吳肸樂，李 冉，李世偉，張麗花，韓立峰，張 祎，王 濤，王少峽，吳紅華

纈草水提取物的化學成分研究

吳肸樂1，李 冉1，李世偉1，張麗花1，韓立峰1，張 祎1，王 濤1，王少峽2，吳紅華1*

1. 天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院 組分中藥國家重點實驗室，天津 301617 2. 天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，天津 301617

對纈草水提取物中的化學成分進行研究。運用正相硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜、制備高效液相色譜等分離手段進行分離純化，采用核磁共振、質(zhì)譜等多種波譜學技術(shù)鑒定化合物的化學結(jié)構(gòu)，并采用Griess法評價其對脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞BV-2神經(jīng)炎癥的抑制活性。從纈草水提取物中分離得到了12個化合物，分別為tinnevellin-8--β--glucopyranoside（1）、大黃素-8-β--吡喃葡萄糖苷（2）、(2,3)-肥牛木素（3）、左旋橄欖素-9--β--吡喃葡萄糖苷（4）、左旋馬尾松樹脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷（5）、金色酰胺醇乙酸酯（6）、松脂素（7）、8-羥基松脂素（8）、松脂素-4-β--吡喃葡萄糖苷（9）、8,8-二羥基松脂素-4-β--吡喃葡萄糖苷（10）、(2)-橙皮苷（11）和香蜂草苷（12）?；衔?～4和6均為首次從纈草屬植物中分離得到。其中，化合物3～4、6、9、11～12在不影響B(tài)V-2的細胞活力前提下，可以抑制脂多糖誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎性因子一氧化氮（NO）的產(chǎn)生。

纈草；萘酚苷；木脂素；大黃素-8-β--吡喃葡萄糖苷；(2,3)-肥牛木素；左旋橄欖素-9--β--吡喃葡萄糖苷；金色酰胺醇乙酸酯

纈草L.為忍冬科（Caprifoliaceae）纈草屬Linn.多年生草本植物[1]，主要分布于我國東北、西南及西北地區(qū)[2]。纈草以干燥根及根莖入藥，根莖呈頭狀或短柱狀，質(zhì)堅實，不易折斷，有特殊氣味，一般秋季采挖，去除地上部分及泥沙，洗凈，悶潤，切厚片，干燥后即可藥用[3]。纈草是全世界范圍內(nèi)被廣泛應用的傳統(tǒng)草藥之一，最早被古希臘人用于治療泌尿及胃腸消化道紊亂，至19世紀被廣泛用于治療女性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有“19世紀的安定”之稱[4]。在我國，早在唐朝《新修本草》中就有纈草的記載，其味辛、苦，性溫，歸心、肝經(jīng)，具有安神、理氣、止痛之功效，中醫(yī)臨床多配伍諸藥用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、癔病、脘腹脹痛、腰腿痛和跌打損傷等[5]。此外，纈草是一種溫和的鎮(zhèn)靜劑和促睡眠劑，安全，不良反應小，在歐洲等地區(qū)一直作為鎮(zhèn)靜劑使用，已有多個世紀的歷史。纈草干燥根或根的提取物制成片劑或軟膠囊，可作為膳食補充劑使用[6]。纈草富含揮發(fā)油成分，植物化學研究發(fā)現(xiàn)纈草除含環(huán)烯醚萜等主要成分之外，還含有木脂素、黃酮、生物堿及氨基酸等其他類成分[5]。現(xiàn)代藥理研究表明纈草在鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗癲癇、改善認知能力、解痙、調(diào)節(jié)血脂、抗脂質(zhì)過氧化、保護腎臟以及防治膽囊結(jié)石和心腦血管系統(tǒng)疾病等方面均有顯著作用[7]。

本研究報道纈草水提取物的化學成分分離及結(jié)構(gòu)鑒定，從中分離并鑒定出12個化合物，分別為tinnevellin-8--β--glucopyranoside（1）、大黃素- 8--β--吡喃葡萄糖苷（emodin-8--β--gluco- pyranoside，2）、(2,3)-肥牛木素 [(2,3)- ceplignan，3]、左旋橄欖素-9--β--吡喃葡萄糖苷 [(?)-olivil-9--β--glucopyranoside，4]、左旋馬尾松樹脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷 [(?)- massoniresinol-3a--β--glucopyranoside，5]、金色酰胺醇乙酸酯（aurantiamide acetate，6）、松脂素（pinoresinol，7）、8-羥基松脂素（8-hydroxy- pinoresinol，8）、松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（pinoresinol-4--β--glucopyranoside，9）、8,8-二羥基松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（prinsepiol- 4--β--glucopyranoside，10）、(2)-橙皮苷 [(2)- hesperidin，11] 和香蜂草苷（didymin，12）。其中，化合物1～4和6均為首次從纈草屬植物中分離得到?；衔?～4、6、9、11～12在不影響小膠質(zhì)細胞BV-2的細胞活力前提下，能夠抑制脂多糖誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎性因子一氧化氮（NO）的產(chǎn)生。

