王丹陽，許燕楠，劉平，慕永平

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病二科 上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所教育部肝腎疾病重點實驗室 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203)

肝硬化是各種肝臟疾病的晚期階段，近年其發(fā)病率和病死率逐漸升高[1]。肝硬化形成的主要因素包括肝炎病毒、酒精、自身免疫等，這些因素均可導致正常肝細胞壞死和肝星狀細胞活化，進而造成肝內(nèi)細胞外基質(zhì)過度沉積和肝臟結(jié)構(gòu)破壞[2]。除肝移植外，目前仍缺乏有效的終末期肝硬化治療方法，因此在肝硬化早期階段進行有效抗纖維化治療顯得尤為重要[3-5]。近年來，隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，以干細胞移植為主的肝移植替代治療已成為最具潛力的肝硬化治療手段。干細胞是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞群，可在特定條件下分化為不同類型的細胞[6]。目前在肝硬化治療領域研究較多的是胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs)、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。ESCs是指從未分化的多能干細胞，具有無限增殖和自我分化潛能；iPSCs在形態(tài)、基因表達、分化能力等方面均與ESCs相似，也是目前基礎研究較全面的干細胞之一；MSCs則不僅具有自我更新、分化的潛能，還可降低免疫排斥反應，因此被認為是治療肝硬化最具前景的干細胞群[7]。現(xiàn)就干細胞移植治療肝硬化的研究進展予以綜述。

1 不同來源的干細胞治療肝硬化的基礎研究

1.1ESCs 1998年，Thomson等[8]首次獲得人類ESCs。ESCs是一類由早期胚胎或原始性腺分離的細胞，由50～150個細胞組成，具有無限增殖、自我更新和多向分化的潛能[9]。誘導后的ESCs形態(tài)特征、基因特異性均與肝細胞類似，為典型的肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cells，HLCs)，即高表達肝細胞特異性標志物甲胎蛋白、白蛋白、肝細胞核因子4α、細胞角蛋白8和細胞角蛋白19等[10-11]。此外，在培養(yǎng)過程中ESCs可長期、穩(wěn)定地保留肝細胞表型，并可分化為成熟肝細胞[12]，具有肝細胞功能，如糖原儲存、細胞色素活性以及低密度脂蛋白攝取等[13]。同時，來源于人ESCs的HLCs還可促進免疫缺陷小鼠的肝再生，表明ESCs治療肝臟疾病的機制與其向HLCs分化有關[14]，為ESCs移植治療肝硬化提供了理論依據(jù)。目前，將ESCs分化為HLCs表型的方法已經(jīng)建立，該方法通過激活素A和Wnt3A促進內(nèi)胚層分化[15-16]。雖然人類ESCs已達到臨床使用標準，但ESCs用于肝硬化的治療仍存在許多亟待解決的問題。首先，ESCs的獲取需要破壞囊胚，存在不可避免的倫理問題[17]；其次，ESCs屬于多能干細胞，移植后存在發(fā)生畸胎瘤的風險[18]。

1.2iPSCs Takahashi等[19]將八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3/4、Sox2(SRY-related HMG-box2)、c-myc和Krüppel樣因子4等基因克隆入病毒載體，然后轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠成纖維細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化并產(chǎn)生一種新細胞，即iPSCs。由于iPSCs可直接從成體細胞誘導分化，不需要破壞胚胎，因此可避免ESCs移植相關的倫理問題和免疫排斥反應[20]；同時，iPSCs與ESCs在多向分化、自我更新潛能等方面也較相似[19,21]，因此逐漸成為干細胞治療研究的熱點。

