黃議瑩，李 喆，潘信利，黃媛林，胡文進(jìn)，李 菲，王巧貞，黃庶識(shí)，周曉瑩，溫文勝**

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西南寧 530021；2.廣西科學(xué)院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；3.廣西科學(xué)院，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530007；4.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西南寧 530021)

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)起源于鼻咽上皮，是中國(guó)南部高發(fā)的惡性腫瘤之一。目前，常見的鼻咽癌化療藥物有紫杉醇、順鉑、奈達(dá)鉑、吉西他濱、多西他賽等，靶向治療藥物有貝伐珠單抗、西妥昔單抗、舒尼替尼等。上述藥物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的控制雖然具有一定效果，但是均有不同程度的毒副作用，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性，影響病人的治療和康復(fù)。因此，尋找高效、低毒、有靶向性的抗癌藥物成為現(xiàn)在亟待解決的問(wèn)題。

廣西紅樹林土壤富含作為微生物物質(zhì)和能量來(lái)源的有機(jī)質(zhì)，微生物資源豐富，而這些微生物為了適應(yīng)高鹽、低溫、高濕度和強(qiáng)光照的極端紅樹林生境，進(jìn)化出獨(dú)特的代謝路徑和產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的物質(zhì)[1]。迄今為止，已從廣西紅樹林生境中分離得到多株新菌，其中包含3個(gè)新屬和9個(gè)新種，分別屬于變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)[2]。此外，廣西紅樹林土壤來(lái)源的細(xì)菌已被證實(shí)具有多樣的生物學(xué)活性。黎芳婷等[3]從廣西3種紅樹植物及其根際土壤中分離得到4株具有抑制魚類鏈球菌病的致病菌。李菲等[4-6]研究結(jié)果證實(shí)了廣西紅樹林土壤、紅樹植物及其根際土壤來(lái)源的細(xì)菌能夠分泌多種功能酶，生產(chǎn)具有抗血栓活性和抗植物病原菌活性的物質(zhì)，并使用特殊引物擴(kuò)增驗(yàn)證了15株內(nèi)生菌株具有生產(chǎn)聚酮類和非核糖體肽類化合物的潛力。黃媛林等[7]通過(guò)活性篩選從一株廣西紅樹林土壤來(lái)源的鏈霉菌MCCG 2008中分離得到一個(gè)已知的抗腫瘤化合物放線菌素D，該化合物能夠殺死多種腫瘤細(xì)胞并已應(yīng)用于臨床治療[8]。

前人對(duì)廣西紅樹林土壤來(lái)源的細(xì)菌的研究主要集中在多樣性分析、新種挖掘以及功能基因分析等，而對(duì)其所產(chǎn)活性化合物的報(bào)道較少。為從廣西北海紅樹林土壤中篩選出能夠產(chǎn)生抗鼻咽癌活性物質(zhì)的可培養(yǎng)細(xì)菌，本研究擬使用鼻咽癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)法進(jìn)行活性菌株的篩選，依據(jù)基因型和表型完成活性菌株的分類，應(yīng)用活性測(cè)試追蹤法和柱層析分離對(duì)其所產(chǎn)生的活性次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，評(píng)估活性化合物在體外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制能力，進(jìn)一步擴(kuò)展人們對(duì)廣西紅樹林細(xì)菌活性化合物生產(chǎn)潛力的認(rèn)知，為開發(fā)潛在的抗鼻咽癌藥物提供結(jié)構(gòu)模板。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

樣品為廣西北海紅樹林保護(hù)區(qū)(108°31′25″ E， 21°53′15″ N)距離桐花樹根5 cm左右的土壤，樣品采集后使用密封袋密閉保存，并于72 h內(nèi)稀釋涂布。

1.1.2 測(cè)試對(duì)象

使用的鼻咽癌細(xì)胞株TW03和5-8F為廣西醫(yī)科大學(xué)鼻咽癌實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌分離培養(yǎng)基參照李菲等[9]的方法進(jìn)行配置，具體配方如下。添加甘油的酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基：L-天門冬酰胺1.0 g，酪氨酸0.5 g，甘油10 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。淀粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g，葡萄糖1.0 g，甘油10 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。葡萄糖酪素瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，水解酪素0.5 g，復(fù)合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。燕麥培養(yǎng)基：粗燕麥粉20.0 g，復(fù)合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基2號(hào)(ISP2)：麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，酵母提取物2.0 g，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。復(fù)合鹽母液：MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，NH4NO30.1 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MnCl2·4H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，去離子水10 mL。