1 儀器與材料

MS105DU/A十萬分之一電子天平（上海梅特勒–托利多有限公司）；DLSB型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市英峪予華儀器有限責任公司）；EYELA-DPE-2150旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；BUCH-R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪有限公司）；SHZ-(DIII) 循環(huán)水式多用真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；TH-II型薄層加熱器（上?？普苌萍加邢薰荆?；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；Agilent 1260 II型分析高效液相（美國Agilent公司）；島津Prominence制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHIM-PACK PRC-ODS(H) 制備型色譜柱（20.0 mm×25 cm，日本島津公司）；Bruker AV-III 600 MHz/500 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；靜電場軌道阱超高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS（美國Thermo Fisher Scientific公司）；二氯甲烷、正丁醇、醋酸乙酯、甲醇等試劑的色譜及分析級（天津市康科德化學試劑廠）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；GF254薄層色譜硅膠板（10 cm×20 cm）和GF254薄層制備硅膠板（20 cm×20 cm，于成化工有限公司）；反相ODS C18柱填料（日本YMC公司）；D101大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（瑞士GE Healthcare公司）。小鼠BV-2小膠質(zhì)細胞株（中國醫(yī)學科學院基礎研究所）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（北京同仁化學公司）；NO檢測試劑盒（上海碧云天公司）；米諾環(huán)素（北京索萊寶公司）；Forma 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀（美國Thermo公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。

本課題研究用纈草藥材購自河北安國藥材市場（樣本編號201907140185），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學中藥學院李天祥教授鑒定為忍冬科纈草屬植物纈草L.的干燥根及根莖。該藥材的水提取物粉末（批號ZDV190418）由西安正東生物科技有限公司代提取并干燥獲得所有標本及樣本現(xiàn)存放于天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院藥學部。

2 方法

2.1 提取與分離

纈草水提取物800.0 g，4 L純水復溶后用等體積的醋酸乙酯萃取4次，合并4次萃取液，減壓濃縮回收溶劑后干燥得醋酸乙酯萃取部位8.2 g。剩余水溶液減壓濃縮后經(jīng)冷凍干燥得水溶性部位786.0 g。醋酸乙酯萃取部位進一步經(jīng)硅膠（200～300目）柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0、50∶50、30∶70、0∶100）洗脫，薄層色譜檢識合并，得到15個精細組分（E1～E15）。水溶性部位通過D101大孔樹脂（水、95%乙醇洗脫）得到水洗脫類組分513.0 g和95%乙醇洗脫類組分111.4 g。95%乙醇洗脫類組分用純水（600 mL）溶解后，調(diào)pH至4.05，等體積正丁醇萃取3次，濃縮干燥得到正丁醇萃取物7.4 g，進一步經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（85%甲醇）分離，獲得11個精細組分B1～B11。精細組分E11經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）、ODS開放柱色譜（甲醇-純水10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0），再經(jīng)制備型HPLC（25%、36%和25%乙腈，體積流量6 mL/min）純化得化合物1（1.1 mg，R＝10.6 min）、2（1.1 mg，R＝18.2 min）和9（1.0 mg，R＝18.5 min）。精細組分E9（0.2 g）經(jīng)ODS開放柱色譜，甲醇-純水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脫后經(jīng)制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇10∶1）進一步純化得到化合物3（1.5 mg）。精細組分B5（560.0 mg）經(jīng)ODS開放柱色譜甲醇-純水（10%、30%、50%、70%和100%）洗脫后經(jīng)制備型HPLC（56%乙腈，體積流量6 mL/min）得化合物4（1.0 mg，R＝40.0 min）、5（20.0 mg，R＝48.0 min）和10（14.0 mg，R＝52.0 min）。精細組分B3（1.5 g）經(jīng)ODS開放柱色譜甲醇-純水（10%、30%、50%、70%和100%）洗脫后經(jīng)制備型HPLC（55%乙腈，體積流量6 mL/min）得化合物6（2.2 mg，R＝24.7 min）。精細組分E6（0.4 g）經(jīng)ODS開放柱色譜，甲醇-純水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脫后通過制備型HPLC（40%乙腈，體積流量6 mL/min）得到化合物7（1.0 mg，R＝11.5 min）。精細組分E5（2.6 g），采用硅膠（200～300目）開放柱色譜二氯甲烷-甲醇（100∶0、50∶50、30∶70、0∶100）洗脫后經(jīng)制備型HPLC（42%乙腈，體積流量6 mL/min）制備得化合物8（3.2 mg，R＝15.2 min）。精細組分E13（0.5 g）和E14（1.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜甲醇洗脫除色素后合并，再經(jīng)ODS開放柱色譜，甲醇-水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脫，最后經(jīng)制備型HPLC（29%、33%乙腈，體積流量6 mL/min）純化得化合物11（10.1 mg，R＝13.5 min）和12（6.5 mg，R＝28.1 min）。

