心 30 min，棄上清液，真空干燥沉淀，即制得ALCs樣品。所有操作均在避光、充N2環(huán)境下完成。

1.3.2 粒徑測定使用激光粒度分析儀測定樣品的粒徑大小。具體方法為：選用超純水為分散劑，向加樣口加入樣品使顆粒折射率達(dá)到1.53，隨后對樣品的顆粒粒徑進(jìn)行測定。

1.3.3 拉曼光譜測定參照劉華玲等[21]的方法，并稍作修改。將樣品放入樣品池中壓實、鋪平并密封好后，在便攜式拉曼光譜儀中進(jìn)行測試，測試條件為積分時間10 000 ms，激光功率100 mW，20倍長焦物鏡背向散射測量模式，掃描次數(shù)20次，在 180° 范圍內(nèi)搜集散射輻射，波數(shù)范圍為200～2000 cm-1，所得譜圖即為樣品的拉曼光譜圖。

1.3.4 結(jié)構(gòu)類型分布測定采用配置有CP/MAS探頭的超導(dǎo)(固體)核磁共振儀測定樣品的固體核磁共振譜(NMR)。取樣品100 mg，用模具壓實后密封置于樣品管中，將樣品管放置于儀器樣品池中，設(shè)置參數(shù)為：接觸時間13 ms，掃描速率20 Hz，掃描次數(shù)4096次，譜寬38 KHz，檢測頻率100 MHz。

為了探究樣品中無定形態(tài)、雙螺旋結(jié)構(gòu)和V-型單螺旋結(jié)構(gòu)的含量分布，根據(jù)A.Baran等[22]的方法對樣品固體NMR譜圖進(jìn)行分解。采用Microsoft Excel中的Solver工具，通過無定形亞譜(由比例因子調(diào)節(jié)并單獨確定)的強(qiáng)度確定無定形組分的貢獻(xiàn)，使得C4位點內(nèi)的特定化學(xué)位移處獲得零強(qiáng)度；原譜圖減去得到的無定形亞譜，即為有序亞譜。研究[23]表明，C4區(qū)信號同時包含無定形態(tài)和V-型單螺旋結(jié)構(gòu)信息，C4區(qū)在有序亞譜中出現(xiàn)的信號代表V-型單螺旋結(jié)構(gòu)。因此，采用Peak Fit v4.12軟件對分解得到的無序亞譜、有序亞譜進(jìn)行分峰擬合(擬合譜圖系數(shù)R2≥0.999)并計算峰面積，即可得到3種結(jié)構(gòu)的含量信息。

1.3.5ALCs中番茄紅素質(zhì)量濃度和保留率測定參照X.L.Yang等[24]的方法，并稍作修改。分別配制質(zhì)量濃度為 0 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL和15.0 μg/mL的番茄紅素丙酮溶液，用紫外分光光度計測定其在447 nm處的吸光度，每個實驗均重復(fù)3次，對實驗結(jié)果取平均值，繪制質(zhì)量濃度-吸光度圖，并進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.156 5x-0.011 3(R2=0.999 9)。稱取一定量樣品于若干試管中，分別置于O2和N2條件下，每隔一定時間取樣5 mg。將取出的樣品置于試管中，加入10 mL 丙酮，用混勻儀處理3 min，避光、4 ℃條件下超聲處理5 min，1500 r/min離心處理15 min，取上清液于比色皿中，使用紫外可見分光光度計測量其在447 nm處的吸光度。根據(jù)公式①計算其保留率。

①

式中：C0是 ALCs 中番茄紅素的初始質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)；Ct是不同時間點ALCs中番茄紅素的質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)；V0是初始ALCs萃取番茄紅素的丙酮體積/mL；Vt是不同時間點ALCs萃取番茄紅素的丙酮體積/mL；t為不同時間點/h。

1.3.6DPPH清除率測定參考P.Pakosz[25]的方法，配置0.01 mmol/L的DPPH溶液，取1 mL浸提后的溶液(浸提番茄紅素的方法同1.3.5)加入3 mL DPPH溶液中，反應(yīng)30 min后在517 nm處測定吸光度。實驗設(shè)置番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品為對照。測定完成后依據(jù)公式②計算樣品的DPPH清除率。

②

式中：A0為 DPPH 溶液(V(DPPH 溶液)∶V(丙酮)=3∶1)的吸光度；A1為無水乙醇與 ALCs 丙酮溶液(V(無水乙醇)∶V(ALCs 丙酮溶液)=3∶1)的吸光度；A2為DPPH 溶液與ALCs溶液(V(DPPH溶液)∶V(ALCs 丙酮溶液)=3∶1)混合反應(yīng)后的吸光度。