細(xì)菌保藏培養(yǎng)基：含30%(V∶V)甘油的ISP2液體培養(yǎng)基；Reasoner′s 2A (R2A)培養(yǎng)基。鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基：含10%胎牛血清(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)以及1%青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)的高糖達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(DMEM,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

EVOQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(德國(guó)Bruker公司)，DD2核磁共振儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，LRH-150F生化培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，IS-RDV3立式恒溫振蕩器(蘇州捷美電子有限公司)，SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)，WGL-230B熱電鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，Multiskan GO plate reader多功能酶標(biāo)儀 (美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化

將新鮮采集的土壤平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放置于65℃鼓風(fēng)干燥箱干燥30 min，稱取2.0 g樣品用20 mL無(wú)菌水稀釋制成土壤懸浮液，隨后經(jīng)無(wú)菌水稀釋獲得10-2和10-3稀釋度的樣液。取200 μL的樣液分別接種于5種細(xì)菌分離培養(yǎng)基中，并涂布均勻，28℃下恒溫培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后，挑取菌落采用三區(qū)劃線法純化菌株，純化好的菌株轉(zhuǎn)移至含30% (V∶V)甘油的改良ISP2液體培養(yǎng)基凍存管中，于-80℃冷凍保藏。

1.2.2 篩選活性菌株

分離純化后的菌株分別接種于裝有200 mL R2A液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在180 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)7 d。離心去除菌體，發(fā)酵上清液使用等體積的乙酸乙酯萃取3次后，減壓濃縮獲得發(fā)酵液粗提物。將粗提物溶解于二甲基亞砜(DMSO)并經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾制得1 mg/mL的無(wú)菌樣液。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞株TW03和5-8F，用新鮮DMEM培養(yǎng)基配置成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液后接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后每孔加入樣液1 μL，同時(shí)取1 μL DMSO和1 mg/mL多柔比星分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。96孔板在37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)溶液，再繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光值，細(xì)胞活力=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白)/(OD對(duì)照組-OD空白)×100%。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 菌株的分類鑒定

使用Chelex-100樹脂法提取細(xì)菌DNA[10]，參照李菲等[11]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各基因擴(kuò)增所需引物見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，所得序列使用Contigexpress拼接后獲得完整的16S rRNA、atpD和rpoB基因序列。為了尋找系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相近的菌株，將菌株的16S rRNA、atpD和rpoB基因序列以及16S rRNA+atpD+rpoB多基因序列提交至EzBiocloud server[12]和BLAST平臺(tái)進(jìn)行匹配比對(duì)。選取有效基因序列在MEGA 7.0[13]軟件中使用最大似然(Maximum-likelihood)法或鄰接(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支置信值設(shè)為1 000次。

表1 細(xì)菌16S rRNA和看家基因序列的擴(kuò)增及測(cè)序引物Table 1 Amplification and sequencing primers of bacterial 16S rRNA and housekeeping genes

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

將菌株接種于ISP2固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察并記錄菌體形態(tài)特征。參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[15]和《放線菌的分類和鑒定》[16]中的方法，使用GEN Ⅲ MicroPlateTM測(cè)試板檢測(cè)菌株的碳源利用情況。參考張紀(jì)忠等[17]的方法對(duì)菌株進(jìn)行硝酸鹽還原、明膠液化、葡萄糖分解實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S及產(chǎn)酸能力的測(cè)試。

1.2.5 活性化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

將10 mL活性菌株種子液接種至1 L的燕麥液體培養(yǎng)基中，共發(fā)酵10 L，在180 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)7 d。離心去除菌體，發(fā)酵上清液使用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相濃縮干燥后得到發(fā)酵液粗提物(125.6 mg)。使用2.5 mL甲醇溶解粗提物后經(jīng)硅膠柱層析分離，柱層析硅膠為100-200目，以乙酸乙酯∶甲醇(90∶1→0∶100)梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜(Thin Layer Chromatography,TLC)法檢識(shí)，合并相同組分，共得到19個(gè)洗脫組分，即Fr.1-Fr.19。各組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用DMSO溶解并經(jīng)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾制備樣品。使用CCK8法檢測(cè)各組分的活性，得到具有較強(qiáng)體外細(xì)胞毒性的組分，隨后使用核磁共振儀分析活性化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.6 活性化合物的抗腫瘤活性評(píng)估

