任亞倩，莊孟穎，劉興健，吳小平，張君麗，鄭明鋒，傅俊生

(1 福建農(nóng)林大學(xué) a 食品科學(xué)學(xué)院，b 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002；2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 蔬菜研究所, 西藏 拉薩 850000)

繡球菌(Sparasiscrispa)隸屬擔(dān)子菌門、傘菌綱、多孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬[1]，其子實(shí)體玲瓏似花瓣，晶瑩剔透，呈白色或奶黃色，是一種珍貴的食藥用菌。多糖是繡球菌的主要活性成分之一，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]等功能。由于繡球菌子實(shí)體野生資源有限，目前雖已實(shí)現(xiàn)人工栽培，但其栽培周期長、生產(chǎn)成本高，這在很大程度上限制了繡球菌相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用[5]。然而，菌絲體具有生產(chǎn)周期短、提取加工方便等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種潛在可替代子實(shí)體擴(kuò)大食用菌開發(fā)利用的有效途徑，因此如何促進(jìn)繡球菌菌株快速生長，高效生產(chǎn)菌絲體就顯得至關(guān)重要[6]。

雙向發(fā)酵是一種通過添加藥性基質(zhì)促進(jìn)目的菌株快速生長的方法，具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、不受環(huán)境限制、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在真菌的發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[7]。解文利等[8]探究了銀杏葉對(duì)紫紅曲霉雙向發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)紫紅曲霉的生長。胡永樂等[9]研究了厚樸對(duì)蛹蟲草雙向液體發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)其能在短時(shí)間內(nèi)有效地提高蛹蟲草菌絲體生物量并釋放各類代謝產(chǎn)物。

馬尾松松針是松科植物馬尾松(PinusmassonianaLamb)的葉[10]，是一種重要的中藥材，其主要活性成分為揮發(fā)油類、木脂素類、黃酮類等，具有祛風(fēng)活血、明目安神等功效[11-12]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松松針能夠有效地促進(jìn)繡球菌菌絲體的生長，但目前還未見關(guān)于馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對(duì)菌絲體生產(chǎn)影響的研究。為進(jìn)一步提高繡球菌菌絲體生物量，本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)菌絲體多糖的抗氧化活性進(jìn)行了分析，以期為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 繡球菌菌種，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院田間1-11試驗(yàn)室保藏，菌株編號(hào)RY01。

1.1.2 試劑和儀器 葡萄糖、蛋白胨、瓊脂等試劑，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，購于Sigma公司。主要儀器有電熱鼓風(fēng)干燥箱 (DHG-9070A，常州普天儀器制造有限公司)、高速萬能粉碎機(jī)(GN20，杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司)、恒溫?fù)u床 (KH-300，常州市凱航儀器有限公司)、電子天平(FA104，上海力辰儀器科技有限公司)、pH計(jì)(PHS-3C，上海儀天科學(xué)儀器有限公司)和紅外光譜儀(德國Bruker有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備。將土豆200 g于1.2 L沸水煮沸30 min，用3層紗布過濾，收集土豆浸提液，依次加入葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂2 g，攪拌溶解，加水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

(2) 繡球菌液體菌種制備。將繡球菌菌株接種于裝有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)20 d，用無菌水稀釋，調(diào)整菌液質(zhì)量濃度為50 g/L，備用。

1.1.4 馬尾松松針粉 馬尾松松針采自福建農(nóng)林大學(xué)中華名特優(yōu)植物園。將采摘的馬尾松松針于50 ℃烘干，粉碎后過孔徑0.175 mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。

1.2 雙向液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)分別探究馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時(shí)間、繡球菌接種量及發(fā)酵液pH對(duì)繡球菌菌絲體生物量的影響。

1.2.1 馬尾松松針粉添加量 于90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入50，75，100，125，150 mg馬尾松松針粉，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至室溫，然后每個(gè)搖瓶中接入10 mL質(zhì)量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，最終培養(yǎng)基中馬尾松松針粉添加量分別0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)16 d后，測定菌絲體生物量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。菌絲體生物量的測定：對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)物于25 ℃條件下抽濾3 h，分離發(fā)酵液和菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體至表面無馬尾松松針粉末殘留，用濾紙吸干表面殘留水分，于50 ℃烘干后稱質(zhì)量。

