劉智程 吳德 屈愛娜 王璐璐

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)康復(fù)中心，安徽 合肥 230022）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種以社交和溝通障礙、重復(fù)刻板行為及狹窄興趣為核心癥狀的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。近年來，全球范圍內(nèi)ASD患病率快速上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年美國(guó)8歲兒童中每44人就有1人患ASD［1］。2020年，我國(guó)6～12歲兒童ASD患病率為7‰［2］。目前，典型ASD尚無有效的治療方法，給患兒家庭和社會(huì)帶來了巨大負(fù)擔(dān)。

ASD的病因尚不清楚，臨床實(shí)踐觀察到近一半ASD兒童共患便秘、腹瀉等胃腸道問題，因此，有研究者認(rèn)為微生物-腸-腦軸（microbiota-gutbrain axis，MGBA）紊亂可能與ASD發(fā)病相關(guān)。已有為數(shù)不多的研究發(fā)現(xiàn)，ASD兒童腸道菌群的多樣性或結(jié)構(gòu)與正常發(fā)育（typically developing，TD）兒童不同，但具體研究結(jié)果并不統(tǒng)一。Lou等［3］及Kang等［4］研究均表明ASD兒童腸道菌群的多樣性降低；Finegold等［5］研究則顯示ASD兒童腸道菌群的多樣性升高；此外，也有研究報(bào)道ASD兒童腸道菌群的α多樣性無明顯變化［6］。這些研究均基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類的方法進(jìn)行物種注釋，其物種注釋和多樣性分析的準(zhǔn)確性均低于基于擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）的分析方法。本研究采用基于ASVs進(jìn)行物種注釋的16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，前瞻性地分析ASD兒童腸道菌群的分布及多樣性特征，并預(yù)測(cè)分析2組菌群代謝功能的差異，為進(jìn)一步探索兒童ASD與腸道菌群的相關(guān)性，以及ASD的微生態(tài)療法提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)康復(fù)中心門診確診為ASD的30例兒童納入ASD組，同時(shí)招募20例TD兒童作為對(duì)照（TD組）。ASD組需符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版中ASD的 診 斷 標(biāo) 準(zhǔn)［7］，且 兒 童 孤 獨(dú) 癥 評(píng) 定 量 表（Childhood Autism Rating Scale，CARS）評(píng) 分≥30分。此外，2組需符合以下共同的納排標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤12歲；（2）監(jiān)護(hù)人同意此研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）早產(chǎn)及過期產(chǎn)兒童；（2）有神經(jīng)系統(tǒng)或遺傳代謝性疾病史；（3）有消化道畸形或消化道手術(shù)史；（4）合并胃腸道急慢性感染；（5）有糞便采樣前1個(gè)月內(nèi)抗生素、微生態(tài)制劑、質(zhì)子泵抑制劑或激素類藥物使用史。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PJ2021-14-10）。

1.2 基本信息

受試者主要監(jiān)護(hù)人填寫問卷，包括受試者年齡、性別、出生方式和喂養(yǎng)方式、居住環(huán)境及嬰兒期抗生素使用史等基本信息。

1.3 樣本采集與保存

收集2組兒童上午10時(shí)之前的新鮮糞便2～3 g于無菌采樣管中，立即低溫轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱保存。

1.4 DNA提取、文庫制備及測(cè)序

采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）提取樣本DNA，采用NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）分光光度計(jì)測(cè)定DNA數(shù)量和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。利用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）PCR擴(kuò) 增16S rDNA V4區(qū)。用AMPure XP Beads（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）試劑盒純化PCR產(chǎn)物，使用Qubit（Thermofisher，Qubit 4.0）進(jìn)行文庫定量。采用Illumina NovaSeq6000平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。使用Vsearch 2.4.4組裝拼接雙端序列，質(zhì)控并過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列或PCR錯(cuò)誤等，再經(jīng)過Vsearch 2.15.0去重、降噪、去嵌合體等步驟得到ASVs，樣本中含量低于總序列0.001%的ASVs將被去除。通過Qiime2基于Silva138數(shù)據(jù)庫對(duì)ASVs的代表序列進(jìn)行物種注釋。

