陳冠宇，閆朝輝，王躍進

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)園藝作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

歐亞葡萄品種（Vitis viniferaL.）是當(dāng)今世界栽培范圍最廣、面積最大的果樹之一，但易感白粉病、霜霉病、灰霉病等真菌性病害。生產(chǎn)中大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害的流行，不僅增加了生產(chǎn)成本[1]，還造成環(huán)境污染。因此，利用野生抗性材料選育抗病品種是葡萄育種的目標(biāo)之一。

白藜蘆醇最早從毛葉藜蘆（Veratrum grandiflorumLoes.）中被分離鑒定[2]，之后證明具有植保素的功能[3-4]，且廣泛存在于植物中[5]，在葡萄中含量較高[6]。同時，白藜蘆醇還具有抗癌、抗氧化、抗衰老和抗病毒作用，有益于人體健康，因而在葡萄上研究報道很多[6]。在植物體中，白藜蘆醇是通過苯丙烷類代謝途徑中的芪合酶合成[7]，有多種存在形式，不僅包括順反異構(gòu)體，經(jīng)過白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶、甲氧基轉(zhuǎn)移酶、漆酶、細胞色素P450酶CYP1B1催化，生成糖基化的云杉新苷、甲基化的紫檀芪、寡聚化的葡萄素和羥基化的白皮杉醇[8]。反式白藜蘆醇相較于順式白藜蘆醇擁有更強的生物活性，但仍不及紫檀芪和ε-葡萄素[9-10]。高濃度的紫檀芪和葡萄素積累會對植物有害，而作為主要儲存形式的云杉新苷，幾乎沒有抗菌作用[11]。β-糖基水解酶可以通過水解糖苷鍵而發(fā)揮抗病作用[12-13]，歐亞葡萄品種中β-糖基水解酶Ⅰ家族共包含38個基因。

Yan等[14]在接種葡萄白粉病菌 [Uncinula necator(Schw.) Burr.]條件下，對中國野生毛葡萄丹鳳-2中的38個基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)VqBGH40a基因可以持續(xù)響應(yīng)白粉菌的侵染，在接種后第5天達到表達峰值，進一步利用同源克隆技術(shù)分離獲得了VqBGH40a，離體條件下VqBGH40a可以將植物體內(nèi)不具有抗菌作用的反式云杉新苷水解為具有抗菌活性的反式白藜蘆醇，從而參與到葡萄的抗病反應(yīng)中。

本研究通過分析9份葡萄材料的糖基水解酶基因VqBGH40a在葡萄白粉菌誘導(dǎo)下的表達以及白藜蘆醇含量變化，研究VqBGH40a表達是否可以增加白藜蘆醇含量，以探索供試材料在接種的白粉菌誘導(dǎo)下，葡萄體內(nèi)反式云杉新苷降解為反式白藜蘆醇的次生代謝變化在抗病過程中的作用及其之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料情況

供試材料共9份，包括中國野生華東葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1，歐亞種‘佳利釀’，二者的子代6-12-1、6-12-3、6-12-4、6-12-7；中國野生毛葡萄（V. quinquangularis）株系83-4-96，歐亞種‘粉紅玫瑰’以及二者的子代‘1-9-6’。所有材料定植于陜西省咸陽市楊陵區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃內(nèi)（108°4'27.95" E，34°16'56.24" N），籬壁架整形，中短梢修剪。

1.2 田間白粉病抗性評價

調(diào)查于2021年與2022年的6—8月進行。在白粉病發(fā)病感染后，根據(jù)整個葉面積上病變面積占總面積的百分比分為8個等級，再將分級結(jié)果統(tǒng)計，換算成感病指數(shù)[15]，換算公式如下：

感病指數(shù)（%）＝∑(等級值×該等級的葉片數(shù))/(最高等級值×調(diào)查總?cè)~片數(shù))×100

根據(jù)感病程度將感病指數(shù)分為5個等級：1級，未感病或免疫；2級，高抗；3級，抗病；4級，感?。?級，高感。對應(yīng)的感病指數(shù)分別為：0、0.1%～5.0%、5.1%～25.0%、25.1%～50.0%、50.1%～100.0%。