1.2.2 發(fā)酵時(shí)間 于90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，121 ℃高壓滅菌30 min后，冷卻至室溫，然后每個(gè)搖瓶接入10 mL質(zhì)量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，于25 ℃、160 r/min條件下分別培養(yǎng)12，16，20，24，28，32 d，測定菌絲體生物量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 繡球菌接種量 于90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，分別接入不同體積50 g/L的繡球菌液體菌種，控制培養(yǎng)基總體積為100 mL，繡球菌的最終接種量分別為25，50，75，100，125，150 mL/L，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d，測定菌絲體生物量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 發(fā)酵液pH 于90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，用氫氧化鈉和鹽酸分別調(diào)節(jié)pH至4，5，6，7和8，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，然后每個(gè)搖瓶接入10 mL質(zhì)量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d，測定菌絲體生物量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 雙向液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

基于雙向液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，對(duì)馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時(shí)間、接種量和發(fā)酵液pH進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，篩選最佳發(fā)酵條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 繡球菌液態(tài)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素及水平

在正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳條件的基礎(chǔ)上，控制其他條件一致，試驗(yàn)設(shè)置了馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組(以下簡稱雙向發(fā)酵組)和未添加馬尾松松針粉的對(duì)照組2個(gè)處理，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 菌絲體多糖制備

以未添加馬尾松松針粉的處理為對(duì)照組，參照李瑞雪等[13]的方法，將烘干后的對(duì)照組和雙向發(fā)酵組繡球菌菌絲體粉碎，過孔徑0.175 mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，取一定量菌絲體粉末，按料液比1 (g)∶30 (mL)比例加入蒸餾水，90 ℃提取3 h，離心收集上清液后旋蒸濃縮，4 ℃醇沉過夜，收集沉淀，加水復(fù)溶后，采用Sevage法除去蛋白雜質(zhì)，冷凍干燥得到繡球菌菌絲體多糖(Sparassiscrispapolysaccharides，SCP)。

1.5 菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)分析

參照李晉等[14]的方法，分別稱取對(duì)照組和雙向發(fā)酵組SCP粉末2 mg，加入200 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr粉末，混勻后充分研磨，利用壓模機(jī)壓成片后，采用紅外光譜對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.6 菌絲體多糖的抗氧化活性分析

1.6.1 對(duì)ABTS自由基清除率 參考雷燕妮等[15]的方法并略作調(diào)整進(jìn)行試驗(yàn)。配置雙向發(fā)酵組不同質(zhì)量濃度(0.25，0.5，1，2，4 mg/mL)的SCP溶液，以相同質(zhì)量濃度的維生素C為對(duì)照，測定SCP對(duì)ABTS自由基清除率。具體方法為：在試管中分別加入0.8 mL的ABTS工作液和0.2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，振蕩混勻10 s，于25 ℃條件下避光反應(yīng)6 min，在波長734 nm處測定吸光值(Ai)，以蒸餾水分別替代樣品溶液和ABTS工作液，在波長734 nm處測定吸光值(分別記為Aj和Aij)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。計(jì)算ABTS自由基的清除率：

ABTS自由基清除率=[1-(Ai-Aij)/Aj]×100%。

1.6.2 對(duì)羥基自由基的清除率 參考Lai等[16]的方法并略作調(diào)整進(jìn)行試驗(yàn)。以相同質(zhì)量濃度的維生素C為對(duì)照，采用水楊酸-硫酸亞鐵法測定SCP對(duì)羥基自由基的清除率。具體方法為：在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液各0.1 mL，加蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，渦旋混勻5 s，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，在波長510 nm處測定吸光度(Aa)，以0.1 mL蒸餾水分別替代樣品溶液和H2O2溶液，于波長510 nm處測定吸光度(分別記為Ab和Aab)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。計(jì)算SCP對(duì)羥基自由基的清除率：

羥基自由基清除率=[1-(Aa-Aab)/Ab]×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 24.0軟件分析處理，組間比較采用Duncan’s檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)繡球菌液體發(fā)酵的影響

