吳思瀅，黃炳耀，潘東進，岑 英，余林嬋，姚紹嫦**

(1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530200；2 廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)屬于硅藻門(Bacillariophyta)羽紋綱(Pennatae)，其體內富含活性物質，如二十碳五烯酸(EPA)、巖藻黃素和甘油脂等，是一種優(yōu)質的蛋白餌料、藥物與潛在的生物柴油原材料[1]。巖藻黃素是一類珍稀的含氧類胡蘿卜素，不僅能與葉綠素a(chla)/葉綠素c(chlc)形成蛋白復合物，在光合系統(tǒng)的光捕獲與光傳遞方面發(fā)揮重要作用，而且可作為藥品或保健品，具有抗氧化、減肥、抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎、保護視網(wǎng)膜光損傷、保肝等功效，還可以預防前列腺癌、結腸癌、腦膠質瘤等疾病[2,3]。

氮元素是植物生長發(fā)育必需的元素之一，其參與了蛋白質、核酸等許多生物大分子的合成。硝酸鹽作為一種常見的氮源，被藻細胞吸收后迅速還原成亞硝酸鹽，然后被轉運到葉綠體，同化為氨基酸與其他含氮化合物[4]。隨著人們對硅藻氮代謝途徑的深入研究，越來越多的研究人員開始關注三角褐指藻在氮脅迫條件下的生長狀態(tài)，及其對海洋變暖導致的營養(yǎng)鹽限制等環(huán)境變化的適應能力。大量研究表明，氮限制可抑制三角褐指藻的生長，降低其葉綠素a含量，并加劇其受光抑制程度，抑制巖藻黃素的合成，促進油脂的合成[4-6]。

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是防御反應中的關鍵信號分子，在參與植物對非生物脅迫的應答過程中發(fā)揮著十分重要的作用。NO對植物抗逆性的調控作用及機制一直以來都是植物學界研究的熱點，但是目前研究的品種主要集中在花生、水稻、擬南芥等少數(shù)植物上，對海洋單細胞微藻的研究較少[7]。已有研究表明，一些藻類物種擁有不同于胚胎植物的保守一氧化氮合酶，可能存在不同的途徑催化NO的合成[7]。在氮脅迫和高光條件下，褪黑素刺激雨生紅球藻細胞產(chǎn)生NO與水楊酸(SA)，兩者相互作用促進巖藻黃素與脂肪酸的積累[8]。NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside,SNP)能自發(fā)釋放NO，適當濃度(1.0 mmol/L)的SNP處理能緩解一定濃度的鋁對花生根生長的毒害作用[9]。與單獨鹽脅迫(3.0 mol/L)相比，添加低濃度的SNP (0.5-1.0 μmol/L)能促進杜氏鹽藻的生長，顯著提高其葉綠素含量[10]。劉路平[11]發(fā)現(xiàn)SNP對小球藻生長的調節(jié)具有雙重性，存在“低促高抑”現(xiàn)象，當SNP大于0.5 mmol/L時，小球藻的生長受到明顯的抑制。因此，NO可能脅迫響應的內源調節(jié)因子，提高或降低抗逆性，但其發(fā)生作用方式可能與濃度及脅迫條件有關。

本研究以硅藻三角褐指藻為研究對象，通過添加外源NO供體SNP及NO清除劑[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-teramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，cPTIO]，探討外源NO在調控三角褐指藻響應氮脅迫中的作用，研究結果將為闡釋硅藻響應氮脅迫的作用機制提供直接證據(jù)，同時還可為今后通過改進硅藻的培養(yǎng)條件來提高生物量及目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提供指導。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實驗采用的三角褐指藻株系為GY-H9，來源于上海光語生物科技有限公司，于廣西中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源研究團隊實驗室保存。利用f/2培養(yǎng)基進行三角褐指藻的培養(yǎng)與保存。