1.3.7ALCs中番茄紅素的降解動力學(xué)模型構(gòu)建參考A.Aliyu等[26]的方法，依照阿倫尼烏斯方程進(jìn)行降解動力學(xué)模型構(gòu)建。依據(jù) ALCs 中番茄紅素的質(zhì)量濃度變化分別代入零級、一級和二級降解動力學(xué)方程式進(jìn)行擬合，以研究ALCs的降解動力學(xué)行為特征。各級降解動力學(xué)方程式如下。

y0=C0-Ct=kt+b

③

④

⑤

式中：k為速率常數(shù)/(μg·(mL·h)-1)。

ALCs 中的番茄紅素經(jīng)降解動力學(xué)擬合后，根據(jù)以上公式計算其k、半衰期(T1/2)/h、十分之一衰期(T9/10)/h等降解動力學(xué)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各項指標(biāo)以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示；實驗組與對照組計量資料采用配對t檢驗，定性數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗。P<0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用 Origin 8.5和Microsoft Excel 2016 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALCs的粒徑分析

ALCs 和直鏈淀粉的粒徑分布如圖1所示，其中，D(10)、D(50)和D(90)表示各組樣品粒徑小于對應(yīng)直徑的顆粒量分別占顆粒總量的10%、50%和90%；D(1,0)，D(2,1)、D(3,2)和D(4,3)分別表示樣品的數(shù)量平均徑、長度平均徑、面積平均徑和體積平均徑；不同大寫字母表示組間具有顯著性差異(P<0.05)，不同小寫字母表示組內(nèi)具有顯著性差異(P<0.05)，下同。由圖1 可知，ALCs的D(10)、D(50)、D(90)、D(1,0)、D(2,1)、D(3,2)和D(4,3)均顯著大于直鏈淀粉(P<0.05)。ALCs的形成改變了直鏈淀粉的粒徑分布，且ALCs的粒徑大于直鏈淀粉。但有研究[27]表明，進(jìn)入直鏈淀粉空腔中的配體對直鏈淀粉的粒徑影響不大。這表明番茄紅素與直鏈淀粉形成復(fù)合物時，番茄紅素不僅進(jìn)入直鏈淀粉螺旋空腔中，還可能截留在直鏈淀粉分子間或與直鏈淀粉分子鏈纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。此外，ALCs 的D(90)和D(4,3)較大，這可能是因為出現(xiàn)顆粒黏連現(xiàn)象。綜上所述，ALCs具有較大的顆粒尺寸，且可能存在顆粒黏連現(xiàn)象。

2.2 ALCs拉曼光譜分析

ALCs 和直鏈淀粉的拉曼光譜圖如圖 2所示。由圖 2 可知，ALCs與直鏈淀粉的拉曼光譜圖較相似，因為兩者都含有相同的化學(xué)鍵，即淀粉中特有的化學(xué)鍵。ALCs的拉曼峰較弱，這是因為部分直鏈淀粉與番茄紅素形成了復(fù)合物，使得其質(zhì)量濃度有所下降。與直鏈淀粉相比，ALCs在 1 127.04 cm-1處有1個峰，此峰為番茄紅素殘基的特征吸收峰[28]，表明番茄紅素與直鏈淀粉發(fā)生了復(fù)合。

2.3 ALCs結(jié)構(gòu)類型分析

圖1 ALCs 和直鏈淀粉的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of ALCs and amylose

2.3.1ALCs的NMR譜圖解析固體NMR譜圖中峰的化學(xué)位移能夠反應(yīng)物質(zhì)短程有序的結(jié)構(gòu)信息[29]。ALCs和直鏈淀粉的固體NMR譜圖及出峰位點如圖3和表1所示。由圖3可知，ALCs和直鏈淀粉的核磁共振譜圖與經(jīng)典的淀粉核磁共振譜圖具有相似的出峰位點。其中，90～110 Hz為C1區(qū)，70～79 Hz 為 C2,3,5區(qū)，80～84 Hz 為C4區(qū)，58～65 Hz為C6區(qū)。核磁共振13C譜中存在關(guān)于淀粉結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)的信息[30]。C1區(qū)中，99～102 Hz代表淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)信息，103 Hz處的寬峰和C4區(qū)的峰代表淀粉無定形區(qū)信息。C1區(qū)的多重峰與淀粉結(jié)構(gòu)類型有關(guān)。當(dāng)C1區(qū)信號表現(xiàn)為三重峰時，表示為以麥芽三糖為最小單位的A-型淀粉顆粒折疊2次形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；當(dāng)C1區(qū)信號表現(xiàn)為雙重峰時，表示為以麥芽糖為最小單位的B-型淀粉折疊3次形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)C1區(qū)信號表現(xiàn)為單峰時，淀粉樣品內(nèi)部呈無定形態(tài)[31]。但X.T.Hu等[32]研究表明，當(dāng)C1區(qū)信號在100.3 Hz附近存在吸收時，樣品中含有V-型結(jié)構(gòu)。ALCs 中C1區(qū)信號為單峰，這表明ALCs不是 A-型和B-型。但直鏈淀粉的C1區(qū)信號為三重峰，這表明直鏈淀粉為A-型淀粉。由表 1 可知，ALCs在100.41 Hz處有吸收，即制備得到的ALCs含有V-型結(jié)構(gòu)。

