劉正浩，楊春光，胡志全

0 引言

近年來研究顯示，化療藥物除直接殺傷腫瘤細胞，還參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用。本文主要介紹化療藥物對腫瘤細胞、免疫細胞、腸道菌群等方面的影響，并簡要介紹了化療藥物與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用的現(xiàn)狀。

1 化療藥物的“前世今生”

1910年，保羅·埃爾利希等通過化學合成的方法合成化合物606來治療梅毒，開創(chuàng)了化療的先河。30年后，環(huán)磷酰胺（CTX）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）被用于抗腫瘤治療。自此，化療藥物迎來了爆發(fā)性地增長。隨著研究的不斷深入，化療藥物的抗腫瘤機制已趨于明朗：直接影響腫瘤細胞的DNA結(jié)構(gòu)，干擾腫瘤細胞DNA與RNA的合成，損傷紡錘體終止有絲分裂等?；熕幬镫m然能夠通過以上途徑有效殺傷腫瘤細胞，但是作用缺乏特異性，極易誤傷正常的組織和細胞，如增殖率高的腸上皮細胞和毛囊細胞等[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物不僅直接干擾腫瘤細胞的分裂增殖，還參與到了機體的抗腫瘤免疫之中，這可能是患者在化療結(jié)束后還能長期獲益的原因之一[2]。

2 化療藥物直接作用于腫瘤細胞

根據(jù)細胞死亡命名委員會（NCCD）的定義，免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death,ICD）指在具有免疫活性的同源宿主中，針對死亡細胞提供的內(nèi)源性（細胞）或外源性（病毒）抗原，能夠啟動適應性免疫應答的一種調(diào)節(jié)性細胞死亡（regulated cell death,RCD）形式[3]。適應性免疫應答的啟動離不開腫瘤抗原的呈遞和抗原呈遞細胞的識別，化療藥物能夠參與其中，從而調(diào)節(jié)ICD[4]。誘導ICD的主要有病毒感染、放療以及化療藥物如阿霉素（ADM）、米托蒽醌（MITX）、奧沙利鉑（L-OHP）和CTX等。

2.1 促進腫瘤細胞的抗原釋放和呈遞

腫瘤細胞在快速的分裂增殖過程中，或者受到放化療等的干預，體細胞突變不斷增加，沉默基因的復表達等一系列因素產(chǎn)生大量的“新抗原”等異常多肽，是機體免疫系統(tǒng)特異性識別腫瘤細胞的重要靶點[5]?；熕幬锇l(fā)揮作用后，由IFN γ信號轉(zhuǎn)導驅(qū)動的主要組織相容性復合物1（major histocompatibility complex Ⅰ,MHC Ⅰ）上調(diào)、轉(zhuǎn)錄組改變（如非編碼RNA表達改變）和表觀遺傳缺陷的積累，都可能影響腫瘤細胞的免疫性多肽，從而提高其抗原性[4]。腫瘤特異性免疫反應的啟動還需要T細胞順利識別腫瘤抗原，MHC Ⅰ類分子顯得尤為重要。有研究顯示，在多種腫瘤類型中β-2-微球蛋白（BMG）表達下降，導致HLA Ⅰ類分子（即人類MHC分子）水平下調(diào)，腫瘤細胞無法被CD8+T細胞識別清除[6]。吉西他濱（GEM）處理后，腫瘤細胞HLA分子表達增加，出現(xiàn)大量新抗原，這些蛋白質(zhì)大多與DNA損傷反應有關(guān)，從而促進T細胞的識別和殺傷[7]。在L-OHP的研究中也觀察到了類似的變化[8]。

2.2 向抗原呈遞細胞提供輔助信號

腫瘤細胞在暴露于化療藥物等ICD誘導劑的情況下，可能由于化療藥物產(chǎn)生的細胞表面和微環(huán)境的變化，會釋放大量的損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated molecular pattern,DAMP），與抗原呈遞細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）受體結(jié)合，促進免疫應答的激活。這些損傷相關(guān)分子模式分子[9]主要有：（1）鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin,CRT）；（2）ATP；（3）Ⅰ型IFN；（4）激活信號高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1) ；（5）腫瘤細胞來源核酸；（6）膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）等。

CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中高度保守的分子伴侶，廣泛參與多種細胞功能。在ICD的早期進程中，CRT從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移到細胞膜表面，在大多數(shù)情況下，同時遷移到細胞膜表面的還有蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族A成員3（PDIA3；最著名的是ERp57）[10]，輔助CRT發(fā)揮作用。CRT暴露于細胞表面主要發(fā)揮以下功能：（1）充當“吃我”信號，促進巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的吞噬作用和抗原呈遞；（2）CRT等熱休克蛋白與抗原呈遞細胞（APCs）表面的CD91分子結(jié)合，促進APCs細胞成熟，分泌細胞因子并激活Th17細胞，增加吞噬作用[11]。在化療誘導的ICD中，CRT的遷移受到以下三個信號模塊的調(diào)節(jié)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模塊，涉及到真核翻譯起始因子2亞單位α（eIF2α）的磷酸化；凋亡模塊，依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase8）的B細胞受體相關(guān)蛋白31（BCAP31）、凋亡分子BAX和BAK的切割；胞外模塊，包括CRT通過高爾基體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)順行運輸?shù)劫|(zhì)膜，依賴于囊泡相關(guān)膜蛋白1（VAMP1）和突觸相關(guān)蛋白25（SNAP25）[12]。

ATP作為一種直接供能物質(zhì)，主要存在于細胞內(nèi)為細胞代謝提供能量。正常情況下，細胞外的ATP含量很低。然而，當細胞死亡后，細胞膜裂解，大量ATP擴散到細胞外，此時，ATP作為“導航”信號與免疫細胞表面的嘌呤能受體P2Y（P2RY2）結(jié)合，招募巨噬細胞和DC前體細胞順濃度梯度遷移到凋亡細胞附近，發(fā)揮抗原呈遞作用；同時，ATP通過激活與P2RX7結(jié)合的典型炎性小體介導免疫刺激效應[12]。在ICD中，ATP的釋放依賴[13]：（1）細胞自噬過程的激活；（2）細胞凋亡中細胞凋亡蛋白酶的激活；（3）溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）在質(zhì)膜上的再定位；（4）ROCK1-依賴的細胞起泡5PANX1通道開放。以上任何環(huán)節(jié)缺失都會抑制ATP的分泌。

細胞受到病毒感染時，干擾素作用于被感染細胞，促使其分泌抗病毒蛋白，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Ⅰ型IFN包括IFNα、IFNβ等，除了參與組建天然免疫，還是天然免疫與適應性免疫的橋梁[14]。分泌過程主要為：（1）蒽環(huán)類藥物通過“病毒模仿”刺激腫瘤細胞內(nèi)雙鏈RNA傳感器TLR3識別內(nèi)源性雙鏈RNA，誘導腫瘤細胞快速分泌Ⅰ型干擾素，隨后與腫瘤細胞表面的IFNα、IFNβ受體（IFNARs）結(jié)合，通過自分泌和旁分泌通路，釋放CXC趨化因子配體10（CXCL10）招募多種免疫細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。這種病毒模仿的能力可能與腫瘤細胞受到蒽環(huán)類藥物作用，迫于壓力釋放RNA有關(guān)[15]。（2）化療藥物損傷腫瘤細胞DNA后或者分裂過程中DNA錯誤分離產(chǎn)生的微核，導致雙鏈DNA的胞質(zhì)傳感器環(huán)GMP-AMP合成酶（cGAS）的快速積累，激活干擾素刺激蛋白（STING），從而調(diào)控Ⅰ型IFN的分泌[16]。因此，細胞外核酸被降解會降低腫瘤細胞的免疫原性。

免疫原性細胞死亡時，會向細胞外分泌非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白HMGB1，通過結(jié)合TLR2、TLR4和晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體（AGER，如RAGE等）介導強效的促炎作用[17]。HGMB1與DCs上的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）結(jié)合促進了DC細胞對腫瘤細胞的抗原加工處理和呈遞；HMGB1通過RAGE促進DCs成熟[12]。如果腫瘤細胞缺乏HMGB1或者免疫細胞缺乏TLR4時，無法引起ICD[18]。