1.5 生物信息學(xué)分析

主要使用Qiime2和R包3.2.0對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用Qiime2計(jì)算α多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon和Simpson）評(píng)估物種的豐富度和均勻度。繪制稀釋性曲線評(píng)價(jià)測(cè)序深度是否合理。采用Anosim分析檢驗(yàn)組間差異是否顯著大于組內(nèi)，從而判斷分組是否有意義。采用基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析（principal component analysis，PCoA）評(píng)估組間物種組成差異。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析選取2組樣本在各分類水平上的差異物種。采用線性判別影響大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析方法篩選組間生物標(biāo)志物（即差異顯著物種）。構(gòu)建隨機(jī)森林模型對(duì)樣本進(jìn)行分類預(yù)測(cè)，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線驗(yàn)證模型的可靠性。采用Bugbase軟件預(yù)測(cè)菌群表型特征?；赑icrust2 2.3.0-b軟件預(yù)測(cè)菌群代謝功能。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較使用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組兒童基本信息比較

ASD組和TD組兒童入組年齡、性別、出生方式、喂養(yǎng)方式、嬰兒期抗生素使用史、鄉(xiāng)村居住史及寵物喂養(yǎng)史方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2組兒童基本信息比較

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

測(cè)序讀長(zhǎng)范圍245～292 bp。50例樣本測(cè)序得到總有效序列數(shù)為6 428 113。測(cè)得樣本序列數(shù)最小為107 491，均數(shù)為128 562。稀釋性曲線顯示測(cè)序深度合理，見圖1。得到ASVs總數(shù)為1 354，其中146個(gè)為ASD組特有，40個(gè)為TD組特有。

圖1 ASVs稀釋性曲線 曲線趨于平緩，提示測(cè)序深度已基本覆蓋樣本中所有物種。

2.3 物種多樣性分析

α多樣性指數(shù)中Chao1指數(shù)反映物種豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)均反映物種的豐富度和均勻 度。ASD組 和TD組 樣 本Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 2組兒童腸道菌群α多樣性分析［M（P25，P75）］

β多樣性分析利用不同樣本的豐度變化或進(jìn)化關(guān)系來計(jì)算樣本間距離，從而反映樣本或組間微生物組成的相似性。Anosim分析可判斷分組是否有意義，R＞0說明組間差異大于組內(nèi)，P值說明了差異的顯著性。PCoA是一種非約束性數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性?；诜羌訖?quán)UniFrac距離的Anosim及PCoA分析顯示，2組兒童腸道菌群的分布不同，見圖2。

圖2 非加權(quán)UniFrac距離Anosim分析（A）和PCoA組間差異分析（B） A：Between代表組間差異，ASD、TD分別表示各組內(nèi)差異；圖中各箱線圖的凹槽互不重疊，說明各組中位數(shù)差異顯著。B：每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，點(diǎn)間距反映樣本相似性；圖中ASD組和TD組散點(diǎn)部分分離，提示2組間存在一定差異。

2.4 物種分布及差異分析

ASVs經(jīng)物種注釋共得到8門、12綱、26目、44科、107屬。ASD組和TD組樣本中相對(duì)豐度位列前四的菌門相同，依次為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，這4種菌門的總豐度在各組中占比均超過99%，其中厚壁菌門和擬桿菌門總豐度在各組中占比均超過89%。2組樣本中相對(duì)豐度位列前三的菌屬均為擬桿菌屬、糞桿菌屬和雙歧桿菌屬。在門和綱水平，2組樣本的菌群分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在屬水平，ASD組中有6個(gè)菌屬的相對(duì)豐度大于TD組，分別為巨單胞菌屬（P＜0.001）、巴恩斯氏菌屬（P=0.004）、小桿菌屬（P=0.006）、巨球菌屬（P=0.020）、瘤胃球菌屬扭鏈群（P=0.028）及梭桿菌屬（P=0.040）。2組樣本屬水平主要菌群構(gòu)成見圖3。