2.2 LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥的評價

纈草為忍冬科纈草屬多年生草本植物，藥理研究報道其具有一定的抗抑郁作用[8]。抑郁癥可能是一種“小膠質(zhì)細胞疾病”，因為小膠質(zhì)細胞激活是神經(jīng)炎癥的特征性改變，與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。因此，本研究利用LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥模型，使用Griess法[11]考察所分離得到的化合物對LPS誘導的BV-2細胞炎性因子NO含量的影響，評價其抑制神經(jīng)炎癥的活性。取纈草化合物適量溶于DMSO中（儲存濃度10 mmol/L）待用。BV-2細胞于DMEM＋10%FBS＋1%雙抗培養(yǎng)液中，置于5%CO2、95%空氣、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每隔1 d用胰酶消化傳代（1∶6）培養(yǎng)。

2.2.1 待測化合物對LPS誘導BV-2細胞活力的影響 設對照組、模型組、陽性藥組及藥物處理組。取對數(shù)期生長細胞，接種在48孔板中（4×105個/ mL，400 μL/孔）于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱過夜，對照組加入含0.1% DMSO的基礎培養(yǎng)基，模型組加入LPS（終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL），陽性藥組同時加入LPS和米諾環(huán)素（終濃度為10 μmol/L），藥物處理組同時加入LPS和配制好的待測化合物（終濃度為10 μmol/L），24 h后棄去上清加入含10 % CCK-8的培基（400 μL/孔），37 ℃孵箱中孵育30 min，用酶標儀于450 nm 處讀取吸光度（）值，考察待測化合物對LPS誘導小膠質(zhì)細胞活力的影響。

2.2.2 待測化合物對LPS誘導小膠質(zhì)細胞分泌NO的影響 設對照組、模型組、陽性藥組及藥物處理組。取對數(shù)生長期細胞，接種在48孔板中（4×105個/mL，400 μL/孔）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，過夜后對照組和模型組用基礎培基孵育，陽性藥組和藥物處理組用相應藥物處理，各組均先預孵育30 min，30 min后對照組加入0.1%的DMSO，模型組加入LPS（終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL），陽性藥組同時加入LPS和米諾環(huán)素（終濃度為10 μmol/L），藥物處理組同時加入LPS和配制好的待測化合物（終濃度為10 μmol/L），24 h后按照NO試劑盒說明書進行操作，測定540 nm波長處值，代入相應標準曲線（＝128.19－6.799 5，2＝0.998）計算NO濃度。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物，10%硫酸-乙醇溶液顯綠色。[α]25 D-39.2 (0.05, MeOH)；CD (0.05, MeOH)λ(Δε): 194.8 (＋3.61), 202.8 (＋2.60), 230.5 (＋6.89)；HR-ESI-MS在/409.148 5 [M＋H]+（計算值409.149 3，C20H25O9）處給出準分子離子峰，結(jié)合1D-NMR數(shù)據(jù)，提示其分子式為C20H24O9，不飽和度為9。紅外光譜顯示有甲基（C-H2919 cm?1和2854 cm?1）、芳環(huán)（1594 cm?1和1628 cm?1）和糖上醚鍵（C-O-C1076 cm?1）的特征吸收峰。UVmax(MeOH) nm(log):238.3(2.80)、250.0(1.60)、280.0(0.40)、336.9(0.60)。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.04 (1H, s, H-4), 6.97 (1H, d,= 2.1 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,= 2.1 Hz, H-7), 5.03 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 4.08 (3H, s, H3-1), 3.95 (1H, dd,= 12.0, 2.2 Hz, H-6a), 3.71 (1H, dd,= 12.1, 6.2 Hz, H-6b), 3.54 (1H, m, H-5), 3.50 (2H, m, H-2, 3), 3.39 (1H, ddd,= 9.2, 6.3, 2.8 Hz, H-4), 2.59 (3H, s, H3-10), 2.29 (3H, s, H3-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 207.9 (C=O), 159.2 (C-8), 158.5 (C-6), 154.2 (C-1), 139.0 (C-4a), 135.7 (C-3), 124.0 (C-2), 120.5 (C-4), 110.6 (C-8a), 105.0 (C-5), 102.3 (C-1), 99.3 (C-7), 78.4 (C-5), 78.0 (C-3), 74.9 (C-2), 71.5 (C-4), 62.6 (C-6), 57.0 (C-1), 32.5 (C-10), 20.2 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物1為tinnevellin-8--β--glucopyranoside。