iPSCs治療肝硬化的機制主要包括其可在特定條件下誘導分化為HLCs，且高表達甲胎蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白受體、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2以及肝細胞核因子4α等[22-23]；同時，iPSCs來源的HLCs還具有細胞色素P450酶活性，可分泌尿素、攝取低密度脂蛋白，并具有儲存糖原的功能[24]。Takayama等[25]研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs源性肝母細胞樣細胞在層粘連蛋白111涂層培養(yǎng)皿上可長期自我更新，并具有向HLCs和膽管細胞樣細胞分化的潛能。有研究將野生型小鼠的iPSCs轉(zhuǎn)移至延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷小鼠的胚胎中以產(chǎn)生嵌合小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iPSCs在嵌合小鼠體內(nèi)發(fā)育成肝細胞并保護延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷小鼠避免發(fā)生肝衰竭[26-27]，證實iPSCs可以分化為具有完整肝功能的成熟肝細胞，擁有與肝細胞相同的增殖能力[28]。另有研究表明，人iPSCs分泌的囊泡可減少肝星狀細胞活化，延緩肝纖維化進展[29]，為iPSCs治療肝硬化提供了新思路。

目前已經(jīng)可以從iPSCs獲取人類HLCs[30]，但與成人原代肝細胞相比，來源于iPSCs的HLCs表型更接近于胎兒[31]。雖然3D培養(yǎng)可使iPSCs接近成熟肝細胞，但仍需要一個適宜的發(fā)育環(huán)境[32]。Takebe等[33]發(fā)現(xiàn)，將人iPSCs與內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞共同培養(yǎng)，其在體外會形成可移植的小肝器官，且具有代謝和合成功能，但這種小肝器官缺乏膽管系統(tǒng)，而膽汁引流不暢不僅會阻礙肝臟的基本消化功能，還可導致膽汁淤積和肝硬化。因此，Tian等[34]建立一種可有效生成2D和3D膽管上皮組織的方案及控制條件，以促進具有完整性、功能性肝組織的形成。

雖然目前關于iPSCs的研究還處于初級階段，但其在肝臟疾病治療方面已顯現(xiàn)巨大潛力。然而，其潛在的致瘤風險以及在重編程過程中的不確定性均可能降低其定向分化的潛能，這也是未來研究亟須解決的問題。

1.3MSCs MSCs是一類具有多向分化潛能的成體干細胞。1968年Friedenstein等[35]首次在骨髓中分離出MSCs。MSCs廣泛存在于人體骨髓、臍帶、脂肪、胎盤等組織中，具有易獲取、在體外也可保持增殖能力等優(yōu)勢，是目前研究最廣泛的干細胞[36]。MSCs以CD44、CD90、CD73、CD105、CD106、CD49等表面標志物陽性和CD45、CD14、CD34、CD11b、CD19、人白細胞抗原-DR等表面標志物缺失為特征[37]。MSCs治療肝硬化的機制主要包括其可轉(zhuǎn)化為HLCs、調(diào)節(jié)機體免疫反應以及旁分泌等。

1.3.1轉(zhuǎn)化為HLCs 研究表明，無論何種來源的MSCs均可在細胞因子、生長因子、化合物等的誘導下分化為HLCs，表達肝細胞特異性標志物白蛋白、細胞角蛋白19、甲胎蛋白、肝細胞核因子4α等[38]。隨著培養(yǎng)時間的延長，由MSCs轉(zhuǎn)化而來的HLCs表現(xiàn)出與肝細胞相似的功能，從而促進肝損傷的修復；此外，MSCs來源的HLCs還具有與肝細胞相同的產(chǎn)白蛋白、糖原儲存、尿素分泌、低密度脂蛋白攝取等功能[39]。提示MSCs移植后分化為HLCs可能是其治療肝硬化的關鍵機制之一[40]。

