余 平，梁 鵬，龐詩(shī)鋒，袁文健，黃巧娟

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西南寧 530007)

心力衰竭是心血管疾病常見(jiàn)的最終結(jié)果，具有高致死率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，持續(xù)過(guò)度的心肌重構(gòu)是心衰發(fā)生的基本病理過(guò)程。大量研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制心肌細(xì)胞凋亡是改善心臟功能的治療策略之一[1,2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族的成員，廣泛分布于骨骼和心臟等組織和器官。BMP可通過(guò)調(diào)控心肌纖維化、心肌炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡等過(guò)程參與心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[3]。研究顯示，心肌組織中含量最豐富的骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(Bone Morphogenetic Protein 7,BMP7)具有顯著的抗缺血效應(yīng)[4,5]，并可抑制心肌纖維化從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用[6]。然而，BMP7對(duì)缺血所致心衰心臟功能的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究旨在利用心梗后心衰大鼠模型，探究早期應(yīng)用BMP7治療對(duì)心梗后心衰的作用及其機(jī)制，為臨床防治心梗后心衰提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量為230-250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(桂)2020-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度(32±2)℃、濕度50%-60%的環(huán)境中，每日交替進(jìn)行12 h光照和12 h黑暗，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 主要藥物和試劑

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)，購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；B淋巴細(xì)胞瘤因子相關(guān)X (Bax)蛋白抗體、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗體、磷酸化的核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 (p-NF-κB p65)均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V9，上海奧爾科特生物科技有限公司)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420F，四川成都泰盟科技有限公司)，多普勒超聲診斷儀(sonos7500，荷蘭Philips公司)，熒光顯微鏡(IX70，日本Olympus公司)，多功能酶標(biāo)儀(Varioskan LUX，美國(guó)Thermo公司)，電泳凝膠成像系統(tǒng)(ChemiScope 3300，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心衰模型制備及動(dòng)物分組

大鼠禁食12 h后，采用2% 3 mL/kg戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉后，在ALC-V9動(dòng)物呼吸機(jī)的支持下，于左側(cè)胸部備皮并切開(kāi)皮膚，打開(kāi)胸腔及心包，充分暴露心臟，并在左心耳根部下方2-3 mm處用6-0號(hào)縫合針永久結(jié)扎，且保證梗死面積大于30%[7]，以結(jié)扎瞬間心前區(qū)心肌由紅變白、心臟運(yùn)動(dòng)減弱和心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上抬高的特征性表現(xiàn)作為心肌缺血造模成功的標(biāo)志。術(shù)畢觀察數(shù)分鐘心電圖后，用鈍頭注射器抽出胸腔氣體形成胸腔負(fù)壓，并逐層縫合胸壁及皮膚。再次觀察大鼠的呼吸狀況，并用體溫計(jì)監(jiān)測(cè)肛溫，同時(shí)利用加熱燈使其體溫保持在(37±0.5)℃，接著在肌肉內(nèi)注射2.5×104U青霉素預(yù)防感染。

術(shù)后12 h成功存活的大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為心肌梗死(MI)組和心肌梗死+BMP7(MI+BMP7)組，每組8只。其中，MI+BMP7組尾靜脈注射BMP7(35 μg·kg-1)[6]，MI組尾靜脈注射與BMP7等體積的0.9%生理鹽水，每周1次。另外選取6只正常SD大鼠作為假手術(shù)(Sham)組，尾靜脈注射與BMP7等體積的0.9%生理鹽水，并接受同樣的手術(shù)操作，但不結(jié)扎左前降支。各實(shí)驗(yàn)大鼠從術(shù)后第2天開(kāi)始給予藥物或生理鹽水連續(xù)4周，其中Sham組全部存活，MI組存活6只，MI+BMP7組存活7只。手術(shù)4周后經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%，即心力衰竭大鼠造模成功[8]。

1.2.2 心臟超聲檢測(cè)

待各組干預(yù)4周后行超聲心動(dòng)圖檢查。采用2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉并固定，左側(cè)胸部備皮，使用彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD，mm)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD，mm)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF，%)、左室短軸縮短率(LVFS，%)，所有數(shù)據(jù)均測(cè)量3次取平均值。