化合物2：黃色無定形粉末，分子式為 C21H20O10。(-)-HR-ESI-MS/431.098 3 [M－H]?（計算值431.098 4，C21H19O10）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.52 (1H, s, H-4), 7.30 (1H, s, H-5), 7.07 (1H, s, H-2), 7.01 (1H, s, H-7), 4.95 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.95 (1H, dd,= 12.0, 1.8 Hz, H-6a), 3.77 (1H, dd,= 12.0, 4.8 Hz, H-6b), 3.64 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2), 3.53 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3), 3.51 (1H, m, H-5), 3.47 (1H, t,= 9.0 Hz, H-4), 2.42 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 188.4 (C-9), 184.5 (C-10), 163.7 (C-1), 163.5 (C-6), 163.5 (C-8), 148.2 (C-3), 138.1 (C-10a), 134.2 (C-4a), 125.2 (C-2), 120.6 (C-4), 116.3 (C-9a), 113.5 (C-8a), 113.4 (C-5), 112.2 (C-7), 104.4 (C-1), 78.7 (C-5), 77.4 (C-3), 74.8 (C-2), 71.2 (C-4), 62.5 (C-6), 21.9 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物2為大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物3：白色無定形粉末，分子式為 C18H18O7。[α]25 D＋32.0 (0.05, MeOH)；CD (0.01, MeOH)λ(Δε): 213.7 (＋3.02), 228.6 (-5.70), 259.3 (＋4.00), 277.8 (＋1.31), 293.2 (＋2.35)。(＋)-HR- ESI-MS/347.111 8 [M＋H]+（計算值347.112 5，C18H19O7）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.57 (1H, d,= 1.1 Hz, H-6), 7.52 (1H, s, H-4), 6.95 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.83 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 5.61 (1H, d,= 6.0 Hz, H-2), 3.89 (3H, s, 7-OCH3), 3.87 (2H, m, H-9), 3.81 (3H, s, 3-OCH3), 3.52 (1H, dt,= 11.2, 5.9 Hz, H-3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 174.4 (C-8), 151.5 (C-7a), 149.1 (C-3), 147.6 (C-4), 144.6 (C-7), 134.6 (C-1), 132.8 (C-5), 129.0 (C-3a), 119.80 (C-4), 119.77 (C-6), 116.2 (C-5), 115.2 (C-6), 110.5 (C-2), 89.8 (C-2), 64.9 (C-9), 56.5 (7-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 55.1 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物3為 (2,3)-肥牛木素。