ADM和MITX[19]刺激腫瘤細胞分泌膜聯(lián)蛋白（ANXA1），其作用于樹突狀細胞（DCs）細胞表面的甲酰肽受體1（formyl peptide receptor 1,FPR1）后，活化免疫反應。阿霉素作用于野生型和FPR1?/?的小鼠后，野生型小鼠中Ⅰ型IFN表達增加，DC細胞成熟，有關(guān)細胞毒T細胞功能的基因上調(diào)。FPR1缺陷的樹突狀細胞無法招募到瀕死腫瘤細胞周圍，因此不能誘導抗腫瘤T細胞免疫[19]。

還存在一些DAMPs具有免疫抑制的作用。細胞外的ATP降解后形成的腺苷具有很強的免疫抑制能力[20]。HMGB1由于參與的PRR受體不同，受到氧化修飾或者IFN的慢性釋放等因素影響下，HMGB1和IFN會從促炎作用轉(zhuǎn)為抗炎作用[21]?？焖儆行У募毙匝仔苑磻梢源龠M機體的免疫反應，但持續(xù)的慢性反應卻會參與到腫瘤的免疫逃避過程[22]。

目前已知的能誘導ICD的化療藥物有ADM、L-OHP、MITX等，并非所有的化療藥物都能引起ICD，并且與化學結(jié)構(gòu)關(guān)系不大，比如順鉑（DDP）和L-OHP在結(jié)構(gòu)上相似，但在誘導ICD的潛能上存在差異（奧沙利鉑比順鉑具有更強的免疫原性）[23]。篩選ICD的金標準是在具有免疫活性的同基因荷瘤小鼠中進行免疫接種實驗。將具有誘導ICD潛能的化療藥物當作疫苗接種，經(jīng)過1到2周后在該小鼠上再次接種同類型的癌細胞，在隨后的1到2月內(nèi)觀察小鼠新生腫瘤的比例及速率。在實驗的最后，對依然無瘤的小鼠再次接種同種癌細胞，觀察是否有腫瘤新生，從而判斷是否引起ICD[3]。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以使用生物傳感器識別出鈣網(wǎng)蛋白CRT，ATP和HGMB1的含量[24]。人工智能基于多種理化特性計算誘導ICD的概率[25]，已經(jīng)在多項研究中得到證實[25-26]。

2.3 不同于ICD的免疫原性調(diào)節(jié)作用

免疫原性死亡的標志性細胞事件是：（1）ATP的釋放；（2）CRT表達增加；（3）HMGB1的含量升高[3-4]。但是有研究發(fā)現(xiàn)[27]，在使用化療藥物多西他賽后，前列腺癌（LNCaP）等多種細胞系中并沒有誘導ATP或HMGB1分泌，但是CRT和CEA等分子的表達明顯增加。這雖然與ICD不符合，但是卻能夠顯著增加細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）對腫瘤細胞的殺傷力。Hodge等[27]認為“免疫原性調(diào)節(jié)”，即腫瘤細胞暴露于非致命/亞致命劑量的化療時，腫瘤表型發(fā)生改變，使腫瘤對CTL殺傷更敏感。IM不同于ICD而且是ICD的補充。暴露于恩雜魯胺的轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺癌TRAMP-C2細胞系受到免疫原性調(diào)節(jié)，細胞表面的Fas和MHCⅠ類分子的表達增加[28]。這種不同于ICD的免疫調(diào)節(jié)作用意味著在復雜的免疫網(wǎng)絡(luò)下，化療藥物影響的免疫分子或者免疫網(wǎng)絡(luò)會參與多種免疫調(diào)節(jié)模式，可能帶來不同的免疫調(diào)節(jié)結(jié)果。

3 化療藥物作用于免疫細胞

腫瘤的增殖與遷移離不開腫瘤微環(huán)境的作用。腫瘤微環(huán)境指腫瘤細胞分裂增殖的局部環(huán)境，其成分除了細胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)，還包含有大量的免疫細胞，炎性反應因子等[29]，為腫瘤細胞的生長與侵襲提供物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤微環(huán)境中還存在著大量的免疫細胞如發(fā)揮抑制作用的骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）；CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells,Treg）和2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages,TAMs）等[29]為腫瘤細胞的免疫逃避創(chuàng)造了條件，還存在著大量的促免疫細胞如1型腫瘤相關(guān)巨噬細胞，DC細胞和CTL細胞等。