1.2.3 血漿NT-proBNP含量測(cè)定

超聲檢測(cè)結(jié)束后，剪開(kāi)大鼠腹腔，腹主動(dòng)脈取血置于抗凝采血管中，隨后3 000 r/min離心15 min，吸取血漿，于-80℃低溫保存待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠血漿NT-proBNP的表達(dá)情況。

1.2.4 心肌組織病理檢測(cè)

采血結(jié)束后，剪開(kāi)大鼠胸腔，將心臟迅速取出并放入10%氯化鉀溶液中，使心臟停搏于舒張期。用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖凈心臟中的血液，并剔除非心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片，然后按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

切片脫蠟水化后，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并在鏡下觀察心肌細(xì)胞的凋亡情況，綠色熒光即為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，然后每張切片在缺血部位選取3個(gè)高倍鏡視野，分別計(jì)算凋亡指數(shù)(AI),即AI=(凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)測(cè)定

取100 mg缺血部位的心肌組織在RIPA裂解液中充分勻漿，提取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定并調(diào)整各組蛋白濃度一致，取35 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(TBST)洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，再次TBST洗滌后加入ECL發(fā)光液孵育顯影，并用Image-J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP7對(duì)心梗后心衰大鼠左心室功能的影響

心肌梗死4周后，大鼠心臟的收縮功能顯著降低(圖1)。由表1可知，藥物干預(yù)4周后，與Sham組相比，MI組和MI+BMP7組的LVEDD值和LVESD值顯著增加，而LVEF值和LVFS值顯著降低(P<0.05)，表明左心室擴(kuò)張及收縮功能障礙。與MI組相比，MI+BMP7組LVEF值和LVFS值均顯著增加(P<0.05)。

圖1 大鼠超聲心動(dòng)圖Fig.1 Echocardiogram of rats

表1 大鼠心功能的超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 Table 1 Comparison of echocardiographic indexes of cardiac function in rats

2.2 BMP7對(duì)心梗后心衰大鼠血漿NT-proBNP表達(dá)的影響

NT-proBNP作為心衰診斷及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其表達(dá)變化與左心室重構(gòu)密切相關(guān)，NT-proBNP的低表達(dá)可能是心臟反向重塑的重要指標(biāo)[9,10]。由圖2可知，與Sham組相比，MI組大鼠血漿NT-proBNP含量顯著增加(P<0.05)；與MI組相比，MI+BMP7組大鼠血漿NT-proBNP含量顯著降低(P<0.05)。該結(jié)果表明BMP7可顯著抑制心肌重構(gòu)，改善心臟功能和心肌梗死大鼠的預(yù)后情況。

2.3 BMP7對(duì)心梗后心衰大鼠心肌纖維及炎癥反應(yīng)的影響

Sham組心肌纖維排列均勻有序且分界清晰，未見(jiàn)明顯炎癥及出血。MI組心肌組織出現(xiàn)大面積梗死，組織內(nèi)出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞壞死和心肌纖維化，纖維化程度與本課題組此前的研究結(jié)果(Masson染色)一致[11]，伴有淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與MI組相比，MI+BMP7組心肌纖維斷裂壞死減少，纖維化程度及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。結(jié)果如圖3所示。

Compared with Sham group,#P<0.05;Compared with MI group,*P<0.05圖2 大鼠血漿NT-proBNP的表達(dá)水平Fig.2 Expression level of plasma NT-proBNP in rats

圖3 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果Fig.3 HE staining results of myocardial tissue of rats

2.4 BMP7對(duì)心梗后心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

由圖4可知，與Sham組相比，MI組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡率增加；與MI組相比，MI+BMP7組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。

#P<0.05 compared with Sham group;*P<0.05 compared with MI group圖4 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡Fig.4 Detection of cardiomyocyte apoptosis by TUNEL staining

2.5 BMP7對(duì)心梗后心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖5可知，與Sham組相比，MI組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與MI組相比，MI+BMP7組可顯著上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。MI組心肌組織中Bax、Cleaved caspase-3和p-NF-κB p65蛋白水平顯著高于Sham組(P<0.05)，MI+BMP7組顯著低于MI組(P<0.05)。

#P<0.05 compared with Sham group; *P<0.05 compared with MI group圖5 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression level of apoptosis-associated proteins in myocardial tissue of rats

