方 晶，翁麗麗，王美怡，肖春萍，楊雪晴，孫 金，馮禹壯

北蒼術(shù)米泔水炮制前后化學(xué)成分變化及其對脾虛泄瀉大鼠腸道真菌菌群的影響

方 晶，翁麗麗，王美怡，肖春萍*，楊雪晴，孫 金，馮禹壯

長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117

探究北蒼術(shù)米泔水炮制前后成分變化及其對大黃所致脾虛泄瀉模型大鼠腸道真菌菌群的影響。采用氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）和HPLC法對北蒼術(shù)生品及其米泔水炮制品化學(xué)成分進行對比分析，利用ITS高通量測序技術(shù)，探究其對大黃所致脾虛泄瀉模型大鼠腸道真菌群落變化的影響。GC-MS和HPLC結(jié)果顯示，炮制前后化學(xué)成分類型沒有改變，而成分含量多有變化，其中揮發(fā)油類（茅術(shù)醇、β-桉葉醇、α-紅藥沒醇、蒼術(shù)酮）炮制后含量顯著降低（＜0.05），多數(shù)酯類成分炮制后含量增加，可能與北蒼術(shù)“炮制減燥”有關(guān)。高通量測序結(jié)果顯示，屬水平上，生北蒼術(shù)組真菌群落結(jié)構(gòu)與模型組相似，而米泔水制北蒼術(shù)組更接近于空白組，說明米泔水制北蒼術(shù)能夠調(diào)節(jié)大黃所致的脾虛型腹瀉，對于腸道真菌菌群的調(diào)控能力優(yōu)于生北蒼術(shù)。Pearson相關(guān)性分析表明，部分真菌菌群與活性成分含量相關(guān)，如線黑粉酵母屬sp.、鏈格孢屬sp.真菌與米泔水制北蒼術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯II含量顯著正相關(guān)（＜0.05），與蒼術(shù)酮含量呈顯著負相關(guān)（＜0.05）。北蒼術(shù)米泔水炮制前后化學(xué)成分含量存在差異，其中茅術(shù)醇、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮與北蒼術(shù)炮制減燥及治療脾虛泄瀉疾病有密切關(guān)系，米泔水制北蒼術(shù)對模型大鼠腸道真菌調(diào)控能力優(yōu)于生北蒼術(shù)，該研究結(jié)果可為擴大米泔水制蒼術(shù)臨床應(yīng)用提供理論參考。

北蒼術(shù)；米泔水制；腸道菌群；GC-MS；HPLC；脾虛泄瀉；ITS高通量測序技術(shù)；茅術(shù)醇；β-桉葉醇；α-紅藥沒醇；蒼術(shù)酮；炮制減燥；真菌；線黑粉酵母屬；鏈格孢屬；白術(shù)內(nèi)酯II