圖3 2組樣本屬水平物種相對(duì)豐度分布圖 右側(cè)圖例列出了屬水平相對(duì)豐度位列前十的物種名稱，其余物種歸為“其他”。

2.5 LEfSe篩選組間生物標(biāo)志物

應(yīng)用LEfSe分析方法選取各組優(yōu)勢(shì)物種，即組間生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，ASD組的優(yōu)勢(shì)物種為巨單胞菌屬、小桿菌屬、巨球菌屬、消化鏈球菌科、巴恩斯氏菌屬、瘤胃球菌屬扭鏈群及鏈型桿菌屬等；TD組優(yōu)勢(shì)物種為毛螺菌科、消化球菌科、Saccharimonadaceae、TM7x、阿里松氏菌屬、帕拉普氏菌屬、乳桿菌目_g_P5D1_392及Saccharimonadales等。見圖4。

圖4 LEfSe分析篩選各組生物標(biāo)志物 柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異顯著物種的影響大?。↙DA score），其絕對(duì)值大于預(yù)設(shè)值（默認(rèn)為2）表示該物種為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志物。

2.6 隨機(jī)森林組間預(yù)測(cè)

構(gòu)建隨機(jī)森林模型對(duì)ASD組和TD組樣本進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示以巨單胞菌屬、罕見小球菌屬及小桿菌屬等屬水平細(xì)菌為特征可以較準(zhǔn)確地區(qū)分2組樣本（錯(cuò)誤率為30.83%），其中巨單胞菌屬對(duì)分類預(yù)測(cè)的效果影響最大，見圖5。繪制ROC曲線評(píng)估隨機(jī)森林分類模型的優(yōu)劣，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.82，說明該模型分組預(yù)測(cè)具有一定的準(zhǔn)確性，見圖6。

圖5 隨機(jī)森林物種重要性點(diǎn)圖 橫坐標(biāo)（平均準(zhǔn)確度下降）代表重要性水平，縱坐標(biāo)為模型中對(duì)分類效果起主要作用的菌屬，按作用從大到小排列。

圖6 評(píng)估隨機(jī)森林分類模型的ROC曲線 AUC越接近于1，分類結(jié)果越準(zhǔn)確；AUC在0.7～0.9時(shí)，分類結(jié)果有一定準(zhǔn)確性。縱坐標(biāo)（靈敏度）越高代表分類的準(zhǔn)確率越高，橫坐標(biāo)（1-特異度）越低代表誤判率越低，曲線越靠近左上角，說明模型的分類效果越好。

2.7 菌群表型特征預(yù)測(cè)

ASD組和TD組兒童腸道菌群的表型，如革蘭陽性、革蘭陰性、生物膜形成、致病性、移動(dòng)元件含量、氧需求及氧化脅迫耐受等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 2組兒童腸道菌群表型特征預(yù)測(cè)分析［M（P25，P75）］

2.8 菌群功能預(yù)測(cè)分析

ASD組菌群的細(xì)胞內(nèi)吞、鞘糖脂生物合成-乳糖和新乳糖系列代謝途徑的豐度較TD組高（P值分別為0.031、0.018）；而ASD組非同源末端連接代謝途徑的豐度較TD組低（P=0.009）。

為了進(jìn)一步發(fā)掘樣本中與腸-腦軸模塊相關(guān)的代謝信息，將測(cè)序數(shù)據(jù)基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋，并將注釋信息轉(zhuǎn)化為腸道代謝模塊和腸-腦軸模塊的分析結(jié)果。腸道代謝模塊分析顯示，ASD組菌群的谷氨酸降解Ⅰ（MF0030）、色氨酸降解（MF0025）、異化性硝酸鹽還原（MF0101）、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（MF0072）、甘油降解Ⅱ（MF0061）及丁酸鹽生成Ⅱ（MF0089）等代謝功能的豐度較TD組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.002、0.008、0.029、0.036、0.042、0.046）。腸-腦軸模塊分析顯示，ASD組菌群的谷氨酸降解Ⅰ（MGB050）、色氨酸降解（MGB049）、多巴胺降解（MGB023）及丁酸鹽生成Ⅱ（MGB053）等代謝功能的豐度較TD組低（P值分別為0.002、0.008、0.022、0.046），γ-氨 基 丁 酸 降 解（MGB019）功能的豐度較TD組高（P=0.006）。見圖7～8。