活性化合物使用DMSO溶解，含腫瘤細(xì)胞的96孔板制備及活性檢測(cè)方法參照1.2.2節(jié)，其中活性化合物的濃度梯度設(shè)置為0-16.9 μmol/L，以分析其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株TW03和5-8F的半抑制濃度(Half Inhibitory Concentration,IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 341 bp，與已知的卡伍爾氏鏈霉菌StreptomycescavourensisNBRC 13026T的16S rRNA基因序列具有99.0%的相似性，而與其他鏈霉菌的相似性均低于98.8%，因此判定該菌株隸屬于鏈霉菌屬。由圖1和圖2可知，在以16S rRNA基于最大似然法和多基因序列(16S rRNA+atpD+rpoB)基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株MCCG 218與鏈霉菌屬的其他菌株聚集在一起，進(jìn)一步驗(yàn)證了該菌屬于鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.MCCG 218。

圖1 菌株MCCG 218基于16S rRNA基因序列的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Fig.1 Phylogenetic relationship analysis of strain MCCG 218 based on 16S rRNA gene sequence by maximum likelihood method

2.2 菌株MCCG 218的形態(tài)和生理生化分析

菌株MCCG 218在改良的ISP2固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，呈現(xiàn)出與鏈霉菌相似的形態(tài)特征，菌落小而致密，幼時(shí)表面光滑、邊緣整齊、不易挑起，繼而發(fā)展成絨毛狀，形成淺黃色、圓形的菌落(圖3)。生理生化特征測(cè)試表明，菌株MCCG 218能產(chǎn)生H2S，不能分解葡萄糖和液化明膠。菌株MCCG 218能利用果膠、L-乳酸、3-甲酰葡萄糖、D-果糖、L-組胺、黏液酸、乙酸、D-蘋果酸、奎寧酸、L-蘋果酸、D-甘露醇、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-阿拉伯醇、D-乳酸甲酯、糖質(zhì)酸、溴-丁二酸、糖質(zhì)酸、溴-丁二酸和L-焦谷氨酸等作為碳源，其碳源利用能力與其最近親緣菌株S.cavourensisNBRC 13026T相似，都能利用果糖和葡萄糖作為碳源，但菌株MCCG 218不能分解甘油，而S.cavourensisNBRC 13026T能利用甘油作為碳源。

圖2 菌株MCCG 218基于多序列位點(diǎn)的鄰近系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Fig.2 Phylogenetic relationship analysis of adjacent system of strain MCCG 218 based on multiple sequence sites

圖3 菌株MCCG 218在改良的ISP2固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain MCCG 218 on the modified ISP2 solid culture medium

2.3 活性化合物的結(jié)構(gòu)分析

活性化合物使用甲醇溶解后經(jīng)800 MHz核磁共振波譜檢測(cè)，其核磁共振1H化學(xué)位移如表2所示?；衔?的同核位移相關(guān)譜中，H-12(δH6.43)、H-11(δH5.91)和H-13(δH5.34)顯現(xiàn)出相關(guān)性,推測(cè)其結(jié)構(gòu)中含有共軛烯烴(圖4)。這些特征譜峰與已知的巴弗洛霉素A1的核磁圖譜相似[18]。然而化合物1的1H-NMR圖譜比已知巴弗洛霉素A1的圖譜多了一個(gè)位于δH6.06(J=10.7 Hz)的雙峰，并在COSY譜中顯示出了與δH2.82(m)的相關(guān)性，推測(cè)巴弗洛霉素A1中的羥基發(fā)生了還原反應(yīng)生成了一個(gè)烯基?；衔?的H-24(δH1.88,1.26)在COSY譜中僅與CH3-25(δH0.85)相關(guān)，推斷為24位的亞甲基可能僅與一個(gè)甲基相連。這些特征峰顯示了化合物1與巴弗洛霉素A1的差異性，但與已知的巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-19,21-di-O-methyl-24-demethyl-bafilomycin A1)一致[19]，然而在該化合物的核磁共振氫譜圖中僅出現(xiàn)2個(gè)甲氧基的單峰(δH3.70和δH3.23)，因此推測(cè)該化合物應(yīng)為無(wú)19和21位甲氧基取代的巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-24-demethyl-bafilomycin A1)。經(jīng)HRESI-MS分析顯示化合物1m/z 591.3101 [M+H]+,表明該化合物的分子量為590，而巴弗洛霉素A1 (C35H58O9)的分子量為622.83，進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物1為巴弗洛霉素A1衍生物C34H54O8(圖5)。