化療藥物可以通過影響腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細胞來促進抗腫瘤免疫。有研究表明，使用低劑量的CTX（50 mg/kg）或者低劑量的CTX（50 mg/kg）+GEM（50 mg/kg）均可有效耗竭Treg細胞和MDSC細胞，抑制腫瘤的生長[29]。盡管全劑量的CTX可以誘導ICD參與免疫調(diào)節(jié)，但是低劑量CTX耗竭Treg細胞可能與Treg細胞中環(huán)磷酰胺擠壓轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1表達水平下降有關(guān)，與ICD無關(guān)。雖然許多化療藥物如5-Fu、多西他賽（Docetaxel）等可以耗竭MDSCs，但是還有研究表示，化療藥物可能會增強MDSC的作用。MDSCs的生長發(fā)育離不開GM-CSF和G-CSF等生長因子。在人PDAC細胞系中，GEM和5-Fu等抗癌細胞毒藥物治療后，GM-CSF等炎性反應因子的基因和蛋白表達上調(diào)，促進了MDSCs的增殖[30]。接受新輔助化療的乳腺癌患者在使用ADM和CTX治療期間MDSC水平急劇升高[31]?；熕幬锏倪@種兩面性仍有待研究。

化療藥物還可以增強機體的抗腫瘤免疫。腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAMs是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的抗原呈遞細胞，主要包括兩種亞型：（1）經(jīng)典M1亞型：可以增強抗腫瘤免疫作用；（2）替代M2型：具有抗炎效應和介導腫瘤細胞免疫逃逸的作用[32]。腫瘤細胞分泌多種細胞因子促進M1向M2的轉(zhuǎn)變，促進免疫抑制微環(huán)境的形成。紫杉醇（Paclitaxel,PCX）通過TLR4/NF-κB途徑誘導M2型巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，從而增強抗腫瘤免疫。在缺乏TLR4的小鼠中未觀察到這種影響。DCs可以攝取處理腫瘤細胞的抗原，并呈遞給T細胞發(fā)揮抗腫瘤效應。蒽環(huán)類藥物通過趨化因子CCL2促使腫瘤病灶中DCs細胞增加[33]。腫瘤中的DCs多不成熟，無法呈遞腫瘤抗原，導致腫瘤細胞無法被殺傷，但是這種現(xiàn)象會被GEM逆轉(zhuǎn)[34]，GEM可以促進腫瘤中不成熟的DCs發(fā)育成熟，參與抗原呈遞過程。CTL可以直接殺傷腫瘤細胞，是抗腫瘤免疫中重要的一環(huán)。Docetaxel[27]、培美曲塞[29]等多種化療藥物均能增強CTL的殺傷力，增強抗腫瘤免疫。

4 化療藥物作用于腸道菌群

化療藥物影響腸道菌群從而降低機體免疫力?；熕幬镉捎谄浞翘禺愋缘奶攸c，不僅作用于腫瘤靶細胞，還能殺傷分裂旺盛的正常細胞如腸上皮細胞[1]等，因此大部分的化療藥都具有一定的胃腸道毒性，腸道內(nèi)的菌群活力也會受到影響。腸道菌群定植在腸道內(nèi)，種類繁多，正常情況下，菌群的構(gòu)成處在動態(tài)平衡之中，構(gòu)成人體的免疫保護屏障。人體免疫系統(tǒng)對腸道菌群中的共生菌耐受而對致病菌反應，這依賴于腸上皮中的微皺褶細胞（M細胞），其細胞表面有多種TLRs，通過識別微生物相關(guān)分子模式從而殺傷致病菌[35]?；熕幬餁摷毎髸е聶C體殺傷致病菌能力下降，從而降低免疫力。