2.1.1 馬尾松松針粉添加量 圖1顯示，當(dāng)馬尾松松針粉添加量為0.50～1.25 g/L時(shí)，繡球菌菌絲體的生物量隨著松針粉添加量的增加而顯著提高；當(dāng)松針粉添加量大于1.25 g/L時(shí)，繡球菌菌絲體生物量趨于穩(wěn)定，從節(jié)約資源的角度考慮，馬尾松松針粉添加量選取1.25 g/L較為合適。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間 圖2顯示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12～24 d時(shí)，繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過24 d，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長菌絲體生物量不再發(fā)生顯著變化。從縮短發(fā)酵周期的角度考慮，發(fā)酵時(shí)間選取24 d較為合適。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同

2.1.3 繡球菌接種量 圖3顯示，當(dāng)繡球菌接種量為25～100 mL/L時(shí)，繡球菌菌絲體生物量隨著接種量的增大而顯著增加；接種量大于100 mL/L時(shí)，菌絲體生物量呈下降趨勢，這可能與菌株在單位體積內(nèi)對(duì)營養(yǎng)成分的過度競爭致使培養(yǎng)基中溶氧不足，菌絲體的生長受到抑制有關(guān)。因此，選取100 mL/L為繡球菌適宜接種量。

圖3 繡球菌接種量對(duì)菌絲體生物量的影響

2.1.4 發(fā)酵液pH 圖4顯示，在供試pH范圍內(nèi)，繡球菌菌絲體生物量隨著pH的提高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH為5時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最高。因此，發(fā)酵液pH設(shè)定為5較為合適。

2.2 繡球菌雙向液體發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

表2顯示，馬尾松松針粉添加量中k3最大，發(fā)酵時(shí)間中k2最大，pH中k1最大，接種量中k3最大，此條件(第8試驗(yàn)組)下菌絲體生物量最高。試驗(yàn)過程中觀察菌絲顏色及大小情況發(fā)現(xiàn)，第3試驗(yàn)組和第7試驗(yàn)組菌絲體顏色偏黃，且菌球顆粒大小不一；第8試驗(yàn)組菌絲體顏色偏白，且顆粒均勻。綜上可以得出，繡球菌雙向液體發(fā)酵的最佳條件為：馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時(shí)間24 d、pH 4、接種量125 mL/L，在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達(dá)到(11.25±0.18) g/L。

表2 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

表2顯示，4個(gè)單因素中，pH的極差(R)最大，馬尾松松針粉添加量次之，接種量和發(fā)酵時(shí)間均較小，表明影響雙向液體發(fā)酵產(chǎn)繡球菌菌絲體的主要因素是pH和馬尾松松針粉添加量。結(jié)合方差分析結(jié)果(表3)可知，pH的F值最大，為404.209；馬尾松松針粉添加量的F值次之，為15.589；接種量和發(fā)酵時(shí)間的F值均較小，分別為8.051和0.401。由R值和F值可知，4個(gè)因素對(duì)銹球菌菌絲體生物量影響大小的順序?yàn)椋喊l(fā)酵液pH>馬尾松松針粉添加量>繡球菌接種量>發(fā)酵時(shí)間。

表3 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 繡球菌雙向液體發(fā)酵最佳條件的驗(yàn)證

在2.2節(jié)正交試驗(yàn)得到的最佳條件下，馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組菌絲體生物量可達(dá)(11.16±0.22) g/L，與未添加馬尾松松針粉的對(duì)照組((4.26±0.19) g/L)相比，菌絲體生物量顯著提高了約162.10%，可知馬尾松松針能夠顯著地提高繡球菌菌絲體的生物量。

2.4 繡球菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)分析

圖5結(jié)果顯示，雙向液體發(fā)酵獲得的繡球菌菌絲體多糖紅外光譜主要特征吸收峰與對(duì)照組一致，說明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對(duì)菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)影響較小。

圖5 雙向液體發(fā)酵繡球菌菌絲體多糖的紅外光譜分析

2.5 繡球菌菌絲體多糖的抗氧化活性分析

圖6-A結(jié)果顯示，在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，SCP對(duì)ABTS自由基的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增大而不斷增強(qiáng)，當(dāng)SCP質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基清除率可達(dá)到99.72%。由圖6-B可知，在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，SCP對(duì)羥基自由基的清除率隨其質(zhì)量隨濃度的增大而不斷提高，當(dāng)SCP質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)到68.22%。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示同一種物質(zhì)不同質(zhì)量濃度間差異顯著(P<0.05)