化合物4：黃色無定形粉末，分子式為C26H34O12。[α]25 D-12.0 (0.05, MeOH)。(-)-HR-ESI- MS/537.198 0 [M－H]?（計算值537.197 8，C26H33O12）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.00 (1H, d,= 7.8 Hz, H-6), 6.97 (1H, s, H-2), 6.89 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 6.88 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 6.83 (1H, d,= 7.8 Hz, H-6), 4.81 (1H, d,= 7.8 Hz, H-7), 4.44 (1H, d,= 8.4 Hz, H-1"), 4.11 (1H, m, H-9a), 3.97 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 3.91 (1H, d,= 7.5 Hz, H-6"a), 3.90 (1H, dd,= 12.6, 7.2 Hz, H-9b), 3.88 (3H, s, 3-OCH3), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 3.71 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-9b), 3.70 (1H, d,= 9.6 Hz, H-6"b), 3.48 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3"), 3.43 (1H, m, H-5"), 3.38 (1H, t,= 9.0 Hz, H-4), 3.29 (1H, t,= 9.0 Hz, H-2"), 3.07 (1H, d,= 14.0 Hz, H-7a), 2.99 (1H, d,= 14.0 Hz, H-7b), 2.61 (1H, q,= 6.8 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 150.7 (C-3), 150.1 (C-3), 148.9 (C-4), 146.9 (C-4), 135.4 (C-1), 132.2 (C-1), 126.1 (C-6), 123.4 (C-6), 118.4 (C-5), 118.3 (C-5), 117.7 (C-2), 114.2 (C-2), 105.6 (H-1), 87.2 (C-7), 84.2 (C-8), 79.2 (C-9), 78.8 (C-3), 78.5 (C-5"), 76.0 (C-2), 72.6 (C-4), 70.6 (C-9), 63.6 (C-6), 60.3 (C-8), 58.9 (3-OCH3), 58.8 (3-OCH3), 41.7 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物4為左旋橄欖素-9--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物5：黃色無定形粉末，分子式為C26H34O13。[α]25 D-11.8 (0.78, MeOH)。(＋)-HR-ESI- MS/555.207 0 [M＋H]+（計算值555.207 2，C26H35O13）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.08 (1H, s, H-2), 7.01 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2), 6.93 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.92 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5), 6.91 (1H, d,= 2.4 Hz, H-6), 6.85 (1H, dd,= 8.2, 1.3 Hz, H-6), 5.16 (1H, s, H-2), 4.50 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.18 (1H, d,= 10.8 Hz, H-3aa), 3.97 (1H, d,= 9.6 Hz, H-5a), 3.94 (1H, dd,= 9.0, 1.8 Hz, H-3ab), 3.92 (1H, m, H-6a), 3.89 (3H, s, 3-OCH3), 3.88 (3H, s, 3-OCH3), 3.76 (1H, m, H-5b), 3.74 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-6b), 3.53 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3), 3.48 (1H, ddd,= 8.2, 6.0, 2.1 Hz, H-5), 3.41 (1H, t,= 9.6 Hz, H-4), 3.36 (1H, t,= 9.6 Hz, H-2), 3.03 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4aa), 2.95 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4ab)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 150.0 (C-3), 149.99 (C-3), 147.8 (C-4), 146.7 (C-4), 132.3 (C-1), 131.9 (C-1), 126.3 (C-6), 123.7 (C-6), 118.2 (C-5), 117.9 (C-5), 117.8 (C-2), 115.0 (C-2), 105.6 (C-1), 87.4 (C-2), 84.3 (C-4), 83.5 (C-3), 78.9 (C-5), 78.5 (C-3), 76.0 (C-2), 75.1 (C-5), 73.9 (C-3a), 72.6 (C-4), 63.6 (C-6), 58.8 (3, 3-OCH3), 41.5 (C-4a)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物5為左旋馬尾松樹脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物6：白色無定形粉末，分子式為C27H28N2O4。(＋)-HR-ESI-MS/445.211 2 [M＋H]+（計算值445.212 2，C27H29N2O4）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.72 (2H, dd,= 8.3, 1.2 Hz, H-3, 7), 7.53 (1H, t,= 7.2, 1.2 Hz, H-5), 7.44 (2H, t,= 7.7 Hz, H-4, 6), 7.11～7.26 (10H, overlapped, H-5, 6, 7, 8, 9,5～9), 4.78 (1H, m, H-2), 4.31 (1H, m, H-2), 3.98 (1H, dd,= 11.2, 4.4 Hz, H-1a), 3.91 (1H, dd,= 11.2, 6.1 Hz, H-1b), 3.13 (1H, dd,= 13.7, 6.8 Hz, H-3a), 2.99 (1H, dd,= 13.7, 8.4 Hz, H-3b), 2.85 (1H, dd,= 13.8, 6.7 Hz, H-3a), 2.79 (1H, dd,= 13.8, 7.9 Hz, H-3b), 2.01 (3H, s, 1OCOCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 173.3 (1OCO), 172.6 (C-1), 169.9 (C-1), 138.9 (C-4), 138.5 (C-4), 135.3 (C-2), 132.9 (C-5), 130.4 (C-6, 8), 130.3 (C-6, 8), 129.51 (C-46), 129.48 (C-5, 9, 5, 9), 128.5 (C-3, 7), 127.8 (C-7), 127.5 (C-7), 66.1 (C-1), 56.6 (C-2), 51.2 (C-2), 39.0 (C-3), 38.1 (C-3), 20.7 (1OCOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物6為金色酰胺醇乙酸酯。