1.2 儀器設備

光學顯微鏡(Leica DM2000，德國徠卡儀器有限公司)，全波長多功能酶標儀(Tecan Infinite 200 Pro，瑞士帝肯公司)，便攜式調制葉綠素熒光儀(PAM-2500，德國 WALZ公司)，倒置熒光顯微鏡(Leica DM2500，德國徠卡儀器有限公司)，高效液相色譜儀(LC40，日本島津公司)。

1.3 培養(yǎng)條件與處理

將三角褐指藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天手動搖瓶 3 次。培養(yǎng)條件為光照強度100 μmol photons/(m2·s)，光照周期為光照∶黑暗=12 h∶12 h，培養(yǎng)箱溫度(20±1)℃。每6 d按照藻種∶f/2培養(yǎng)液=1∶1(V∶V)的比例進行擴大培養(yǎng)。

以NaNO3為氮源，初始濃度分別為0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L，其中以0.8 mmol/L為適宜濃度(CK)，初始接種藻細胞密度為1.00×106cell/mL，連續(xù)培養(yǎng)6 d，每24 h利用光學顯微鏡與血球計數(shù)法[10]統(tǒng)計細胞數(shù)量，每個處理3次生物學重復。

選取在0.8 mmol/L NaNO3濃度下生長6 d的三角褐指藻細胞進行以下處理：①缺氮(N-)；②缺氮+NO供體SNP，即N-+200 μmol/L SNP(N-+SNP)；③ 缺氮+NO清除劑cPTIO，即N-+50 μmol/L cPTIO (N-+cPTIO)；④氮正常(N，0.8 mmol/L)；⑤ 氮正常+NO供體SNP，即N+200 μmol/L SNP (N+SNP)；⑥氮正常+NO清除劑cPTIO，即N+50 μmol/L cPTIO (N+cPTIO)。初始接種藻細胞密度為1.00×106cell/mL，黑暗處理12 h后，分別對細胞密度、葉綠素a(chla)與葉綠素c(chlc)含量、葉綠素熒光參數(shù)、巖藻黃素含量、油脂相對含量等指標進行測定與統(tǒng)計。每個處理3次生物學重復。

1.4 葉綠素含量測定

采用全波長多功能酶標儀進行葉綠素含量的測定[12]。利用以下公式計算色素含量(mg/L)：

chla=(11.47×OD664-0.40×OD630) ×

V1/V2，

chlc=(24.36×OD630-3.73×OD664) ×

V1/V2，

其中，V1為丙酮用量(mL)，V2為離心的藻樣體積(mL)。

1.5 葉綠素熒光參數(shù)測量

采用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM-2500測定三角褐指藻葉綠素熒光參數(shù)。測量前，先測定光適應下的最大熒光(Fm′)、初始熒光(F0′)與穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)；再將樣品放置于暗處適應10 min,然后利用飽和脈沖法測量熒光誘導曲線，初始熒光F0用弱測量光 [0.01 μmol/(m2·s)]測量，最大熒光Fm用飽和脈沖[4 000 μmol/(m2·s)，持續(xù)時間為0.8 s] 激發(fā)，當達到穩(wěn)定熒光時打開飽和脈沖，熒光又上升至光適應狀態(tài)下的最大熒光Fm′。所有實驗設定 3個平行樣，每個處理重復3次。獲得以下葉綠素熒光參數(shù)：初始熒光F0、最大熒光Fm、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm、PSⅡ實際光化學量子產(chǎn)量Yield、光化學猝滅系數(shù)qP和非光化學淬滅系數(shù)NPQ。利用不含藻的培養(yǎng)液進行調零，以消除溶液本身的本底熒光。

葉綠素熒光參數(shù)的計算公式[13,14]如下：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm,

Yield=ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′,

qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-F0′),

NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′。

1.6 巖藻黃素提取及含量測定

利用裝配有C18反相柱(4.6 mm×250 mm)的高壓液相色譜系統(tǒng)進行巖藻黃素含量測定。檢測條件參考花汝鳳等[15]的方法，并稍做修改。流動相包括甲醇(B)和水(D)，程序：流動相(90%B，10%D)，等度洗脫，流速1.2 mL·min-1，進樣體積10 μL，檢測波長450 nm，柱溫35℃，檢測時間30 min。