圖7 腸道代謝模塊菌群功能預(yù)測(cè) MF0030：谷氨酸降解Ⅰ；MF0025：色氨酸降解；MF0101：異化性硝酸鹽還原；MF0072：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體；MF0061：甘油降解Ⅱ；MF0089：丁酸鹽生成Ⅱ。ASD組和TD組各指標(biāo)的比較均P＜0.05。

圖8 腸-腦軸模塊菌群功能預(yù)測(cè) MGB050：谷氨酸降解Ⅰ；MGB019：γ-氨基丁酸降解；MGB049：色氨酸降解；MGB023：多巴胺降解；MGB053：丁酸鹽生成Ⅱ。ASD組和TD組各指標(biāo)的比較均P＜0.05。

3 討論

腸道菌群是人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的主要成分，數(shù)量約為人體細(xì)胞總數(shù)的10倍，被稱為人體的“第二基因組”［8］。腸道菌群參與人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、維生素合成、腸道黏膜生物屏障形成、免疫系統(tǒng)成熟及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等多種生理活動(dòng)，進(jìn)而影響人體多系統(tǒng)功能［9］。研究表明，腸道菌群可能對(duì)腦功能有重要影響，并且與ASD密切相關(guān)［10］。

多數(shù)相關(guān)研究表明，ASD兒童腸道菌群的α多樣性較健康兒童低［4］。而本研究則顯示，2組樣本的α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon及Simpson比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本數(shù)量少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)2組樣本菌群結(jié)構(gòu)存在差異，屬水平共發(fā)現(xiàn)6個(gè)差異顯著物種，分別為巨單胞菌屬、巴恩斯氏菌屬、小桿菌屬、巨球菌屬、瘤胃球菌屬扭鏈群及梭桿菌屬。

關(guān)于ASD兒童腸道巨單胞菌屬含量的研究報(bào)道并不一致，部分研究結(jié)果相反［11］。Zou等［12］發(fā)表ASD兒童腸道巨單胞菌屬的含量增多，與本研究相同。巨單胞菌屬在腸道可以將葡萄糖發(fā)酵成乙酸和丙酸，用于合成脂質(zhì)和膽固醇，也是宿主的能量來源之一［13］。此外，該菌屬在肥胖者腸道中含量增多［14］。趙銳豪等［15］發(fā)現(xiàn)巴恩斯氏菌屬是ASD兒童腸道的優(yōu)勢(shì)菌群之一，與本研究結(jié)果相似。另一項(xiàng)研究表明，相較于TD兒童，合并便秘的ASD兒童腸道巴恩斯氏菌屬的豐度升高［16］。也有研究顯示，ASD兒童腸道巴恩斯氏菌屬的平均豐度降低［17］。巴恩斯氏菌屬可競(jìng)爭(zhēng)性抑制人體腸道致病菌，并與免疫調(diào)節(jié)及炎癥性疾病相關(guān)［18-20］。但該菌屬與ASD的具體相關(guān)性仍不清楚，需進(jìn)一步探索。研究顯示ASD患者腸道中小桿菌屬的含量降低［11］。而本研究結(jié)果卻與之相反，這可能與采用的統(tǒng)計(jì)方法不同或本研究樣本量小有關(guān)。研究表明，對(duì)食物過敏的兒童腸道小桿菌屬的含量降低［21］。因此，研究ASD與小桿菌屬之間關(guān)系時(shí)尚需考慮過敏因素。研究顯示ASD兒童腸道巨球菌屬的含量增多［11］，與本研究結(jié)果相同。而一項(xiàng)病例對(duì)照研究則顯示，ASD男孩腸道中巨球菌屬的豐度降低［22］。ASD兒童腸道巨球菌屬的豐度是否受性別影響需進(jìn)一步驗(yàn)證。巨球菌屬可利用乳酸產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸［23］。此外，肥胖者腸道中該菌屬的含量增多［24］。然而，巨球菌屬是否參與ASD的病理過程仍未可知。本研究中，與TD兒童相比，ASD兒童腸道瘤胃球菌屬扭鏈群的相對(duì)豐度升高，這與Ahmed等［25］研究結(jié)果相似。一項(xiàng)前瞻性研究顯示，早期兒童腸道扭鏈瘤胃球菌的相對(duì)豐度與ASD兒童社交反應(yīng)量表-2得分呈負(fù)相關(guān)［26］。可見，扭鏈瘤胃球菌與ASD具有相關(guān)性。本研究顯示，ASD兒童腸道梭桿菌屬的相對(duì)豐度升高。有研究表明，相較于TD兒童，有便秘癥狀的ASD兒童腸道梭桿菌屬含量增多［15］；母體免疫激活子代大鼠的腸道梭桿菌屬豐度升高，并與重復(fù)行為和焦慮樣癥狀相關(guān)［27］。由此可見，ASD可能與腸道梭桿菌屬之間存在相關(guān)性。