北蒼術(shù)(DC.) Koidz.為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，入藥部位為根莖，有燥濕健脾、祛風散寒等功效，是《中國藥典》2020年版蒼術(shù)藥材正品來源之一[1]。蒼術(shù)的主要活性成分為蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮和β-桉葉醇等揮發(fā)性成分，分為倍半萜類和聚乙烯炔類，具有抗?jié)兒涂咕⒖寡椎人幚碜饔肹2-3]。古代記載蒼術(shù)的炮制方法有麩炒、醋炒、酒炒、米泔浸等，蒼術(shù)經(jīng)過米泔水炮制能緩和燥烈之性、增強健脾作用[4]。脾虛泄瀉是脾陽氣虛而致運化失常，多表現(xiàn)為腹瀉、久瀉不愈等。研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉與腸道菌群密切相關(guān)，腸道菌群可參與人體多種生理活動，良好的腸道菌群環(huán)境能夠保證機體各項功能正常發(fā)揮[5-6]。近年來，利用中藥恢復(fù)腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境來治療腹瀉的方法得到推崇。目前已有研究表明，蒼術(shù)經(jīng)米泔水炮制后，可提高其健脾和胃、利尿、調(diào)節(jié)胃腸功能與分泌的治療作用[7-8]。課題組前期已優(yōu)選出米泔水制北蒼術(shù)最佳炮制工藝（米水比例為1∶60，米泔水用量25 mL，悶潤2 h，炒制溫度160 ℃，炒制時間30 min），并建立了脾虛泄瀉癥大鼠模型（20 mL/kg ig 200%大黃水煎液，早晚各1次，造模10 d）[9]。尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)研究米泔水制蒼術(shù)對大鼠腸道內(nèi)真菌物種組成結(jié)構(gòu)及豐度的影響，因此，本研究在此基礎(chǔ)上采用氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）和HPLC法對北蒼術(shù)米泔水炮制前后的化學(xué)成分進行對比分析，利用ITS高通量測序技術(shù)探究北蒼術(shù)生品及其米泔水制品對大黃所致脾虛泄瀉模型大鼠腸道內(nèi)真菌物種組成及豐度變化的影響，并對差異菌屬與化學(xué)成分進行Pearson相關(guān)性分析，建立腸道真菌-活性成分相互作用關(guān)系，為擴大米泔水制蒼術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TRACE 1310型氣相色譜儀、TSQ 8000 Evo型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司；LC-1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；AL104型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多集團。

1.2 材料與試藥

北蒼術(shù)藥材（批號20200206）購買自河北省安國市榮華本草中藥材有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定為菊科植物北蒼術(shù)(DC.) Koidz.的干燥根莖。米泔水制北蒼術(shù)參考2020版《吉林省中藥飲片炮制規(guī)范》米泔水制蒼術(shù)項下炮制方法及課題組前期研究成果制備[9-10]；對照品蒼術(shù)酮（批號P11M10F73437，質(zhì)量分數(shù)97.3%）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號M22A10S95762，質(zhì)量分數(shù)99.9%）、蒼術(shù)素（批號P29N9F76159，質(zhì)量分數(shù)98%）、β-桉葉醇（批號P24O8F46474，質(zhì)量分數(shù)99.4%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，醋酸乙酯為分析純，水為超純水。

1.3 動物

實驗動物為SPF級雄性Wistar大鼠，共24只，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號SCXK（遼）2020-0001，質(zhì)量合格證號210726210100 208713，動物實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，批準文號2020317。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制前后揮發(fā)油及醇提物得率變化

取生北蒼術(shù)、米泔水制北蒼術(shù)粉碎過二號篩，各稱定粉末約40 g，置于500 mL圓底燒瓶中，按固液比1∶8加入蒸餾水，浸泡1 h后，按《中國藥典》2020年版四部2204通則附錄（甲法）進行水蒸氣蒸餾5 h，提取至無揮發(fā)油滴出，靜止冷卻1 h，氯化鈉脫水后稱定質(zhì)量并計算揮發(fā)油得率。

取生北蒼術(shù)、米泔水制北蒼術(shù)粉碎過三號篩，各稱取75.6 g，分別用10倍量體積80%乙醇浸泡12 h后超聲提取，共提取3次，每次2 h，濾過，分別合并濾液，經(jīng)40 ℃減壓蒸干，稱定質(zhì)量并計算醇提物得率。

水蒸氣蒸餾法提取的生北蒼術(shù)揮發(fā)油呈棕黃色，黏稠，透明，且具有一定香味，得率為1.25%；米泔水制北蒼術(shù)揮發(fā)油呈深棕黃色，黏稠，不透明，且具有一定香味，得率為0.80%；經(jīng)米泔水炮制后揮發(fā)油得率比生北蒼術(shù)揮發(fā)油得率降低了36%。醇提法提取的生北蒼術(shù)醇提物得率為34.8%，米泔水制北蒼術(shù)醇提物得率為29.3%，經(jīng)米泔水炮制后醇提物得率比生北蒼術(shù)醇提物得率降低了15.80%。