精密量取各處理的藻液30 mL，4 500 g低溫離心8 min，去上清，精密稱量藻細胞鮮質量，加入甲醇(5% BHT) 1 mL，渦旋2 min，避光超聲5 min，4 500 g低溫離心8 min，收集上清液；重復加入甲醇(5% BHT) 1 mL提取沉淀。合并兩次上清液，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后進行高效液相色譜分析。巖藻黃素的標準曲線為Y=28525.4X(R2=0.999 6)，根據(jù)標準曲線計算出巖藻黃素的含量。每個處理3次生物學重復。

1.7 油脂相對含量測定

采用尼羅紅[9-(diethyl amino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one,Nile red]染色法測定三角褐指藻的油脂相對含量，具體操作參考陳若瑩等[5]的方法。另取1 mL藻液，加入尼羅紅染料20 μL進行染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察胞內油滴的大小。每個處理3次生物學重復。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel與SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，并以平均值±標準差的方式表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVE)，采用Duncan法進行多重比較。分析結果用GraphPad Prism 5軟件進行作圖。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，圖中的小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 氮脅迫對三角褐指藻細胞生長的影響

由圖1可知，在不同NaNO3濃度處理下，三角褐指藻的細胞密度存在差異。當NaNO3濃度為0 mmol/L時，三角褐指藻的生長受到嚴重抑制，至培養(yǎng)第6天時，細胞密度與對照(0.8 mmol/L NaNO3)相比減少了11.99×106cells/mL，表明氮元素對三角褐指藻的生長是必需的，缺乏氮元素會導致藻細胞逐漸死亡。當三角褐指藻在NaNO3濃度為0.2 mmol/L中培養(yǎng)至第6天時，細胞密度僅為2.47×106cells/mL，與對照相比藻細胞密度明顯下降。當NaNO3濃度為0.3-0.6 mmol/L時，三角褐指藻的細胞密度仍明顯低于對照；當NaNO3濃度為0.7 mmol/L時，細胞密度與對照相比差異不大。

圖1 氮脅迫對三角褐指藻細胞密度的影響Fig.1 Effect of nitrogen stress on the cell density in P.tricornutum

2.2 外源NO調控氮脅迫下三角褐指藻的細胞密度

在氮正常的情況下，添加NO供體SNP (200 μmol/L)與NO清除劑cPTIO (50 μmol/L)對三角褐指藻細胞密度影響不大；在缺氮條件下，三角褐指藻的生長受到嚴重抑制，與缺氮(N-)處理相比，N-+cPTIO處理的細胞密度無顯著差異，但N-+SNP處理能顯著增加缺氮條件下三角褐指藻的細胞密度(圖2)，說明外源NO可有效緩解缺氮對三角褐指藻生長的抑制作用。

Different lowercase letters represent significant differences圖2 外源一氧化氮對三角褐指藻細胞密度的影響Fig.2 Effect of exogenous NO on the cell density in P.tricornutum

2.3 外源NO調控氮脅迫下三角褐指藻的葉綠素含量

由圖3可知，在氮正常的情況下，添加200 μmol/L SNP與50 μmol/L cPTIO對chla含量無顯著影響。缺氮會顯著降低chla含量，與氮正常(chla含量為0.83 μg/mL)相比，chla含量為0.49 μg/mL，減少了40.96%。在缺氮條件下，chla與chlc含量均出現(xiàn)顯著下降，但添加200 μmol/L SNP能顯著提高chla含量(0.66 μg/mL)，與缺氮(chla含量為0.49 μg/mL)相比提高了34.69%。類似于chla含量的變化趨勢，N-+SNP處理的chlc含量與缺氮處理相比顯著提高，chlc含量達到0.082 μg/mL。與缺氮處理(N-)相比，N-+cPTIO處理對三角褐指藻chla與chlc含量均無顯著差異。表明缺氮對三角褐指藻葉綠素合成具有抑制作用，但外源NO可有效緩解氮脅迫對三角褐指藻合成葉綠素的抑制。