化合物7：白色無定形粉末，分子式為C20H22O6。(-)-HR-ESI-MS/357.133 3 [M－H]?（計算值357.134 4，C20H21O6）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.05 (2H, d,= 1.8 Hz, H-2, 2), 6.85 (2H, dd,= 8.4, 1.8 Hz, H-6, 6), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 5), 4.97 (2H, s, H-7, 7), 4.10 (2H, d,= 9.6 Hz, H-9, 9), 3.98 (2H, d,= 9.6 Hz, H-8, 8), 3.86 (6H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 148.7 (C-3, 3), 147.5 (C-4, 4), 129.6 (C-1, 1), 121.6 (C-6, 6), 116.3 (C-8, 8), 115.6 (C-5, 5), 112.9 (C-2, 2), 89.1 (C-7, 7), 76.7 (C-9, 9), 56.4 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[18-19]，故鑒定化合物7為松脂素。

化合物8：白色無定形粉末，分子式為C20H22O7。[α]25 D＋33.0 (0.10, MeOH)。(＋)-HR-ESI- MS/375.142 9 [M＋H]+（計算值375.143 8，C20H23O7）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.05 (2H, d,= 2.0 Hz, H-2, 2), 6.87 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.85 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 5), 4.84 (1H, s, H-7), 4.68 (1H, s, H-7), 4.46 (1H, dd,= 9.1, 8.2 Hz, H-8), 4.04 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 3.87 (3H, s, -OCH3), 3.86 (3H, s, -OCH3), 3.86 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9b), 3.76 (1H, dd,= 9.0, 6.0 Hz, H-9a), 3.04 (1H, dt,= 8.2, 5.8 Hz, H-9b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 149.1 (C-3), 148.7 (C-3), 147.5 (C-4), 147.4 (C-4), 133.6 (C-1), 129.1 (C-1), 121.6 (C-6), 120.5 (C-6), 116.0 (C-5), 115.7 (C-5), 112.8 (C-2), 111.3 (C-2), 92.8 (C-8), 89.3 (C-7), 87.8 (C-7), 76.1 (C-9), 72.0 (C-9), 62.4 (C-8), 56.39 (-OCH3), 56.38 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物8為8-羥基松脂素。