2.2 基于GC-MS分析炮制前后揮發(fā)油及醇提物成分變化

采用GC-MS聯(lián)用方法得到揮發(fā)油及醇提物總離子流圖，對2種提取方法下的炮制前后北蒼術(shù)成分進行比較分析，同時對炮制前后化學(xué)成分進行鑒定，所得數(shù)據(jù)結(jié)果通過NIST11譜庫匹配檢索，在結(jié)合相關(guān)文獻進行人工質(zhì)譜圖解析確定化合物，應(yīng)用峰面積歸一化法確定其相對含量。

2.2.1 GC-MS分析樣品的制備 利用“2.1”項下方法制備揮發(fā)油，取100 μL揮發(fā)油，加入900 μL醋酸乙酯溶解，用0.22 μm濾頭濾過后即得揮發(fā)油樣品。利用“2.1”項下方法制備醇提物，加醋酸乙酯溶解定容至10 mL，用0.22 μm濾頭濾過后即得醇提物樣品。

2.2.2 揮發(fā)油樣品氣相色譜條件 色譜柱為Rtx-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純He（99.999%）；體積流量為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；自動分流進樣；初始柱溫為30 ℃，維持1 min，以15 ℃/min升溫至150 ℃，再以2 ℃/min升至200 ℃，維持2 min，最后以20 ℃/min升至280 ℃，維持10 min。

質(zhì)譜使用EI離子源轟擊，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描質(zhì)量范圍/20～500。溶劑切除時間5 min，開始時間5.0 min，結(jié)束時間50.0 min。

2.2.3 揮發(fā)油成分變化 揮發(fā)油總離子流圖如圖1所示。北蒼術(shù)米泔水炮制前后揮發(fā)油中共發(fā)現(xiàn)有50種化學(xué)成分，多為醇類、芳香烴類、烯烴類、酯類和酮類等，結(jié)果見表1?？芍鄙n術(shù)揮發(fā)油中相對含量較高的成分為2.3-二氫-1-苯丙氨酸-1-酮（24.49%）、β-桉葉醇（21.61%）和茅術(shù)醇（7.37%）；米泔水制北蒼術(shù)揮發(fā)油中相對含量較高的成分為β-桉葉醇（13.95%）、大根香葉烯（8.93%）和modephene（7.57%）。與生北蒼術(shù)比較，炮制前后所含揮發(fā)油的化學(xué)成分種類無變化，但其相對含量有所改變。其中米泔水炮制后成分相對含量下降幅度較大的有2.3-二氫-1-苯丙氨酸-1-酮（17.52%）、β-桉葉醇（7.66%）、β-桉葉烯（3.37%）、茅術(shù)醇（2.29%）和蒼術(shù)酮（2.26%）；米泔水炮制后成分相對含量上升幅度較大的有modephene（4.77%）、大根香葉烯（4.35%）、雙環(huán)[3,1,0]己-2-烯,2-甲基-5-(1-甲基乙基)（3.66%）、β-石竹烯（2.96%）和4-苯乙烯基噠嗪（2.49%）。

A-生北蒼術(shù)揮發(fā)油 B-米泔水制北蒼術(shù)揮發(fā)油

表1 GC-MS法測定北蒼術(shù)米泔水制前后揮發(fā)油中化學(xué)成分對比

續(xù)表1

2.2.4 醇提物樣品氣相色譜條件 色譜柱為Rtx-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純He（99.999%）；體積流量為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；自動分流進樣；初始柱溫為60 ℃，以15℃/min升溫至280 ℃，維持5 min。

質(zhì)譜使用EI離子源轟擊，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍/30～500。溶劑切除時間4 min，開始時間4.0 min，結(jié)束時間20.0 min。