Different lowercase letters represent significant differences圖3 外源NO對氮脅迫下三角褐指藻葉綠素含量的調控作用Fig.3 Regulatory effect of exogenous NO on chlorophyll content in P.tricornutum under nitrogen stress

2.4 外源NO調控氮脅迫下三角褐指藻的葉綠素熒光參數(shù)

在氮正常條件下，添加SNP (200 μmol/L)處理12 h能顯著提高三角褐指藻PSⅡ的最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，與氮正常處理(N)相比，F(xiàn)v/Fm提高了10.05%。三角褐指藻在缺氮條件下培養(yǎng)12 h，F(xiàn)v/Fm最低，而N+SNP處理的Fv/Fm與缺氮處理相比顯著提高了68.14%，差異達到顯著水平[圖4(a)]。在缺氮情況下，三角褐指藻PSⅡ實際光化學量子產(chǎn)量Yield值也受到抑制，加入200 μmol/L SNP后，Yield值顯著提高，而添加50 μmol/L cPTIO處理對Yield值的影響不大[圖4(b)]。光化學淬滅系數(shù)qP是由光合作用引起的熒光淬滅，反映了PSⅡ反應中心的光合活性高低。不同組合處理的qP變化幅度不大[圖4(c)]。非光化學淬滅系數(shù)NPQ是耗散過剩光能為熱量的能力，反映了光保護能力。在氮正常條件下，3個處理的NPQ比值差異不大，但在缺氮條件下添加SNP (200 μmol/L)能顯著降低三角褐指藻的NPQ比值[圖4(d)]。綜上所述，可以認為外源NO在一定程度上緩解缺氮脅迫對葉綠素熒光參數(shù)的抑制作用。

2.5 外源NO調控氮脅迫下三角褐指藻的巖藻黃素含量

由圖5可知，在氮正常情況下，N與N+SNP兩種處理之間巖藻黃素含量無顯著差異；而在缺氮條件下，N-與N-+SNP兩者之間巖藻黃素含量存在顯著差異，說明SNP (200 μmol/L)可在一定程度上緩解氮脅迫對三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用。加入cPTIO (50 μmol/L)，巖藻黃素含量無顯著差異，從而進一步證實了SNP的調控作用。

Different lowercase letters represent significant differences圖4 外源NO對氮脅迫下三角褐指藻PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量、實際光化學量子產(chǎn)量、光化學淬滅系數(shù)與非光化學淬滅系數(shù)的調控作用Fig.4 Regulatory effect of exogenous NO on Fv/Fm,Yield,qP,and NPQ in P.tricornutum under nitrogen stress

Different lowercase letters represent significant differences圖5 外源NO對氮脅迫下三角褐指藻巖藻黃素含量的調控作用Fig.5 Regulatory effect of exogenous NO on fucoxanthin content in P.tricornutum under nitrogen stress

2.6 外源NO調控氮脅迫下三角褐指藻的油脂相對含量

在氮正常情況下，添加200 μmol/L SNP與50 μmol/L cPTIO對油脂相對含量無顯著影響。在缺氮條件下，油脂相對含量顯著增加；與N正常處理相比，N-、N-+SNP與N-+cPTIO分別提高18.18%、41.99%與15.06%，說明缺氮有利于油脂相對含量的升高。在缺氮條件下，N-+SNP處理的油脂相對含量顯著高于N-處理，相對熒光密度達638 a.u.，而N-處理與N-+cPTIO處理之間無顯著差異(圖6)，因此，可認為SNP (200 μmol/L)具有促進缺氮條件下三角褐指藻油脂積累的作用。尼羅紅染色的油脂滴在藍光激發(fā)下能發(fā)出特征性的黃色熒光，N-+SNP處理的三角褐指藻的油脂滴明顯大于其他處理(圖7)，這與油脂相對熒光密度值是一致的。