3 討論與結(jié)論

液體發(fā)酵技術(shù)是菌株擴(kuò)繁的重要方法，但傳統(tǒng)液體發(fā)酵手段難以實(shí)現(xiàn)菌株的高效快速生長，雙向液體發(fā)酵是利用中藥材所富含的活性成分刺激菌絲體的生長，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)菌株的快速繁殖[17]。基于雙向發(fā)酵的原理，本試驗(yàn)嘗試通過馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵來提高菌絲體的生物量。單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)馬尾松松針粉添加量大于1.25 g/L，菌絲生物量不再明顯提高，這可能是由于馬尾松松針中的活性成分在達(dá)到一定量后對(duì)繡球菌菌絲體生長的促進(jìn)作用達(dá)到了平臺(tái)期。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過24 d后，繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而下降，這可能是由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中溶氧量降低從而引起菌絲體老化自溶所致。當(dāng)接種量為125～150 mL/L時(shí)菌絲體生物量明顯下降，這可能是由于接種量過大，菌株對(duì)物質(zhì)能量的消耗過快，導(dǎo)致單位體積培養(yǎng)體系內(nèi)營養(yǎng)成分和溶氧不足，使得菌絲體的生長受到抑制[18]。當(dāng)pH≥6時(shí)，繡球菌菌絲體生物量顯著下降，可知偏中性或堿性環(huán)境對(duì)其生長產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，且發(fā)酵中后期菌球顏色逐漸加深，呈現(xiàn)不同程度的灰色，菌絲幾乎無法生長，這可能是由于pH的升高抑制了與菌株生長相關(guān)的酶的活性[19]，此時(shí)馬尾松松針粉不能發(fā)揮對(duì)繡球菌菌絲生長的促進(jìn)作用。

采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件為：馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時(shí)間24 d、接種量125 mL/L、pH為4，在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達(dá)11.16 g/L。已有關(guān)于繡球菌液體培養(yǎng)的研究多集中于發(fā)酵條件的優(yōu)化，2006年Kurosumi等[20]研究得出繡球菌的液體培養(yǎng)條件為：葡萄糖添加量為30 g/L、pH值為5，該條件下菌絲體的產(chǎn)量可達(dá)7.95 g/L。胡爽[21]對(duì)繡球菌突變菌株液體培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，使菌絲體的生物量較優(yōu)化前提高了約60%。本研究利用雙向發(fā)酵原理探究馬尾松松針對(duì)繡球菌菌絲體生長的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，馬尾松松針可以顯著促進(jìn)繡球菌菌絲體的生長，與對(duì)照組相比，雙向發(fā)酵組菌絲體生物量提高了約162.10%。

為探究馬尾松松針是否會(huì)對(duì)繡球菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)添加馬尾松松針與未添加馬尾松松針發(fā)酵的繡球菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果表明，兩組菌絲體多糖的紅外光譜主要吸收峰一致，表明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對(duì)繡球菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)影響較小。多糖作為繡球菌的重要活性成分，一直是科研工作者探究的熱點(diǎn)之一。于韋韋[22]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖可通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長；高淵等[23]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖可能通過調(diào)控機(jī)體氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝緩解高脂血癥大鼠的血脂異常。在繡球菌多糖的活性功能探究中，關(guān)于菌絲體多糖抗氧化活性的研究相對(duì)較少，因此本試驗(yàn)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，繡球菌菌絲體多糖對(duì)ABTS自由基、羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性，具有較好的抗氧化能力。機(jī)體氧化代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基過量時(shí)會(huì)誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜和核酸的氧化損傷，進(jìn)而造成免疫力下降，引發(fā)多種疾病[24-25]。目前越來越多的研究表明，多糖具有良好的自由基清除能力和抑制脂質(zhì)過氧化作用，初步認(rèn)為多糖的抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)、分子量、單糖組成等有關(guān)[26]，本試驗(yàn)對(duì)繡球菌多糖的結(jié)構(gòu)及單糖組分未進(jìn)行深入研究，后續(xù)試驗(yàn)可通過多糖分離純化、結(jié)構(gòu)解析結(jié)合細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步探究其抗氧化機(jī)理。

綜上，馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵可有效提高繡球菌菌絲體生物量，在最適條件下其菌絲體生物量可達(dá)11.16 g/L，而且所得菌絲體多糖具有良好的抗氧化活性。馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵方法為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供技術(shù)支持。