2.2.5 醇提物成分變化 醇提物總離子流圖如圖2所示。北蒼術(shù)米泔水炮制前后醇提物中共發(fā)現(xiàn)有30種化學(xué)成分，多為酯類、醇類和酚類等，結(jié)果見表2?？芍鄙n術(shù)醇提物中相對含量較高的成分為4-苯乙烯基噠嗪（17.18%）、β-桉葉醇（11.49%）和3-甲基-4-異丙基苯酚（10.86%）；米泔水制北蒼術(shù)醇提物中相對含量較高的成分為5,8,11,14-花生四烯酸（19.73%）、2-硝基聯(lián)苯（18.70%）和4-苯乙烯基噠嗪（11.94%）。

與生北蒼術(shù)醇提物比較，炮制后醇提物中所含化學(xué)成分種類基本沒有變化，但其相對含量有所改變。其中米泔水制后成分相對含量下降幅度較大的有3-甲基-4-異丙基苯酚（10.72%）、β-桉葉醇（10.66%）、4-(2,4,4-三甲基環(huán)己-1,5-二烯基)-3-丁烯- 2-酮（5.66%）和4-苯乙烯基噠嗪（5.24%）；米泔水制后成分相對含量上升幅度較大的有5,8,11,14-花生四烯酸（19.65%）、2-硝基聯(lián)苯（16.16%）、-[24-氧代-3α,7α,12α-三(三甲基硅氧基)-5β-膽聚糖-24-基]甘氨酸甲酯（8.13%）。

2.3 基于HPLC測定揮發(fā)油及醇提物成分變化

利用“2.1”項下方法制備揮發(fā)油。取60 mg揮發(fā)油樣品加10 mL甲醇溶解，即得揮發(fā)油HPLC樣品；利用“2.1”項下方法制備醇提物，經(jīng)40 ℃減壓濃縮至100 mL，取適量濃縮液濾過即得醇提物HPLC樣品；精密稱取白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮對照品適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為10.1、33.0、44.0、53.4 μg/mL的混合對照品溶液，備用。色譜條件參考本課題組前期一測多評方法[11]，使用安捷倫Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～3 min，55%乙腈；3～20 min，55%～60%乙腈；20～35 min，60%～65%乙腈；35～55 min，65%～85%乙腈；55～60 min，85%～95%乙腈，檢測波長分別為208 nm（白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇，0～28 min）、340 nm（蒼術(shù)素，28～45 min）、220 nm（蒼術(shù)酮，45～60 min）；體積流量1 mL/min，柱溫32 ℃；進樣量15 μL。色譜圖見圖3。根據(jù)HPLC圖譜，顯示有4個含量較高的峰且分離度較好，即白術(shù)內(nèi)酯II（峰1）、β-桉葉醇（峰2）、蒼術(shù)素（峰3）、蒼術(shù)酮（峰4）。由表3可知，經(jīng)米泔水炮制后，4種成分均有不同程度降低，與生北蒼術(shù)揮發(fā)油對比，米泔水制北蒼術(shù)醇提物中白術(shù)內(nèi)酯II、蒼術(shù)素和蒼術(shù)酮成分含量較高。

A-生北蒼術(shù)醇提物 B-米泔水制北蒼術(shù)醇提物

2.4 對脾虛泄瀉大鼠腸道真菌菌群的影響

2.4.1 樣品采集 課題組前期已建立大鼠脾虛泄瀉模型[9]，隨機分為4組，每組6只，分別為空白組（KB）、模型組（MX）、生北蒼術(shù)組（SC）、米泔水制北蒼術(shù)組（MC），除空白組，其余各組均需造模，共10 d。造模結(jié)束后，生北蒼術(shù)組和米泔水制北蒼術(shù)組分別按生藥量756 mg/mL制備醇提物，ig給予對應(yīng)藥液（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)7 d?？瞻捉Mig給予等量生理鹽水。試驗共17 d。

大鼠糞便收集：試驗第17天早8:00正常ig（提前12 h將各組大鼠置于代謝籠中），末次給藥后12 h禁食不禁水，用無菌EP管收集大鼠新鮮糞便，迅速置于液氮中冷卻，結(jié)束后將樣品置于?80 ℃冰箱中保存。