1.3.2調(diào)節(jié)機體免疫反應 MSCs調(diào)節(jié)機體免疫反應的途徑主要包括①調(diào)控巨噬細胞極化：巨噬細胞是一種廣泛分布于機體的免疫細胞，也是調(diào)節(jié)固有免疫的重要細胞，而巨噬細胞又分為經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。輔助型T細胞(helper T cells，Th細胞)1細胞因子(如γ干擾素)、病原體等均可激活M1型巨噬細胞，分泌促炎因子[如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β等]，促進肝損傷發(fā)展；若肝損傷持續(xù)，則巨噬細胞被Th2型細胞因子(如IL-4)誘導活化為M2型巨噬細胞，并分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等抗炎因子，促進肝損傷修復[41]。巨噬細胞的動態(tài)變化在肝損傷的發(fā)生和修復中均發(fā)揮重要作用。輸注MSCs后，小鼠體內(nèi)CD206+M2型巨噬細胞數(shù)量隨著時間的變化逐漸增加，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶13，促進膠原降解；同時，MSCs還可通過抑制M1型巨噬細胞及肝星狀細胞活化，發(fā)揮協(xié)同抗肝纖維化的作用[42]。表明MSCs可促進巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[43]。Watanabe等[44]比較了MSCs單一治療與MSCs聯(lián)合骨髓來源巨噬細胞治療四氯化碳誘導的肝硬化的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療的療效顯著優(yōu)于MSCs單一治療。②影響T細胞分化：MSCs可通過抑制Th1細胞和Th17細胞分化，減少γ干擾素和IL-17分泌、促進IL-10分泌，從而誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，使CD4+T淋巴細胞轉(zhuǎn)化為抗炎狀態(tài)，發(fā)揮治療作用[45]。③其他途徑：MSCs還可通過凋亡相關因子/凋亡相關因子配體途徑促進T細胞凋亡[46]或通過下調(diào)樹突狀細胞表面標志CD40、CD80、CD83、CD86以及主要組織相容性復合體的表達，降低其抗原呈遞能力[47]。以上研究表明，MSCs可通過調(diào)節(jié)機體免疫調(diào)節(jié)反應逆轉(zhuǎn)肝損傷所致的免疫失衡，為MSCs治療肝硬化提供了科學依據(jù)。

1.3.3旁分泌功能 MSCs的旁分泌功能也是促進肝再生、減輕肝損傷的重要機制之一。MSCs可表達各種細胞因子、趨化因子、生長因子以及外泌體，從而間接或遠程幫助組織修復[48]。因此，注射富含細胞因子、趨化因子、生長因子以及外泌體的MSCs條件培養(yǎng)基可成為一種新的無致瘤性、無免疫排斥的治療肝硬化的方法[49]。

MSCs可分泌細胞外囊泡，而細胞外囊泡主要由微囊泡和外泌體組成。MSCs的治療作用可能與細胞外囊泡所包含的細胞因子有關，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、單核細胞趨化因子-1、神經(jīng)生長因子和肝細胞生長因子等[50]。外泌體攜帶多種與MSCs相關的蛋白質(zhì)、脂類、DNA、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程[51-52]。來源于MSCs的外泌體與MSCs的治療作用相近，且具有體積小、便于生產(chǎn)和儲存等優(yōu)勢，是MSCs旁分泌的重要信使[53]。來源于MSCs的外泌體可抑制T細胞增殖以及γ干擾素、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子分泌，促進抗炎因子IL-10分泌，從而減輕肝臟炎癥反應；同時，還參與調(diào)控巨噬細胞極化，促進巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變，從而發(fā)揮抗纖維化作用[54]。miRNA是外泌體的關鍵分子，與肝纖維化程度密切相關，如肝臟中的miR-122水平最高，miR-122修飾的骨髓來源間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可有效抑制纖維化小鼠肝臟轉(zhuǎn)化生長因子-β1和α平滑肌肌動蛋白上調(diào)，通過負向調(diào)節(jié)肝星狀細胞的增殖和反式激活在肝纖維化的治療中發(fā)揮重要作用[55]。

此外，MSCs還可通過分泌調(diào)節(jié)性細胞因子(如肝細胞生長因子、神經(jīng)生長因子)刺激肝細胞再生[56]。與單純MSCs相比，經(jīng)過肝細胞生長因子處理的MSCs抑制肝纖維化的療效更好，可提高受損肝細胞共培養(yǎng)模型的細胞存活率[57]。因此，MSCs可能通過肝細胞生長因子途徑實現(xiàn)促肝再生作用。還有研究表明，使用IL-1β、γ干擾素等細胞因子對MSCs預處理可下調(diào)腫瘤壞死因子-α等促炎因子的表達，增加血管內(nèi)皮生長因子、單核細胞趨化因子1等的分泌，進而提高MSCs移植后的歸巢、增殖與分化潛能[58-59]。