化合物9：白色無定形粉末，分子式為 C26H32O11。(＋)-HR-ESI-MS/521.203 2 [M＋H]+（計算值521.201 7，C26H33O11）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 7.03 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 6.92 (1H, dd,= 8.4, 1.8 Hz, H-5), 6.81 (1H, dd,= 8.1, 1.8 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 4.88 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1″), 4.76 (1H, d,= 4.0 Hz, H-7), 4.71 (1H, d,= 4.0 Hz, H-7), 4.23～4.27 (2H, m, H-9), 3.85～3.88 (2H, m, H-9), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 3.69 (1H, dd,= 11.5, 3.6 Hz, H-6a), 3.52～3.44 (2H, m, H-2″, 3″), 3.39 (1H, m, H-6b), 3.39 (1H, d,= 6.8 Hz, H-8), 3.14 (1H, d,= 4.4 Hz, H-8), 3.14 (2H, m, H-4″, 5″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 151.0 (C-3), 149.1 (C-3), 147.5 (C-4), 147.4 (C-4), 137.5 (C-1), 133.8 (C-1), 120.1 (C-5), 119.8 (C-5), 118.0 (C-6), 116.1 (C-6), 111.6 (C-2), 111.0 (C-2), 102.9 (C-1"), 87.5 (C-7), 87.1 (C-7), 74.9 (C-3"), 55.5 (C-8), 55.4 (C-8), 78.2 (C-2"), 77.9 (C-4"), 72.73 (C-9), 72.68 (C-9), 71.3 (C-5"), 62.5 (C-6"), 56.7 (-OCH3), 56.4 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物9為松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物10：白色無定形粉末，分子式為C26H32O13。[α]25 D-60.0 (0.73, MeOH)。(-)-HR-ESI- MS/551.177 0 [M－H]?（計算值551.177 0，C26H31O13）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.22 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 7.16 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.10 (1H, s, H-2), 7.04 (1H, dd,= 8.4, 1.6 Hz, H-6), 6.95 (2H, s, H-5, 6), 5.20 (1H, s, H-7), 5.16 (1H, s, H-7), 5.15 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1″), 4.27 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 4.26 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9b), 4.05 (2H, d,= 9.6 Hz, H-9), 3.93 (1H, dd,= 12.0, 2.4 Hz, H-6″b), 3.91 (3H, d,= 12.8 Hz, 3-OCH3), 3.89 (3H, d,= 12.8 Hz, 3-OCH3), 3.76 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-6″a), 3.61～3.65 (3H, m, H-3″～5″), 3.52 (1H, t,= 9.0 Hz, H-2″)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 151.4 (C-3), 150.3 (C-3), 148.3 (C-4), 148.2 (C-4), 134.0 (C-1), 130.7 (C-1), 123.3 (C-6), 122.9 (C-6), 118.5 (C-5), 118.2 (C-5), 114.6 (C-2), 114.5 (C-2), 103.3 (C-1″), 90.8 (C-8), 90.7 (C-8), 90.0 (C-7), 89.8 (C-7), 79.0 (C-3″), 78.4 (C-5″), 77.4 (C-9), 77.3 (C-9), 75.7 (C-4″), 72.2 (C-2″), 63.4 (C-6″), 58.80 (3-OCH3), 58.76 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[5]，故鑒定化合物10為8,8-二羥基松脂素- 4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物11：黃色無定形粉末，分子式為C28H34O15。[α]25 D-37.2 (0.50, MeOH)；CD (0.02, MeOH)λ(Δε): 331.9 (-1.71), 238.8 (＋0.50), 209.9 (＋4.50), 193.2 (＋7.29), 289.8 (＋3.62), 222.3 (-1.42), 202.6 (＋0.19)。(＋)-HR-ESI-MS/611.195 7 [M＋H]+（計算值611.197 0，C28H35O15）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.01 (1H, s, 5-OH), 9.09 (1H, s, 3-OH), 6.95 (1H, d,= 8.3 Hz, H-6), 6.93 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.90 (1H, d,= 8.3, 1.9 Hz, H-5), 6.14 (1H, m, H-6), 6.12 (1H, m, H-8), 5.49 (1H, dd,= 12.3, 3.0 Hz, H-2), 4.98 (1H, t,= 7.7 Hz, H-1), 4.51 (1H, s, H-1), 3.77 (3H, s, 4-OCH3), 3.14 (1H, dd,= 18.3, 5.2 Hz, H-3a), 2.76 (1H, dd,= 17.0, 3.0 Hz, H-3b), 1.09 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 197.1 (C-4), 165.1 (C-7), 163.0 (C-5), 162.6 (C-9), 148.0 (C-4), 146.5 (C-3), 131.0 (C-1), 118.0 (C-6), 114.2 (C-5), 112.1 (C-2), 103.3 (C-10), 100.6 (C-1), 99.4 (C-1), 96.4 (C-6), 95.6 (C-8), 78.4 (C-2), 76.3 (C-3), 75.5 (C-5), 73.0 (C-2), 72.1 (C-4), 70.7 (C-3), 70.3 (C-2), 69.6 (C-4), 68.3 (C-5), 66.1 (C-6), 55.6 (-OCH3), 42.2 (C-3), 17.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[22-25]，故鑒定化合物11為 (2)-橙皮苷。