2.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析 Mass Hunter工作系統(tǒng)，NIST11譜庫均由美國Agilent公司提供。采用Microsoft Office 2016進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析和Pearson相關(guān)性分析，單因素方差用最小顯著差（least significance difference，LSD）檢驗，Pearson相關(guān)性分析用Pearson檢驗，以＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；利用Origin 2021軟件對成分-菌群作相關(guān)性圖。

2.4.3 不同組別腸道真菌分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）水平分析 每個組別隨機選取3個糞便樣品進行DNA的抽取，微生物多樣性檢驗及引物設(shè)計由北京百邁客生物科技有限公司完成。由表4可知，經(jīng)高通量測序從4組樣品（空白組、模型組、生北蒼術(shù)組、米泔水制北蒼術(shù)組）的12份腸道糞便樣品中共檢測到真菌ITS的有效序列41 354個，平均長度為588.0 bp。在97.0%的相似度水平下進行OTUs聚類，獲得1034個OTU。從不同處理組的真菌稀釋曲線可知，OTU曲線斜率隨測序次數(shù)增加均呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢，從樣品中獲得的序列覆蓋率高于90%，說明本研究測序數(shù)據(jù)量合理。結(jié)果見圖4。

2.4.4 不同組別腸道真菌群落結(jié)構(gòu)特征 經(jīng)高通量測序，4個不同處理組12份樣品中腸道真菌屬于8門29綱69目135科243屬386種。由圖5-A可知，不同處理組中腸道真菌菌群有明顯差異，主要包括10個優(yōu)勢菌群，分別為曲霉屬sp.、鐮刀菌屬sp.、枝孢屬sp.、枝頂孢屬sp.、德巴利氏酵母屬sp.、被孢霉屬sp.、線黑粉酵母屬sp.、鏈格孢屬sp.、節(jié)擔菌屬sp.、毛殼菌屬sp.。由圖5-B可知，與空白組相比，模型組中菌群變化明顯，sp.和sp.真菌相對豐度顯著降低（＜0.05），sp.真菌是空白組的12倍（＜0.05）；生北蒼術(shù)組中sp.真菌最高（8.88%），是模型組的1.92倍，sp.真菌顯著降低38.18%（＜0.05）；與模型組相比，米泔水制北蒼術(shù)組未見sp.真菌，其中sp.和sp.真菌分別較模型組顯著降低20.20%、12.39%（＜0.05），sp.和sp.真菌相對豐度顯著升高（＜0.05）。

表2 GC-MS法測定北蒼術(shù)米泔水制前后醇提物中化學(xué)成分對比

1-白術(shù)內(nèi)酯II 2-β-桉葉醇 3-蒼術(shù)素 4-蒼術(shù)酮

表3 HPLC法測定北蒼術(shù)米泔制前后揮發(fā)油和醇提物中成分分析(n = 4)

與生北蒼術(shù)揮發(fā)油比較：**＜0.01；與生北蒼術(shù)醇提物比較：##＜0.01

**< 0.01volatile oil from;##< 0.01ethanol extract from

表4 不同組別樣品測序數(shù)據(jù)及OTU統(tǒng)計分析(, n = 3)

圖4 稀釋曲線

2.4.5 不同組別腸道真菌多樣性分析

（1）α多樣性分析：與空白組相比，模型組ACE指數(shù)升高了22.0%，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著升高（＜0.01），分別是空白組的1.24倍和1.6倍，說明造模后物種豐富度增大，多樣性變化明顯。與模型組相比，生北蒼術(shù)組ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)最大，說明生北蒼術(shù)組真菌群落多樣性與豐富度較高，米泔水制北蒼術(shù)組Shannon指數(shù)最大，2組與模型組相比均無顯著性差異，見表5。