1.3 田間葡萄人工接種白粉菌

采用濕壓片法對葉片接種白粉菌[16]。采摘田間布滿新鮮白粉菌孢子的葡萄葉片，壓在預(yù)先使用無菌水噴霧且無明顯露點的健康幼葉上3～5 s，然后分開，側(cè)面觀察葉片可見明顯孢子后套袋，對照組則使用健康葉片壓片。在接種后0、1、4、7 d采集人工接種白粉菌處理（PM）與對照組（MOCK）的葉片，立即用錫箔紙包裹放入液氮中速凍，放置于﹣80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.4 總RNA提取與實時熒光定量PCR

總RNA提取參考Plant RNA Kit說明書（Omega R6827）。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA方法參照Evo M-MLVRT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR說明書（Accurate Biotechnology AG11728）。按照SYBR? Green PremixPro TaqHS qPCR Kit（Accurate Biotechnology AG11701）說明書配置qPCR反應(yīng)體系。使用實時熒光定量PCR（Applied Biosystems Step One Plus）與2﹣??CT法[17]分析BGH40a基因相對表達量[14]，以葡萄GAPDH（XM_002278316.4）作為內(nèi)參基因（表1），引物由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)并進行3次技術(shù)重復(fù)。

表1 試驗所用引物Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.5 芪類物質(zhì)的提取與測定

葡萄葉片經(jīng)真空冷凍干燥機（Christ Alpha 2-4 LSC basic）干燥50 h后，加入色譜級甲醇（1∶10，W∶V）4 ℃避光條件過夜靜置抽提，取上清液使用0.22 μm濾膜過濾待測[18]。

反式云杉新苷使用SunFire? C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，Waters Acquity Arc檢測。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為色譜級乙腈。洗脫程序為0 min，80%A；0.7 min，80%A；20 min，25%A；22 min，0%A；24 min，80%A；30min，80%A。流速為1.5 mL·min-1，檢測波長306 nm，柱溫40 ℃，進樣量為10 μL[19]。

反式白藜蘆醇使用ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×50 mm，1.8 μm）分離，Agilent 1290 Infinity Ⅱ-6470檢測，采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描模式（MRM）。流動相與反式云杉新苷檢測相同。洗脫程序為：0 min，80%A；0.8 min，80%A；1.5 min，20%A；2.5 min，80%A，3.5 min，80%A。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，上樣量為2 μL。母離子227.24，子離子226.7，碎裂電壓130 V，碰撞能量10 eV[20]。使用反式云杉新苷和反式白藜蘆醇標(biāo)準品（上海源葉）確認保留時間，根據(jù)保留時間與峰面積進行定性和定量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖表繪制。使用IBM SPSS 26對數(shù)據(jù)進行多重比較，采用單因素ANOVA檢驗LSD方法（*p<0.05; **p<0.01）。使用IBM SPSS 26對數(shù)據(jù)進行皮爾遜相關(guān)性分析（*p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然條件下田間抗病性鑒定

自然條件下，所有材料的感病指數(shù)及抗病性鑒定結(jié)果見表2。其中，4個材料表現(xiàn)抗病，包括白河-35-1、6-12-1、83-4-96、‘1-9-6’，感病指數(shù)介于19.57%～24.60%，被劃分為抗病3級，其余均表現(xiàn)為感病，感病指數(shù)為31.67%～48.29%。華東葡萄白河-35-1感病指數(shù)最低，為19.57%，表現(xiàn)為抗??；而‘佳利釀’的感病指數(shù)最高，為48.29%，表現(xiàn)為感病，二者的4個子代感病指數(shù)介于雙親之間，呈現(xiàn)為親中值，其中6-12-1表現(xiàn)出抗病性狀，而6-12-3、6-12-7和6-12-4表現(xiàn)型為感病。83-4-96和‘粉紅玫瑰’雜交組合中，子代‘1-9-6’的感病指數(shù)是23.14%，屬于抗病類型，與其親本83-4-96相似。

表2 供試葡萄材料葉片田間條件下白粉病抗性鑒定Table 2 Identification of the resistance to Uncinula necator of grapevine leaves under field conditions

2.2 葡萄材料中BGH40a基因差異性表達

利用qRT-PCR分析供試9個葡萄材料中VqBGH40a在白粉菌誘導(dǎo)下的差異表達。結(jié)果表明，VqBGH40a在不同材料中表達不同，總體表現(xiàn)出抗病材料中的表達上調(diào)趨勢（圖1、圖2）。其中，6-12-3、6-12-4、83-4-96中存在上調(diào)表達，特別是83-4-96在接種白粉菌后4 d上調(diào)17.7倍，其次是6-12-4接種白粉菌后7 d上調(diào)11.9倍。在‘粉紅玫瑰’‘1-9-6’、白河-35-1、‘佳利釀’、6-12-1、6-12-7接種白粉菌后0、1、4、7 d均為下調(diào)表達。

