王文姣

（吉林工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與環(huán)境技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013）

1 引言

酪氨酸酶是一種含銅的金屬酶，廣泛存在于動(dòng)植物、微生物以及人體中。由于酪氨酸酶的表達(dá)水平和活性能夠決定黑色素合成的速度和產(chǎn)量，在黑色素形成過程中具有重要作用，如肌膚的顏色就直接受其影響。因此，酪氨酸酶抑制劑是很多美白類化妝品的主要活性物質(zhì)，能夠抑制酪氨酸酶的活性、減少黑色素的形成從而達(dá)到美白的目的[1]。

中藥材蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果實(shí)。秋季果實(shí)成熟時(shí)采割植株，曬干，打下果實(shí)，除去雜質(zhì)[2]。蒺藜中含有主要成分為甾體皂苷、黃酮、生物堿、氨基酸及多糖類[3]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蒺藜進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗衰老與抑制黑色素形成等藥理作用[4-5]。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對中藥蒺藜研究的不斷深入，李艷莉等研究顯示50%的乙醇蒺藜溶液對酪氨酸酶活性的抑制率為54.46%，這說明蒺藜在化妝品應(yīng)用方面存在潛在價(jià)值[6]。

為進(jìn)一步確認(rèn)中藥蒺藜對酪氨酸酶的抑制作用，同時(shí)對比蒺藜呋甾總皂苷和螺甾總皂苷的活性強(qiáng)弱，本文對蒺藜呋甾總皂苷和蒺藜螺甾總皂苷的抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了對比研究，旨在為中藥蒺藜作為美白成分的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

2.2 樣品制備

取蒺藜干燥果實(shí)15.0 kg，粉碎，過20 目篩，用10 倍水煎煮3 次，煎煮時(shí)間依次為2.0 h、1.5 h、1.0 h，將提取液過濾后合并，得到蒺藜提取液。提取液過10 kg AB-8 大孔吸附樹脂吸附，利用39%的乙醇-水溶液洗脫將呋甾總皂苷洗脫完全，回收溶劑，80℃干燥，得到蒺藜呋甾總皂苷110.0 g。以85%的乙醇-水溶液洗脫將螺甾總皂苷洗脫完全，回收溶劑，80℃干燥，得到蒺藜螺甾總皂苷130.0 g[5]。

2.2.1 0.1 mol·mL-1的HCl 溶液的配制

取0.86 mL 的36%～38%濃鹽酸溶液溶于99.14 mL 的水中，即制得0.1 mol·mL-1的HCl 溶液。

2.2.2 pH=6.8 的磷酸鹽緩沖溶液配制

取3.582 g 的十二水磷酸氫二鈉用去離子水溶解并定容在100 mL 容量瓶中，得到1#溶液；取1.56 g 的二水磷酸二氫鈉用去離子水溶解并定容在100 mL 容量瓶中，得到2#溶液；取46.3 mL1#溶液和53.7 mL2#溶液，配制成pH=6.8 的磷酸緩沖溶液100 mL。

2.2.3 L-酪氨酸溶液的配制

用上述0.1 mol·mL-1的HCl 溶液35 mL 溶解0.05 g 的L-酪氨酸，并用pH=6.8 的磷酸鹽緩沖溶液在容量瓶中定容至100 mL，即制得L-酪氨酸溶液。

2.2.4 蒺藜呋甾總皂苷溶液的配制

精密稱取蒺藜呋甾總皂苷40.0 mg，用去離子水溶解并定容于10 mL 容量瓶，得到濃度為4.0 mg·mL-1的蒺藜呋甾型總皂苷母液，并逐漸稀釋至3.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，1.0 mg·mL-1，0.5 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.05 mg·mL-1，0.025 mg·mL-1[5]。

2.2.5 蒺藜螺甾總皂苷溶液的配制

精密稱取蒺藜螺甾總皂苷40.0 mg，用去離子水溶解并定容于10 mL 容量瓶，得到濃度為4.0 mg·mL-1的蒺藜螺甾型總皂苷母液，并逐漸稀釋至3.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，1.0 mg·mL-1，0.5 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.05 mg·mL-1，0.025 mg·mL-1[5]。

2.3 實(shí)驗(yàn)原理

黑色素細(xì)胞合成反應(yīng)的限速酶是酪氨酸酶，L-酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下會生成多巴，再轉(zhuǎn)化生成在475 nm 處有最大吸收波長的紅褐色多巴醌。由于加入樣品后，酪氨酸酶的活性受到抑制，因此通過對比加入樣品前后在475 nm處測定的吸光度，可以評價(jià)樣品對酪氨酸酶抑制作用的強(qiáng)弱[1]。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

在玻璃試管中分別加入pH=6.8 的磷酸緩沖溶液和L-酪氨酸溶液各5.0 mL，再加入不同濃度的樣品水溶液，加入酪氨酸酶后置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min 后取出；以加入等量的水作為空白對照，在475 nm 處用紫外-可見分光光度計(jì)測量吸光度。根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品對酪氨酸酶的抑制率。

式中：IR（%）—樣品對酪氨酸酶的抑制率，B1—空白對照組的吸光度，T1—樣品的吸光度，T0—樣品自身的吸光度。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

不同濃度的蒺藜呋甾總皂苷和蒺藜螺甾總皂苷對酪氨酸酶的抑制率如圖1 所示。

由圖1 可知，當(dāng)蒺藜呋甾總皂苷濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)，對酪氨酸酶的抑制率為43.68%，濃度為4.0 mg·mL-1時(shí)抑制率為75.62%，說明蒺藜呋甾總皂苷對酪氨酸酶具有一定的抑制能力。當(dāng)蒺藜螺甾總皂苷濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)。對酪氨酸酶的抑制率為50.66%，濃度為4.0 mg·mL-1時(shí)抑制率為84.1%，說明蒺藜螺甾總皂苷對酪氨酸酶具有一定的抑制能力。

由此可見，在相同濃度下，蒺藜螺甾總皂苷抑制酪氨酸酶的效果明顯優(yōu)于蒺藜呋甾總皂苷，而且隨著蒺藜螺甾總皂苷和呋甾總皂苷濃度的增大，對酪氨酸酶抑制能力的差異也逐漸增大。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒺藜螺甾總皂苷抑制酪氨酸酶能力優(yōu)于蒺藜呋甾總皂苷。

3 結(jié)論

通過抑制酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)對蒺藜呋甾總皂苷和螺甾總皂苷的抑制酪氨酸酶能力進(jìn)行了對比研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒺藜螺甾總皂苷和呋甾總皂苷都具有抑制酪氨酸酶的能力，并且在0～4.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)遵循劑量- 效應(yīng)關(guān)系，即隨著濃度增大，抑制率也逐漸增加；尤其是在相同濃度下。蒺藜螺甾總皂苷的抑制酪氨酸酶能力優(yōu)于蒺藜呋甾總皂苷。