（2）β多樣性分析：基于Abund_Jaccard距離算法，得到基于屬水平的12份腸道真菌樣品非加權(quán)配對平均法（UPGMA）聚類樹狀圖。由圖6可知，空白組中的優(yōu)勢菌種為曲霉屬sp.，該真菌屬在模型組中豐度明顯降低（＜0.05），生北蒼術(shù)和米泔水制北蒼術(shù)均能夠回調(diào)其豐度，且米泔水制北蒼術(shù)組作用優(yōu)于生北蒼術(shù)組。枝頂孢屬sp.真菌豐度在造模后豐度顯著升高（＜0.05），與模型組相比，生北蒼術(shù)組豐度基本不變，經(jīng)米泔水制北蒼術(shù)治療后，該屬真菌豐度明顯降低（＜0.05），與空白組在屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)相似，說明米泔水制北蒼術(shù)對枝頂孢屬真菌的抑制作用強于生北蒼術(shù)。在屬水平上整體分析，生北蒼術(shù)組真菌群落結(jié)構(gòu)與模型組相似，而米泔水制北蒼術(shù)組更接近于空白組，說明米泔水制北蒼術(shù)能夠調(diào)節(jié)大黃所致的脾虛型腹瀉，對于腸道真菌菌群的調(diào)控能力優(yōu)于生北蒼術(shù)。

2.4.6 4種化學(xué)成分與真菌群落的相關(guān)性分析 利用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，建立腸道真菌群落中相對豐度前10的優(yōu)勢菌屬與HPLC測量的4種成分含量的Pearson相關(guān)性分析，得出相關(guān)性系數(shù) （＜0.05），經(jīng)篩選后構(gòu)建出相關(guān)系數(shù)矩陣圖，分析與脾虛泄瀉模型有相關(guān)性的腸道真菌。如圖7-A，屬水平上，部分真菌與米泔水制北蒼術(shù)中4種成分含量存在相關(guān)性，其中，sp.和sp.真菌與白術(shù)內(nèi)酯II含量顯著正相關(guān)（＜0.05），與蒼術(shù)酮含量顯著負相關(guān)（＜0.05）。同時，sp.真菌與β-桉葉醇及蒼術(shù)素含量也存在正相關(guān)。如圖7-B，相對豐度前10的優(yōu)勢菌屬與生北蒼術(shù)中4種成分含量同樣存在相關(guān)性，sp.真菌與生北蒼術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯II成分含量正相關(guān)，與蒼術(shù)酮成分含量負相關(guān)。

A為屬水平上物種分布圖，B為屬水平上物種豐度聚類熱圖

表5 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計表(, n = 3)

與空白組比較：**＜0.01

**< 0.01blank group

圖6 基于屬水平的腸道真菌群落的UPGMA樹狀關(guān)系

3 討論

中醫(yī)認為腹瀉由脾失健運、內(nèi)傷飲食等多種因素引起，因此，常用化濕健脾類中藥治療腹瀉[12]。中藥因其不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)點，在腹瀉治療中彰顯出不可替代的優(yōu)勢[13-15]。蒼術(shù)是治療脾虛久瀉常用中藥，前期已發(fā)現(xiàn)高劑量米泔水制北蒼術(shù)醇提物可有效緩解脾虛泄瀉模型大鼠便溏等癥狀，但作用機制尚不明確[9]?，F(xiàn)代研究表明中藥活性成分、中藥復(fù)方可與腸道微生物相互作用以達到治療效果，如黃連中生物堿類活性成分能抑制大腸埃希菌和霍亂弧菌增殖[16]；參苓白術(shù)散[17]能通過抑制腸道內(nèi)致病菌增殖，促進有益菌生長，調(diào)節(jié)胃腸運動的方式來治療腹瀉。目前，腸道微生態(tài)相關(guān)研究多集中于腸道細菌，對真菌研究較少，而腸道真菌對維持腸道微生態(tài)平衡也具有重要作用。因此，研究腸道真菌與中藥活性成分和疾病間的關(guān)系對人類健康有重要意義。