圖1 雜交組合‘白河-35-1×佳利釀’及其子代BGH40a在白粉菌誘導(dǎo)下差異表達Figure 1 Differential expression analysis of the BGH40a from cross combination 'Baihe-35-1×Carigane' and their progeny using artificial inoculation by Uncinula necator

圖2 雜交組合‘83-4-96×粉紅玫瑰’及其子代BGH40a在白粉菌誘導(dǎo)下差異表達Figure 2 Differential expression analysis of the BGH40a from cross combination '83-4-96×Muscat Rose' and their progeny using artificial inoculation by Uncinula necator

2.3 BGH40a基因差異性表達的芪類物質(zhì)含量變化

在接種白粉菌條件下，伴隨著VqBGH40a在白粉菌誘導(dǎo)下的差異表達，供試材料葉片中反式云杉新苷的降解與反式白藜蘆醇含量增加的變化趨勢見表3、表4。從總體上，在接種白粉菌后隨著時間推延，出現(xiàn)糖基水解酶對反式云杉新苷降解的趨勢，而對應(yīng)的反式白藜蘆醇含量表現(xiàn)出不同程度的增加，即一減一增相反的變化趨勢。接種白粉病菌處理下，毛葡萄83-4-96的后代‘1-9-6’中反式白藜蘆醇含量也是在減少，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是‘1-9-6’的反式云杉新苷降解后的產(chǎn)物不僅是白藜蘆醇一種物質(zhì)，而且有葡萄素增加（研究結(jié)果未展現(xiàn)），這是下一步需要探索的問題。感病葡萄中，反式云杉新苷含量下降，特別是‘佳利釀’中出現(xiàn)大幅下降，但反式白藜蘆醇含量沒有出現(xiàn)增加趨勢，這個結(jié)果可能是‘佳利釀’的糖基水解酶基因功能差異導(dǎo)致?？共∑咸阎谐缀?35-1外，其他材料的糖基水解酶基因較好的表達，使得反式云杉新苷含量下降的同時，反式白藜蘆醇含量上升到了較高的水平。

表3 雜交組合‘白河-35-1×佳利釀’及其子代在接種白粉菌條件下BGH40a表達過程中反式云杉新苷和反式白藜蘆醇含量變化Table 3 Changes of the content of trans-piceid and trans-resveratrol in the process of BGH40a expression from cross combination'Baihe-35-1×Carignan' and their progeny using artificial inoculation by Uncinula necator μg·g-1 DW

表4 ‘83-4-96×粉紅玫瑰’及其子代接種白粉菌BGH40a表達過程中反式云杉新苷與反式白藜蘆醇含量變化Table 4 Changes in the content of trans-piceid and trans-resveratrol in the process of BGH40a expression from cross combination'83-4-96 ×Muscat Rose' and their progeny using artificial inoculation by Uncinula necator μg·g-1 DW

2.4 葡萄材料的感病指數(shù)與云杉新苷變化量的相關(guān)性

對兩個葡萄雜交組合及后代的感病指數(shù)與芪類物質(zhì)含量的相關(guān)性進行分析。其中‘白河-35-1×佳利釀’雜交組合中感病指數(shù)與反式云杉新苷含量呈現(xiàn)出正相關(guān)（0.561），與反式白藜蘆醇含量呈現(xiàn)出負相關(guān)（﹣0.197）；反式云杉新苷和反式白藜蘆醇之間的相關(guān)性為﹣0.114。而在‘83-4-96×粉紅玫瑰’雜交組合中，反式云杉新苷與抗病指數(shù)相關(guān)性為﹣0.006，反式白藜蘆醇與感病指數(shù)相關(guān)性為﹣0.856，但是反式云杉新苷與反式白藜蘆醇相關(guān)性為0.324（表5、表6）。

表5 ‘白河-35-1×佳利釀’及其子代感病指數(shù)和芪類物質(zhì)含量相關(guān)性Table 5 Correlation analysis of index of susceptibility and contents of stilbene in cross combination'Baihe-35-1×Carignan' and their progeny