化合物12：黃色無定形粉末，分子式為C28H34O14。[α]25 D-42.7 (0.52, MeOH)；CD (0.06, MeOH)(Δε): 305.0 (-0.12), 244.0 (-0.02), 224.2 (＋0.48), 203.5 (＋0.17), 286.0 (-0.58), 235.6 (-0.18), 216.0 (＋0.54), 195.1(＋0.84)。(＋)-HR-ESI-MS/595.2013 [M＋H]+（計算值595.202 1，C28H35O14）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.01 (1H, s, 5-OH), 7.47 (2H, m, H-2, 6), 6.99 (2H, dd,= 8.9, 2.7 Hz, H-3, 5), 6.14 (2H, s, H-6, 8), 5.58 (1H, m, H-2), 4.98 (1H, t,= 8.1 Hz, H-1), 4.52 (1H, s, H-1), 3.77 (3H, s, 4-OCH3), 3.12 (1H, m, H-3a), 2.78 (1H, ddd,= 17.0, 10.2, 2.9 Hz, H-3b), 1.09 (3H, dd,= 6.3, 3.9 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 197.1 (C-4), 165.1 (C-7), 163.0 (C-5), 162.6 (C-9), 159.5 (C-4), 130.5 (C-1), 128.5 (C-6), 128.3 (C-2), 113.95 (C-5), 113.91 (C-3), 103.3 (C-10), 100.6 (C-1), 99.3 (C-1), 96.5 (C-6), 95.5 (C-8), 78.4 (C-2), 76.3 (C-5), 75.6 (C-3), 73.0 (C-2), 72.1 (C-4), 70.7 (C-4), 70.3 (C-3), 69.6 (C-2), 68.3 (C-5), 66.0 (C-6), 55.2 (4-OCH3), 42.3 (C-3), 17.85 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[26]，故鑒定化合物12為香蜂草苷。

3.2 抗神經(jīng)炎癥活性評價

化合物3、4、6、9、11、12在不影響B(tài)V-2細胞的細胞活力情況下，可以一定程度上抑制LPS誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎性因子NO的產(chǎn)生（圖2），抑制率分別為23.01%、7.35%、12.12%、13.37%、14.60%和15.75%（表1），其中化合物3 [(2,3)- 肥牛木素]的活性最強，而化合物5、7～8、10在10 μmol/L的濃度下不能顯著抑制LPS誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎性因子NO的產(chǎn)生。

MI-陽性對照米諾環(huán)素；與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

表1 化合物3～12對LPS誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎性因子NO的抑制率

4 討論

本實驗從纈草水提取物萃取得到的醋酸乙酯部位和水溶性部位中共分離得到12個化合物，主要包括木脂素7個、黃酮2個、二肽1個、蒽醌1個和萘酚糖苷1個，其中化合物1～4和6為5個首次從纈草屬植物分離得到的化合物。神經(jīng)炎癥活性評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中化合物3～4、6、9、11～12均有不同程度抑制LPS誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎癥的作用。本研究豐富了纈草屬植物的化學成分，為該屬植物的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from water-soluble extract of

WU Xi-le1, LI Ran1, LI Shi-wei1, ZHANG Li-hua1, HAN Li-feng1, ZHANG Yi1, WANG Tao1, WANG Shao-xia2, WU Hong-hua1

1. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. School of Integrative Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the chemical constituents of the water-soluble extract of.Silica gel and ODS column chromatography, preparative high-performance liquid chromatography were applied for isolation of constituents from the water-soluble extract. NMR, MS and other related spectroscopic analyses were used to identify their structures, and a Griess method was used to evaluate their inhibitory activity on lipopolysaccharide-induced inflammation of BV-2 cells.Twelve compounds were isolated and identified as tinnevellin-8--β--glucopyranoside (1), emodin-8-β--glucopyranoside (2), (2,3)-ceplignan (3), (?)-olivil-9--β--glucopyranoside (4), (?)-massoniresinol-3a--β--glucopyranoside (5), aurantiamide acetate (6), pinoresinol (7), 8-hydroxypinoresinol (8), pinoresinol-4--β--glucopyranoside (9), prinsepiol-4--β-- glucopyranoside (10), (2)-hesperidin (11) and didymin (12).Compounds 1―4 and 6 are firstly isolated from the genus. Compound 3―4、6、9、11―12 showed inhibition on the production of neuroinflammatory factor NO induced by LPS in BV-2 cells, without any detectable influence on the cell viabilities.

L.; naphthol glycoside; lignans; emodin-8-β--glucopyranoside; (2,3)-ceplignan; (?)-olivil-9--β--glucopyranoside; aurantiamide acetate

R284.1

A

0253 - 2670(2022)23 - 7331 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.003

2022-06-15

國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1707904）；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2018ZX09735-002）；天津市中央引導地方科技發(fā)展專項（21ZYJDJC00080）

吳肸樂（1994—），女，碩士研究生，研究方向為中藥化學藥效物質(zhì)基礎。E-mail: 1154986475@qq.com

通信作者：吳紅華（1983—），男，碩士生導師，副研究員。Tel: (022)59791833 E-mail: wuhonghua2011@tjutcm.edu.cn

[責任編輯 王文倩]