3 討論

心肌重構(gòu)既是心衰發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，又是心功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。雖然已有多種藥物能逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，但是心衰患者在5年內(nèi)的死亡率仍高達(dá)50%[13,14]。因此，尋找更有效的藥物或治療靶點(diǎn)以減緩心力衰竭的發(fā)展并改善患者預(yù)后具有重要的意義。近年來(lái)的研究表明，BMP7具有顯著的抗缺血效應(yīng)[4,5]，還可以減輕心肌纖維化，對(duì)心肌有保護(hù)作用，但其對(duì)心梗后心衰大鼠心功能的影響及具體作用機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死4周后大鼠心臟的收縮功能顯著降低，外源性給予BMP7可改善左心室收縮功能，因此減輕心臟擴(kuò)張、抑制心肌細(xì)胞凋亡可能是實(shí)現(xiàn)上述作用的機(jī)制之一。

超聲心動(dòng)圖作為臨床上評(píng)價(jià)心力衰竭最常用的檢測(cè)手段，其中LVEF和LVFS是反映左心室收縮功能最有價(jià)值的指標(biāo)[15]。研究結(jié)果顯示，模型組在未經(jīng)BMP7治療的情況下，LVEF值和LVFS值均明顯降低，且LVEF值<45%，提示左前降支結(jié)扎4周后大鼠出現(xiàn)明顯的心力衰竭[8]。與MI組相比，MI+BMP7組的LVEF值和LVFS值均顯著增加，提示早期BMP7治療可減輕心衰程度，改善心梗后的心臟功能。HE染色結(jié)果顯示，BMP7的干預(yù)使大鼠心肌纖維斷裂壞死減少，纖維化程度及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，從病理學(xué)角度印證了上述結(jié)論。

心肌細(xì)胞屬于不可再生的永久性細(xì)胞，凋亡作為心肌細(xì)胞進(jìn)行性丟失的主要原因，能促進(jìn)心肌梗死后心臟發(fā)展成心力衰竭[16]。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及多種蛋白，其中Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，兩者分別發(fā)揮抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的作用。此外，Caspase-3的激活也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。大量研究表明，Bcl-2/Bax比值的上調(diào)和Caspase-3活性的下調(diào)可降低心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞的凋亡[17,18]。近年來(lái)，先天性免疫在心血管病理學(xué)的發(fā)展以及心肌保護(hù)中發(fā)揮著極其重要的作用，而NF-κB p65活化又是該過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19]。NF-κB p65的激活在心血管疾病中的作用取決于激活時(shí)間和細(xì)胞環(huán)境[20]。臨床研究表明，NF-κB p65的激活與心力衰竭密切相關(guān)，心力衰竭患者的心肌組織均表現(xiàn)出NF-κB p65的高活化狀態(tài)[20,21]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌梗死后NF-κB p65慢性或持續(xù)性的激活將導(dǎo)致心肌組織炎癥的持續(xù)存在，細(xì)胞凋亡水平增加，進(jìn)而發(fā)展成心力衰竭；而抑制NF-κB p65的激活可降低細(xì)胞凋亡水平，改善心臟功能[22]。

本研究中TUNEL染色和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與Sham組相比，MI組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和活化的Caspase-3的表達(dá)顯著增高，且Bcl-2/Bax比值顯著降低，這進(jìn)一步證實(shí)了心肌細(xì)胞凋亡是心衰發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。早期給予BMP7治療，心梗大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)減少，同時(shí)心梗引起的p-NF-κB p65高表達(dá)也明顯降低，提示BMP7干預(yù)對(duì)心梗后心臟有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB p65激活和Caspase-3信號(hào)通路從而減少心梗后心肌細(xì)胞凋亡。Urbina等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠糖尿病心肌模型中，BMP7可通過(guò)磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)途徑來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡。Xu等[5]研究表明，外源性過(guò)表達(dá)BMP7可減輕缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與NF-κB的核易位有關(guān)。以上研究結(jié)果均與本研究的結(jié)果相符。

4 結(jié)論

早期使用外源性BMP7對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用，可在一定程度上抑制心衰進(jìn)展，其機(jī)制涉及抑制NF-κB p65活化和Caspase-3信號(hào)通路，通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮改善心臟功能的作用，這也為心梗后心衰的防治提供了一個(gè)新的治療方向。