腸道菌群的狀態(tài)也會影響化療效果。在口服抗生素治療的無菌荷瘤小鼠中，腫瘤周圍浸潤的骨髓來源細胞如中性粒細胞和巨噬細胞功能受損，活性氧類ROS產(chǎn)生不足，鉑類藥物化療的效果較差[36]。腸道菌群也會影響PD-1抗體對惡性黑色素瘤的治療效果[37]。腸道菌群對于紫杉醇和伊立替康引起的神經(jīng)性疼痛和神經(jīng)炎性反應以及5-Fu和L-OHP引起的腸黏膜炎具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，使用益生元或益生菌調(diào)節(jié)腸道微生物群可能會提高化療的療效以及緩解化療藥物的毒性[38]。

5 化療與免疫檢查點抑制劑

近年來免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是抗腫瘤免疫領(lǐng)域的一顆新星，與化療藥物相比，免疫檢查點抑制劑具有特異性高的特點。免疫檢查點[39]是在免疫反應激活后起抑制作用的一類由免疫細胞表達的分子，正常情況下可以避免免疫反應的過度激活，但腫瘤細胞會利用免疫檢查點起到逃避免疫殺傷的作用。目前常用的免疫檢查點抑制劑一共分為兩大類：細胞程序性死亡受體1（programmed death protein 1,PD-1）/細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）通路抑制劑和細胞毒T淋巴細胞抗原-4（CTLA-4）通路抑制劑。雖然ICIs已經(jīng)獲得廣泛應用，但是有效率不高[40]。然而，研究進一步發(fā)現(xiàn)，化療藥物除了直接干擾腫瘤細胞合成之外，還可以促進腫瘤抗原的釋放與識別，使PD-L1表達上調(diào)[41]，增強ICIs的療效。這掀起了化療藥物與ICIs聯(lián)合使用的熱潮。有研究表明[42]，使用納米材料把ICIs與多西他賽組裝成免疫脂質(zhì)體，治療惡性黑色素瘤時，兩種藥物的滲透力和殺傷力明顯增加。目前還有多項臨床試驗正在開展，旨在能夠早期長期的發(fā)揮療效，提高有效率，降低不良事件。

6 結(jié)論與展望

化療藥物通過干擾DNA及RNA合成等機制殺傷快速分裂的腫瘤細胞，登上了抗腫瘤的舞臺。百年之后，隨著靶向治療的興起，化療藥物的免疫調(diào)節(jié)作用又引起了大家的重視。隨著研究的不斷進展，部分化療藥物如阿霉素，奧沙利鉑等可以誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡，其余化療藥物如多西他賽等，雖然無法誘導ICD，但是仍然具有一定的免疫原性調(diào)節(jié)作用。在人體錯綜復雜的免疫系統(tǒng)背景下，這說明化療藥物免疫調(diào)節(jié)的途徑不止一條，參與的分子也不是寥寥幾個，這需要我們繼續(xù)研究免疫系統(tǒng)，免疫細胞或免疫分子乃至腸道菌群之間的相互作用，找出影響化療藥物誘導ICD的決定性因素，探明化療藥物參與免疫調(diào)節(jié)的途徑?；熕幬镆苑翘禺愋缘奶攸c發(fā)揮作用，不僅殺傷腫瘤細胞，也會誤傷代謝旺盛的正常細胞，因此，如果將化療藥物直接運送到靶細胞內(nèi)部，如將化療藥物裝載于靶向腫瘤細胞的載體，從而可以最大程度殺傷腫瘤細胞并且保護正常細胞。由于化療藥物的靶細胞是多種多樣的，因此要尋找不同靶細胞之間的特異性標志。由于不同化療藥物的免疫調(diào)節(jié)作用不同，使用靶向載體將不同的化療藥物運送到不同的靶點，可以極大的發(fā)揮每種化療藥物的作用。與此同時，免疫檢查點抑制劑也應該拓展應用，發(fā)掘PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7之外的更多免疫檢查點，探索內(nèi)在機制、增強治療效果。最后，化療藥物聯(lián)合ICIs的臨床試驗正在開展，通過研究藥物種類、劑量、用法等尋找最佳的聯(lián)合治療方法。隨著交叉學科的快速發(fā)展，未來會涌現(xiàn)出更多全面的、多維度的抗腫瘤治療方案。