根據(jù)中藥炮制理論，米泔水炮制可去除生品部分油脂，以降低藥材辛燥之性，增強其補脾和中作用[18]。GC-MS結(jié)果顯示，米泔水炮制后揮發(fā)油和醇提物化學(xué)成分類型未改變，僅改變相應(yīng)百分含量，炮制后茅術(shù)醇、β-桉葉醇、α-紅藥沒醇、蒼術(shù)酮及多數(shù)酮類成分含量減少，大根香葉烯及多數(shù)酯類成分含量增加，其中，揮發(fā)油中蒼術(shù)酮含量降低至炮制前47.1%，說明蒼術(shù)酮是北蒼術(shù)燥性成分之一，這與同屬藥材白術(shù)“減酮減燥，增酯增效”的觀點一致[19]。此外，北蒼術(shù)根莖中主要成分包括聚乙炔類蒼術(shù)素和倍半萜類白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮等。但GC-MS法測定中未見《中國藥典》2020年版規(guī)定的含量測定指標蒼術(shù)素及白術(shù)內(nèi)酯II等成分，推測與北蒼術(shù)的提取方法密切相關(guān)。

為驗證這一猜想，采用HPLC測定相同提取方法制備的樣品，結(jié)果蒼術(shù)素等4種成分均被檢出。其中，生品化學(xué)成分含量大于米泔水制品，醇提物成分含量大于揮發(fā)油成分含量，這說明炮制過程中，熱不穩(wěn)定成分易發(fā)生降解和化學(xué)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致很多沸點較低成分（燥性成分）流失，而水蒸氣蒸餾法溫度較超聲提取法溫度更高，因此醇提物成分含量高于揮發(fā)油成分含量。同時，雖然炮制后揮發(fā)油含量顯著下降，但HPLC可測定活性成分蒼術(shù)素的含量，進一步證明“以制其燥去其油”的觀點正確，既達到降燥目的，又保證活性成分含量無過度流失，進而為發(fā)揮臨床療效提供保障。

相對于腸道細菌，真菌數(shù)量非常少，目前唯一被證實有益生作用且有臨床應(yīng)用的真菌是布拉酵母菌[20]。ITS高通量測序結(jié)果顯示，不同組別腸道真菌菌群差異顯著，10個優(yōu)勢菌群中曲霉屬、鐮刀菌屬為常見腸道真菌[21-23]，曲霉屬真菌在空白組及米泔水制北蒼術(shù)組豐度最高，造模后鐮刀菌屬真菌豐度顯著增加，生北蒼術(shù)和米泔水制北蒼術(shù)均能抑制鐮刀菌屬真菌活性。北蒼術(shù)揮發(fā)油體外拮抗實驗證實蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素可抑制內(nèi)生鐮刀菌sp.生長，并且對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌.等病原菌抑制作用更強[24]，說明蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素可能在拮抗病原真菌方面有重要作用。

α和β多樣性結(jié)果表明，造模后真菌物種豐富度增大，多樣性變化明顯，這與在炎癥性腸病患者結(jié)腸黏膜中可檢測到真菌菌群多樣性顯著升高的情況類似[25-26]，而米泔水制北蒼術(shù)組真菌群落結(jié)構(gòu)更接近于空白組，說明米泔水制北蒼術(shù)對菌群調(diào)節(jié)作用優(yōu)于生北蒼術(shù)。

通過腸道真菌與活性成分相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)線黑粉酵母屬和鏈格孢屬真菌與白術(shù)內(nèi)酯II和蒼術(shù)酮含量的積累顯著相關(guān)，且白術(shù)內(nèi)酯II與蒼術(shù)酮含量極顯著負相關(guān)，進一步證明白術(shù)內(nèi)酯II與蒼術(shù)酮可相互轉(zhuǎn)化。β-桉葉醇被證實對胃腸運動機能有雙向調(diào)節(jié)作用[27]，線黑粉酵母屬與β-桉葉醇也存在正相關(guān)，進一步說明米泔水制北蒼術(shù)減燥健脾利濕作用與白術(shù)內(nèi)酯II、蒼術(shù)酮、β-桉葉醇等成分相關(guān)。