表6 ‘83-4-96×粉紅玫瑰’及其子代感病指數(shù)和芪類物質(zhì)含量相關(guān)性Table 6 Correlation analysis of index of susceptibility and contents of stilbene in cross combination'83-4-96×Muscat Rose' and their progeny

3 討論與結(jié)論

糖基水解酶廣泛分布于所有植物體中，通過水解葡萄糖苷在生物代謝過程中發(fā)揮作用[21]。目前，已在多種植物中報道了糖基水解酶的功能，包括擬南芥[22]、水稻[13]、玉米[12]、棉花[23]、葡萄[14]等。例如，水稻中的37個β-糖基水解酶基因大多數(shù)在RS105菌株侵染后2 h表達升高，24 h或48 h達到峰值[13]；棉花中GrGLU42和GrGLU43在接種黃萎病菌96 h表達量達到峰值[24]；而葡萄中38個VqBGH基因大多數(shù)在接種白粉菌后48 h或120 h表達出現(xiàn)峰值[14]。

本研究的兩個葡萄雜交組合的9個材料，母本均為中國野生抗病材料，父本均為歐亞種感病材料，在白粉菌侵染0、1、4、7 d的糖基水解酶BGH40a基因表達中，只有3個材料表現(xiàn)上調(diào)，其中感病材料6-12-3、6-12-4也表現(xiàn)上調(diào)，說明糖基水解酶BGH40a基因的表達與材料自身特性有一定的關(guān)系，由于樣本量不足與采樣時間間隔長而未能表現(xiàn)出與抗病性之間的具體關(guān)系。在芪類物質(zhì)含量變化的測定中，中國野生毛葡萄83-4-96在接種白粉菌的第4天VqBGH40a表達上調(diào)，且反式云杉新苷含量減少，與Yan等[14]在中國野生毛葡萄丹鳳-2中的試驗結(jié)果相一致；‘1-9-6’中反式云杉新苷降解后，反式白藜蘆醇表現(xiàn)出減少的趨勢，這可能是反式云杉新苷降解后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其他抗菌性更強的衍生物，如葡萄素、紫檀芪等，因而表現(xiàn)出抗病性狀[23]?？共∑咸殉缀?35-1外，雖然反式云杉新苷含量減少的量不明顯，但是反式白藜蘆醇含量保持較高的水平。感病葡萄中，反式云杉新苷含量下降，特別是‘佳利釀’中含量大幅下降，但反式白藜蘆醇含量增加較少，這個現(xiàn)象與不同葡萄材料中基因表達與功能差異有關(guān)，將在下一步進行研究。不同葡萄材料在白粉病菌誘導(dǎo)下，反式云杉新苷含量下降與反式白藜蘆醇增加的趨勢說明，葡萄中糖基水解酶BGH40a在白粉病菌侵染過程中，具有水解反式云杉新苷形成反式白藜蘆醇的作用，也就是說，這種糖基水解酶在葡萄植物體內(nèi)的次生代謝對葡萄抗病性有著一定的作用。

初步分析發(fā)現(xiàn)，中國野生毛葡萄83-4-96與歐亞葡萄品種‘粉紅玫瑰’的雜交組合中，葉片中糖基水解酶BGH40a在白粉病菌侵染過程中，具有水解反式云杉新苷的作用；而且雜交組合‘83-4-96×粉紅玫瑰’及其子代感病指數(shù)和反式白藜蘆醇表現(xiàn)出較高的負相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)是﹣0.856，表現(xiàn)出增強抗病性的趨勢。同時，在廣西栽培多年的‘1-9-6’表現(xiàn)出抗病性，也支持本研究結(jié)果[25-26]。而‘白河-35-1×佳利釀’及其子代的感病指數(shù)和反式白藜蘆醇的相關(guān)性較低，因此有必要對更多野生種質(zhì)及其子代做進一步研究以證實上述觀點。

綜上所述，在供試的9份葡萄材料中，有4份表現(xiàn)抗病?？共∑咸阎蠦GH40a基因在白粉菌誘導(dǎo)下表達，可以將反式云杉新苷水解降解為反式白藜蘆醇，增加了反式白藜蘆醇含量，使葡萄表現(xiàn)出抗病性，而且這種糖基水解酶的表達特性可以通過雜交育種遺傳給后代，這為今后選擇糖基水解酶基因表達特性強的葡萄種質(zhì)用作抗病育種的親本，提供了科學(xué)依據(jù)。