盡管多數(shù)相關(guān)研究均認(rèn)為ASD與腸道菌群密切相關(guān)，但進(jìn)一步探索二者之間因果關(guān)系的研究卻很少。相關(guān)研究多傾向于認(rèn)為腸道菌群異?？赡軈⑴c了ASD的病理過程，雖然具體機(jī)制尚不明確，但目前較統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)是基于MGBA理論。這一理論認(rèn)為，微生物及其代謝產(chǎn)物可通過神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)免疫及神經(jīng)通路等途徑影響腦功能［28］。結(jié)合本研究，我們不僅發(fā)現(xiàn)ASD兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)上的異常，而且通過功能預(yù)測(cè)分析還發(fā)現(xiàn)，ASD兒童腸道菌群的代謝功能與TD兒童相比存在顯著差異，如丁酸鹽生成，色氨酸、谷氨酸及γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)的降解功能等，而這些物質(zhì)均對(duì)腦功能有重要影響。因此，腸道菌群異?？赡芡ㄟ^MGBA介導(dǎo)神經(jīng)炎癥、免疫異常及神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等病理過程，進(jìn)而參與ASD的發(fā)生與發(fā)展。

本研究采用了高通量16S rDNA測(cè)序技術(shù)，創(chuàng)新之處在于使用了去噪方法獲得ASVs，基于ASVs的物種注釋相較于以往的OTUs聚類更加準(zhǔn)確，且與其他研究的ASVs數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，更具可比性和一致性。本研究也存在不足之處：首先，樣本量相對(duì)較小，針對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行多組分析較困難；其次，未對(duì)血液及糞便代謝組學(xué)進(jìn)行檢測(cè)分析，以驗(yàn)證基于擴(kuò)增子測(cè)序?qū)δc道菌群代謝功能預(yù)測(cè)的結(jié)果。期望以后的研究采用大樣本、考慮多因素并使用代謝組學(xué)等更完善的研究方法更加深入地探究腸道菌群與ASD的關(guān)系。

綜上所述，ASD兒童和TD兒童腸道菌群的構(gòu)成存在顯著差異，臨床實(shí)踐中通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)以改善微生態(tài)可能有助于ASD兒童獲得更好的預(yù)后；預(yù)測(cè)2組兒童腸道菌群的代謝功能存在顯著不同，其中腸道菌群的丁酸鹽生成、谷氨酸及γ-氨基丁酸降解等代謝功能可能是未來相關(guān)研究需關(guān)注的重點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。