綜上，本實驗對北蒼術(shù)米泔水炮制前后化學(xué)成分變化進行探究，并利用脾虛泄瀉模型大鼠的糞便樣品作腸道真菌相關(guān)性分析，研究發(fā)現(xiàn)北蒼術(shù)米泔水炮制后減燥與白術(shù)內(nèi)酯II、蒼術(shù)酮等成分相關(guān)，健脾利濕作用的增強與β-桉葉醇和大根香葉烯等成分相關(guān)，線黑粉酵母屬和鏈格孢屬真菌可能與活性成分有相互作用，但仍需進一步驗證。近年隨著腸道微生物與各種疾病間相互關(guān)系研究的不斷深入，腸道有益真菌將可能成為下一個研究熱點，本研究將為腸道樣本菌群中潛在有益真菌的研究及臨床應(yīng)用開發(fā)提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of chemical compositions inwith rice water before and after processing and its effects on intestinal fungal flora of spleen deficiency diarrhea rats

FANG Jing, WENG Li-li, WANG Mei-yi, XIAO Chun-ping, YANG Xue-qing, SUN Jin, FENG Yu-zhuang

School of Pharmaceutical Science, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

To explore the changes of composition in(AC) with rice water before and after processing and its effect on intestinal fungal flora of rats with spleen deficiency and diarrhea caused byDahuang(et, RRR).The chemical components of the raw products and processed products of AC were analyzed by GC-MS and HPLC technologies. ITS high-throughput sequencing technology was used to explore the effects of them on intestinal fungal community changes in rats with spleen deficiency diarrhea induced by RRR.The results of GC-MS and HPLC showed that there was no change in the type of chemical components before and after processing, but the content of chemical components changed. The volatile contents of hinesol, β-eudesmol, α-bisabolol and atractylone decreased significantly (< 0.05)and the content of most esters increased after processing. Maybe it related to “processing reduced the dryness”. At the genus level, high-throughput sequencing results showed that the fungal community structure of AC group was similar to the model group, and the AC prepared by rice water was closer to the blank group, indicating that AC processed by rice water could regulate spleen deficiency diarrhea caused by RRR, and the regulation ability of intestinal fungal flora was better than the raw products. Pearson correlation analysis showed that some fungal groups were correlated with the content of active ingredients. There was a significantly positive correlation betweensp.,sp. and atractylenolide II content, the correlation with atractylone content was significantly negative.There were differences in chemical composition content of AC with rice water before and after processing. Among them, hinesol, β-eudesmol and atractylone were closely related to AC desiccation and treating spleen deficiency and diarrhea diseases. And the regulation ability of intestinal fungi in the model rats with AC processed by rice water was better than that raw products of AC. The results can provide theoretical reference for expanding the clinical application of rice water processed AC.

(DC.) Koidz.; rice water processing; intestinal flora; GC-MS; HPLC; spleen deficiency diarrhea; high-throughput sequencing technology on ITS; hinesol; β-eudesmol; α-bisabolol; atractylone; processing reduced dryness; fungus;sp.;sp.; atractylenolide II

R283.1

A

0253 - 2670(2022)23 - 7372 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.007

2022-06-24

吉林省科技廳科技項目（20220204062YY）；吉林省國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202210199046）

方 晶，女，碩士研究生，研究方向為中藥品質(zhì)鑒定、質(zhì)量標準及其開發(fā)利用。Tel: (0431)81672193 E-mail: 835506940@qq.com

通信作者：肖春萍，女，副教授，博士，研究方向為中藥資源、栽培理論和技術(shù)。Tel: (0431)81672193 E-mail: btxnw@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]