2 MSCs治療肝硬化的臨床研究

目前MSCs治療肝硬化的機制已逐漸明確，且MSCs容易獲取、培養(yǎng)和擴增，同時由于MSCs缺乏人類白細胞抗原Ⅱ和共刺激因子而具有較低的免疫原性[60]，因此臨床應用前景廣闊。數(shù)據(jù)顯示，目前已有59項使用MSCs治療肝病的注冊臨床試驗，其中大多集中于肝硬化或纖維化，且多為Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅰ/Ⅱ期混合研究，尚無Ⅲ期臨床試驗[61]。與門靜脈相比，肝動脈是更佳的輸注途徑，且具有更好的歸巢效應[62]。

一項Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗納入8例肝硬化患者(包括4例乙型肝炎患者、1例丙型肝炎患者、1例酒精性肝炎患者和2例隱源性肝炎患者)，單次經(jīng)外周或門靜脈注射(3～5)×107個自體BMSCs，并于注射后1、2、4、8和24周評估患者肝功能和臨床特征，結(jié)果顯示，治療后患者的腹水均減少，且肝功能顯著改善(包括終末期肝病模型評分、國際標準化比值和血清肌酐水平)[63]。Suk等[64]觀察自體BMSCs移植治療酒精性肝硬化的療效與安全性，以肝纖維化的改善程度(前后兩次肝活檢比較)為主要終點指標，結(jié)果顯示，注射1次與注射2次BMSCs患者的肝組織膠原蛋白水平分別降低25%和37%，但療效與注射次數(shù)無關，且BMSCs移植可顯著改善Child-Pugh評分，同時不同劑量組不良事件的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義。Lin等[65]給予56例乙型肝炎病毒相關肝衰竭患者每周注射(1～10)×105個同種異體BMSCs，連續(xù)注射4周并隨訪24周，結(jié)果顯示，同種異體BMSCs注射可顯著改善患者肝功能，同時患者血清總膽紅素水平和終末期肝病模型評分均顯著降低。

另有研究將45例失代償期乙型肝炎肝硬化患者分為兩組，其中30例患者輸注臍帶來源的MSCs，另15例患者輸注0.9%的氯化鈉注射液，隨訪1年后發(fā)現(xiàn)，輸注臍帶來源MSCs患者的腹水量顯著減少，肝功能顯著改善，且無明顯不良反應。由此認為，輸注臍帶來源MSCs可能為失代償期肝硬化患者提供一種新的治療方法。Sakai等[66]對4例經(jīng)肝動脈注射自體脂肪來源MSCs的肝硬化患者的研究顯示，2例患者血清白蛋白水平顯著改善，且未見嚴重不良事件發(fā)生。

以上研究表明，臍帶、骨髓或脂肪組織來源的MSCs治療肝硬化的耐受性良好，且安全有效。但也有研究認為，自體BMSCs對失代償期肝硬化患者無效[67]。Moore等[68]系統(tǒng)回顧各種自體干細胞移植治療肝病的臨床研究發(fā)現(xiàn)，目前尚無明確的自體干細胞移植使肝硬化患者獲益的證據(jù)，這可能與早期臨床試驗多為小規(guī)模的非對照研究、無法評價其真正臨床療效有關。

3 小 結(jié)

目前干細胞移植治療肝硬化的研究仍以基礎研究為主，臨床研究主要集中于MSCs。雖然MSCs移植治療肝硬化安全、有效，但未來仍需更大規(guī)模的臨床研究確定最佳的細胞來源、輸注途徑、劑量以及治療窗口等。由于MSCs在體內(nèi)可通過分化為肝細胞、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化、抗氧化應激和抗凋亡等途徑促進肝損傷修復；而預處理后的MSCs在體內(nèi)外均具有良好的肝細胞分化、歸巢能力以及高存活率和旁分泌效應，因此，未來MSCs移植有望成為延長肝硬化患者生存率的有效方法。