2.3.2ALCs雙螺旋結(jié)構(gòu)、V型-單螺旋結(jié)構(gòu)及無定形態(tài)含量分析ALCs和直鏈淀粉的原NMR譜圖及處理后得到的無序亞譜和有序亞譜如圖4所示。采用Peak Fit軟件對ALCs和直鏈淀粉的無序亞譜和有序亞譜進(jìn)行擬合，ALCs和直鏈淀粉的無定形態(tài)、雙螺旋結(jié)構(gòu)和V-型單螺旋結(jié)構(gòu)含量見表2。由表2可知，無定形態(tài)含量排序為直鏈淀粉(56.25%)>ALCs(26.21%)；雙螺旋結(jié)構(gòu)含量排序為ALCs(55.95%)>直鏈淀粉(43.36%)；V-型單螺旋結(jié)構(gòu)含量排序為ALCs(17.84%)>直鏈淀粉(0.39%)。ALCs的3種結(jié)構(gòu)含量分布為：雙螺旋結(jié)構(gòu)>無定形態(tài)>V-型單螺旋結(jié)構(gòu)。綜上所述，直鏈淀粉包合番茄紅素形成了V-型單螺旋結(jié)構(gòu)，且番茄紅素與直鏈淀粉發(fā)生的分子鏈纏繞增加了ALCs的雙螺旋結(jié)構(gòu)含量。

圖3 ALCs和直鏈淀粉的固體NMR譜圖Fig.3 Solid-state NMR spectra of ALCs and amylose

表1 ALCs和直鏈淀粉固體NMR譜圖的出峰位點Table 1 Peak points of ALCs and amylose solid NMR spectra

2.4 ALCs中番茄紅素保留率變化分析

不同處理條件下ALCs的番茄紅素保留率變化如圖5所示。由圖5可知，在O2和N2處理條件下，隨著處理時間的延長，ALCs的番茄紅素保留率均呈降低趨勢。不同條件下處理24 h后，ALCs的番茄紅素保留率分別為(77.09±0.90)%(O2)、(85.19±0.42)%(N2)，O2處理條件下ALCs的番茄紅素保留率較低；對照組番茄紅素的保留率也表現(xiàn)出降低趨勢，不同條件下處理24 h后，番茄紅素保留率分別為(50.32±0.45)%(O2)、(59.73±0.40)%(N2)，O2處理條件下番茄紅素的保留率較低。綜上所述，兩種處理條件下，隨著處理時間的延長，ALCs中的番茄紅素逐漸降解損失，ALCs的番茄紅素氧穩(wěn)定性順序為N2>O2。由此可見，N2對ALCs中番茄紅素的影響較小，因此，應(yīng)盡可能將其在N2中保存。但ALCs中番茄紅素保留率比對照組大，這可能與ALCs特殊的包合型結(jié)構(gòu)有關(guān)。與對照組番茄紅素直接暴露在環(huán)境中不同，ALCs中的番茄紅素可與直鏈淀粉分子纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，或進(jìn)入直鏈淀粉分子螺旋空腔中[33-35]，因此該制劑化產(chǎn)品可保護(hù)其中的番茄紅素以減少其損失。以往研究也表明，制劑化產(chǎn)品可有效延緩其番茄紅素的降解損失：連小紅等[36]制備的番茄紅素β-環(huán)糊精包合物在O2條件下貯藏8 d后，番茄紅素的保留率為52.28%，而未經(jīng)包埋的番茄紅素全部損失；武花花[37]研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素/羥丙基-β-環(huán)糊精包埋物在O2中24 h后，番茄紅素保留率約為90%，而番茄紅素晶體基本被完全氧化。

圖4 ALCs和直鏈淀粉的原核磁共振譜圖及處理后得到的有序亞譜圖和無序亞譜圖Fig.4 NMR spectra of ALCs and amylose and the ordered and disordered subspectra obtained after processing

圖5 不同處理條件下ALCs的番茄紅素保留率變化Fig.5 Changes of lycopene retention in ALCs under different treatment conditions

表2 ALCs和直鏈淀粉的無定形態(tài)、雙螺旋結(jié)構(gòu)和V型-單螺旋結(jié)構(gòu)含量Table 2 Contents of amorphous, double helix and V-single helix structures of ALCs and amylose