Different lowercase letters represent significant differences圖6 外源NO對氮脅迫下三角褐指藻油脂相對含量的調控作用Fig.6 Regulatory effect of exogenous NO on relative oil content in P.tricornutum under nitrogen stress

圖7 尼羅紅染色的三角褐指藻細胞Fig.7 P.tricornutum cells stained with Nile red

3 討論

3.1 外源NO可有效緩解缺氮對三角褐指藻生長的抑制作用

氮是三角褐指藻生長必需的基本元素之一，是構成藻體內蛋白質、核酸及色素的重要元素,對藻類的生長發(fā)育有著重要的作用[16]。大量研究表明，氮限制會抑制三角褐指藻細胞的生長，且抑制程度會隨著氮限制的增強而加劇[4-6]。陳若瑩等[5]發(fā)現(xiàn)完全缺氮條件下的藻細胞密度比正常條件(氮濃度為 896 μmol/L) 降低了49.7%。本研究也發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，三角褐指藻細胞的生長密度會下降；當藻細胞在NaNO3為0 mmol/L中培養(yǎng)6 d時，與對照(0.8 mmol/L NaNO3)相比，細胞密度減少了11.99×106cells/mL，這可能是由于細胞缺少主要的氮素來源，從而導致細胞正常的生長與代謝活動受阻，主要表現(xiàn)為細胞生長緩慢、衰老死亡嚴重。迄今尚未發(fā)現(xiàn)NO對缺氮條件下三角褐指藻調控作用的研究報道。已有研究顯示1 mmol/L SNP能夠產(chǎn)生2 μmol/L的NO[17]，因此，研究人員利用SNP會主動釋放NO這一特性來研究NO對三角褐指藻生長及成分積累的促進或抑制作用。對缺氧條件下生長6 d的三角褐指藻細胞進行外源NO處理12 h，其細胞密度與缺氮相比得到顯著增加，說明外源NO可有效緩解缺氮對三角褐指藻生長的抑制作用，這與SNP能有效減輕鋁對花生根生長的毒害作用[9]，緩解鹽脅迫引起的杜氏鹽藻的生長抑制[10]等結果是一致的。類似于高等植物，外源NO的調控作用具有“雙重效應”，在低濃度下對微藻起促進作用，高濃度下則起抑制作用[11]。然而，對于不同種類的微藻，NO的低濃度范圍存在差別。本研究使用200 μmol/L SNP處理缺氮條件下的藻細胞，能在一定程度上緩解缺氮對藻細胞生長與巖藻黃素積累的抑制作用，說明200 μmol/L可能發(fā)揮著正調控的效應。

3.2 外源NO可有效緩解缺氮對三角褐指藻葉綠素積累及光合效率的抑制作用

三角褐指藻的光合效率主要依賴于天線系統(tǒng)復合物巖藻黃素-葉綠素蛋白(Fucoxanthin Chlorophyll Proteins，F(xiàn)CP)復合體，F(xiàn)CP復合體結合的色素主要有巖藻黃素、chla、chlc1和chlc2[18]。大量研究表明，氮限制能顯著降低三角褐指藻葉綠素a的含量[4-6]，本研究也得到類似的結論。同時還發(fā)現(xiàn)在氮正常的情況下，添加200 μmol/L SNP對chla含量無顯著影響，但能有效緩解缺氮條件對chla和chlc含量的影響，提示在氮缺乏的環(huán)境中，SNP的調控作用可能與提高光合效率和光能的轉換效率有關，這與姜倩倩等[19]和朱營營等[20]的研究結果基本類似。