表2 化合物1的1H-NMR譜分析(CD3OD,800 MHz)Table 2 1H-NMR spectrum analysis of compound 1 derivative (CD3OD,800 MHz)

圖4 化合物 1的同核位移相關(guān)核磁圖(COSY,CD3OD)Fig.4 Homonuclear displacement-related nuclear magnetic diagram of compound 1 derivative (COSY,CD3OD)

圖5 化合物 1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structure of compound 1 derivative

2.4 活性化合物的抗腫瘤活性

活性化合物使用DMSO溶解后制成不同濃度的樣液，經(jīng)CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)巴弗洛霉素A1衍生物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株TW03和5-8F表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，IC50值分別為2.7 μmol/L和9.2 μmol/L。

3 討論

在過(guò)去的20多年里，多個(gè)研究小組從紅樹林來(lái)源的微生物中分離得到超過(guò)1 000種活性化合物，其中有10%來(lái)源于細(xì)菌，因此紅樹林微生物也被認(rèn)為是理想的藥源菌[20]。本研究從廣西北海紅樹林土壤中分離篩選得到一株能夠產(chǎn)生體外抗鼻咽癌活性化合物的細(xì)菌MCCG 218，經(jīng)以16S rRNA、atpD和rpoB基因序列開展的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該菌歸屬于鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.MCCG 218?；?6S rRNA基因序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與卡伍爾氏鏈霉菌S.cavourensisNBRC 13026T具有最近的親緣關(guān)系，已知的卡伍爾氏鏈霉菌基因組中包含生產(chǎn)多種廣譜抗菌化合物的生物合成基因簇，如巴弗洛霉素D、Nonactic acid和Prelactone B等[21]。目前有多個(gè)課題組已從卡伍爾氏鏈霉菌的發(fā)酵液中分離得到多個(gè)具有抗腫瘤活性和廣譜抗菌活性的化合物[22]，如巴弗洛霉素B1、巴弗洛霉素C1、巴弗洛霉素D、二酮吡嗪類化合物、無(wú)活菌素(Nonactin)、單活菌素(Monactin)和二活菌素(Dinactin)等，推測(cè)與其具有高親緣性的菌株MCCG 218可能也具有生產(chǎn)這些活性次生代謝產(chǎn)物的能力。本研究通過(guò)化學(xué)分離和活性測(cè)試追蹤法從菌株MCCG 218的發(fā)酵液中分離得到一個(gè)活性化合物，經(jīng)核磁和質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該活性化合物為巴弗洛霉素A1衍生物，該化合物的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了MCCG 218與其親屬菌株卡伍爾氏鏈霉菌都具有生產(chǎn)巴弗洛霉素化合物的能力。

巴弗洛霉素是一類含有16元環(huán)骨架的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，迄今已有30多種巴弗洛霉素從鏈霉菌和北里孢菌(Kitasatospora)中分離得到[23]，該類化合物已被證實(shí)具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒和抗骨質(zhì)疏松等活性[24]，但其抗鼻咽癌活性還未見報(bào)道。本研究明確了巴弗洛霉素A1衍生物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株TW03和5-8F的細(xì)胞毒性，其IC50值分別為2.7 μmol/L和9.2 μmol/L。雖然該類化合物有巨大的臨床應(yīng)用潛力，但是其結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)手性中心和相似的官能團(tuán)，化學(xué)合成路徑煩瑣，難以通過(guò)化學(xué)手段進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[25]。而目前已報(bào)道的巴弗洛霉素生產(chǎn)菌都存在產(chǎn)量低且發(fā)酵生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，不能滿足工業(yè)化和研究的需求。巴弗洛霉素生產(chǎn)菌MCCG 218的發(fā)現(xiàn)，為研究巴弗洛霉素生物合成相關(guān)基因的多樣性提供了材料，為進(jìn)一步調(diào)控和優(yōu)化巴弗洛霉素的生物合成以及鼻咽癌治療藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

紅樹林孕育了多種新型微生物和植物，是生物活性天然產(chǎn)物的豐富來(lái)源。本研究從廣西紅樹林土壤中分離得到一株能夠生產(chǎn)具有體外抗鼻咽癌活性物質(zhì)的鏈霉菌MCCG 218，并證明了該活性物質(zhì)為巴弗洛霉素A1衍生物。鑒于巴弗洛霉素的廣譜抗菌性和較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，該活性化合物的發(fā)現(xiàn)有望為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供參考和模板。