2.5 ALCs的抗氧化活性變化分析

不同處理條件下ALCs的抗氧化活性如圖6所示。由圖6可知，在兩種處理條件下，ALCs與對照組番茄紅素的DPPH清除率均呈下降趨勢，且ALCs表現(xiàn)出比對照組更強(qiáng)的抗氧化活性。由圖6a)可知，在O2處理條件下，ALCs和對照組的DPPH清除率從最初的(49.35±0.00)%(0 h)分別顯著降至(33.24±0.03)%和(16.32±0.09)%(24 h)(P<0.01)，這表明ALCs在O2環(huán)境中能有效保持番茄紅素的抗氧化活性。由圖6b)可知，在N2處理條件下，ALCs和對照組的DPPH清除率均呈下降趨勢；ALCs和對照組的DPPH清除率從最初的(49.35±0.00)%(0 h)分別顯著降至(35.74±0.01)%和(17.20±0.00)%(24 h)(P<0.01)，這表明ALCs在N2環(huán)境中能更好地保持番茄紅素的抗氧化活性。

綜上所述，隨著處理時間的延長，ALCs在O2和N2環(huán)境中的抗氧化活性逐漸降低，但降低程度不同。在處理終點時，ALCs的DPPH清除率分別降低了32.64%(O2)和27.57%(N2)，N2環(huán)境中的降幅相對較小。ALCs的抗氧化活性比對照組強(qiáng)，表明O2對ALCs的抗氧化活性影響更大；番茄紅素與直鏈淀粉復(fù)合形成ALCs后，能更好地保持其抗氧化活性。這可能與ALCs中番茄紅素的質(zhì)量濃度有關(guān)。王記蓮[38]研究發(fā)現(xiàn)，隨著番茄紅素質(zhì)量濃度的升高，DPPH的清除率逐漸升高。而直鏈淀粉具有特殊的螺旋結(jié)構(gòu)，在施加的外力(熱處理、溶劑處理、超高壓等)作用下，其分子內(nèi)氫鍵相互作用，鏈狀結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)，形成了疏水性的左手螺旋空腔結(jié)構(gòu)，這時番茄紅素便可借助疏水作用力進(jìn)入直鏈淀粉的螺旋空腔與其復(fù)合[39]，進(jìn)而起到對番茄紅素有效的保護(hù)作用。

2.6 ALCs中番茄紅素的降解動力學(xué)模型分析

ALCs和番茄紅素在不同處理條件下的番茄紅素質(zhì)量濃度變化見表3。不同處理條件下ALCs的降解動力學(xué)擬合圖如圖7所示，其中y0、y1、y2分別為零級、一級、二級降解動力學(xué)擬合方程式。由圖7可知，在O2和N2處理條件下，ALCs和番茄紅素的二級動力學(xué)擬合R2均最大，符合二級降解動力學(xué)模型。

圖6 不同處理條件下ALCs的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant properties of ALCs under different treatment conditions

表3 ALCs 和番茄紅素在不同處理條件下的番茄紅素質(zhì)量濃度變化Table 3 Changes of lycopene content of ALCs and lycopene under different treatment conditions

不同處理條件下ALCs的降解動力學(xué)擬合參數(shù)見表4。由表4可知，ALCs在不同處理條件下的番茄紅素T1/2大小順序為O2(86.94 h)O2。番茄紅素的T1/2和T9/10均較短，這是因為ALCs能延緩其中番茄紅素的損失，從而延長其衰期，這與直鏈淀粉與番茄紅素形成的包合型結(jié)構(gòu)相關(guān)。與番茄紅素完全暴露在環(huán)境中不同，ALCs中的番茄紅素一部分進(jìn)入了直鏈淀粉的疏水螺旋空腔，一部分與直鏈淀粉分子鏈纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種復(fù)合結(jié)構(gòu)對番茄紅素形成了空間保護(hù)。因此，ALCs中的番茄紅素降解較緩慢，制劑化后的ALCs具有更好的氧穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文通過激光粒度分析、拉曼光譜和NMR對ALCs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，研究了ALCs 中番茄紅素的保留率和抗氧化活性變化，并構(gòu)建了番茄紅素降解動力學(xué)模型。結(jié)果表明：直鏈淀粉包合番茄紅素形成了V-型螺旋結(jié)構(gòu)，且番茄紅素與直鏈淀粉發(fā)生了分子鏈纏繞使ALCs的雙螺旋含量增加。ALCs的氧穩(wěn)定性順序為O2

圖7 不同處理條件下ALCs的降解動力學(xué)擬合圖Fig.7 Fitting diagram of degradation kinetics of ALCs under different treatment conditions

表4 不同處理條件下ALCs的降解動力學(xué)擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of degradation kinetics of ALCs under different treatment conditions