Fv/Fm反映了植物潛在的最大光合能力，Yield反映的是實際原始光能捕獲效率。由于Fv/Fm在正常條件下變化較小，但在脅迫條件下變化較大，可作為反映微藻生長環(huán)境是否適宜的一個重要指標[21]。類似于姜倩倩等[19]和吳曉蕾等[22]分別在平邑甜茶和黃瓜上的研究結果，本研究發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下添加SNP (200 μmol/L)處理12 h能顯著提高Fv/Fm與Yield值，說明SNP (200 μmol/L)能有效緩解缺氮脅迫對三角褐指藻光合效率的抑制作用。然而，對于SNP如何發(fā)揮調控作用并影響三角褐指藻的光合效率，仍有待進一步研究。

3.3 外源NO可有效緩解缺氮對巖藻黃素積累的抑制并顯著促進油脂的積累

巖藻黃素屬于硅藻次生代謝產(chǎn)物中的萜類物質，是一種參與光合作用、輔助采光色素的類胡蘿卜素。已有研究顯示，巖藻黃素的含量會隨著三角褐指藻的生長而逐漸降低[23]，且在氮限制時三角褐指藻的巖藻黃素積累會被抑制[4]。本研究也發(fā)現(xiàn)缺氮時三角褐指藻巖藻黃素含量較氮正常時顯著減少，然而，關于外源NO對巖藻黃素合成的影響至今鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮正常的條件下加入200 μmol/L SNP，三角褐指藻的巖藻黃素含量沒有明顯變化；在缺氮條件下，添加SNP (200 μmol/L)可有效緩解缺氮對三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用。這可能是由于在氮限制的情況下，細胞為保護其結構和功能，迫使chla等合成下降，從而降低光捕獲，進而可能直接影響關鍵蛋白FCP復合體的合成，導致其合成下降[5]；而在缺氮條件下添加200 μmol/L SNP，可有效緩解缺氮對三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用，究其原因可能是由于SNP能提供NO，而NO可促進藻細胞中天線系統(tǒng)復合物FCP復合體的合成，同時可有效減輕缺氮導致的光合系統(tǒng)損傷。對于SNP可有效調節(jié)三角褐指藻細胞中哪些抗氧化酶，以及哪些基因參與其中發(fā)揮作用，還有待進一步研究。

趙佩佩等[4]研究發(fā)現(xiàn)缺氮條件下三角褐指藻脂質合成增加，參與脂質合成、糖酵解和三羧酸(TCA)循環(huán)的關鍵蛋白在缺氮時上調，提示缺氮條件下糖酵解和TCA循環(huán)活性升高，為脂肪酸生物合成提供了大量的中間產(chǎn)物，如乙酰輔酶A和ATP等。在本研究中，油脂相對含量測定和尼羅紅染色觀察結果也表明了SNP (200 μmol/L)能促進缺氮條件下三角褐指藻的油脂積累。因此，在生產(chǎn)過程中，環(huán)境條件和培養(yǎng)水平等因素存在的多變性，可能會導致三角褐指藻的培養(yǎng)處于逆境條件，可以嘗試添加適當濃度的SNP來緩解逆境條件對三角褐指藻生長的抑制作用或促進油脂的積累。

4 結論

本研究通過添加外源NO供體SNP及NO清除劑cPTIO，探究外源NO對三角褐指藻響應氮脅迫的作用。結果表明，缺氮會抑制三角褐指藻細胞的生長，顯著降低chla含量與光合效率，降低巖藻黃素含量，增加脂質合成。與氮正常情況下相比，在缺氮條件下添加200 μmol/L SNP，可在一定程度上緩解缺氮對三角褐指藻的生長、葉綠素含量、光合效率與巖藻黃素積累的抑制，并能顯著促進油脂的積累。在缺氮條件下添加50 μmol/L cPTIO對三角褐指藻的生長、葉綠素含量、光合效率及物質積累影響不大。本研究可為探明外源NO調控三角褐指藻響應氮脅迫的作用機制提供基礎數(shù)據(jù)，也為進一步提高三角褐指藻的生物量，促進成分積累量提供參考依據(jù)。