孫曉燕，趙金紅

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

1 概述

黑色素合成對生物體抵抗紫外線照射和其他外部壓力至關(guān)重要，種類、含量及分布決定了動物的不同色素沉積表型。這些表型不僅代表了動物重要的天然外貌特征與生態(tài)多樣性，也為遺傳育種提供潛在的輔助標(biāo)記，而一些家畜的毛色與體色特征本身即具有重要經(jīng)濟價值。黑色素是以酪氨酸為底物，在黑色素細(xì)胞的特定細(xì)胞器——黑素小體中，受多種轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白和酶的精細(xì)調(diào)控協(xié)作處理，經(jīng)過一系列自分泌和旁分泌信號交互級聯(lián)事件后形成的。這一過程受遺傳途徑和環(huán)境因素的共同影響，其中所涉及的相關(guān)基因的突變均可影響動物的著色表型。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associtated transcription factor，MITF)是在黑色素形成路徑中起關(guān)鍵作用的一個轉(zhuǎn)錄因子，并且貫穿黑色素細(xì)胞發(fā)育、增殖和存活的始終[1]。MITF基因通過選擇性使用不同的啟動子，至少可編碼產(chǎn)生9種蛋白異構(gòu)體，其中，最短的MITF-M為黑色素細(xì)胞特異型[2]。MITF基因不僅在MC1R/cAMP/MITF這一經(jīng)典的黑色素合成通路中發(fā)揮核心作用，也參與了幾乎其他所有與黑色素生成有關(guān)的信號通路[3]。MITF基因活性與表達水平的異常與動物皮膚的疾病，如惡性黑色素瘤、皮膚脫色性疾病等有關(guān)，而皮膚系統(tǒng)在動物體內(nèi)平衡中起著重要的作用。因此，深入研究家畜色素沉積的遺傳途徑不僅具有重要的經(jīng)濟意義，還對動物與人類色素疾病發(fā)生的遺傳機制、診斷、預(yù)后和治療至關(guān)重要。

2 MITF基因?qū)倚笊爻练e性狀的影響

2.1 MITF基因?qū)ωi色素沉積性狀的影響

MITF基因被認(rèn)為是中國多個家豬品種(巴馬香豬、寧鄉(xiāng)豬、五指山豬)白色斑點模式的一個強有力的候選基因[4]，全基因組分析揭示了MITF基因參與了桐城豬“兩頭黑”這一性狀的形成[5]。Chen等在“榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系”的MITF基因的非調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)了僅對一個MITF-M亞型產(chǎn)生影響的突變，它產(chǎn)生了一種新的沉默子，MITF-M亞型表達的消除導(dǎo)致了豬耳蝸血管紋中間細(xì)胞的早期退化和深度聽力損失，以及色素脫失，其病理表現(xiàn)和發(fā)病規(guī)律類似人類Waardenburg綜合征(Waardenburg Syndrome，WS)的典型表型，提示這可能是一種新的在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)功能效應(yīng)的順式調(diào)控元件[6]。Du的研究同樣發(fā)現(xiàn)MITF突變可導(dǎo)致豬的WS[7]。張廷煥等明確了豬MITF基因3個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，及轉(zhuǎn)錄因子KLF4對其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控關(guān)系[4]。Bourneuf等對豬MITF可變轉(zhuǎn)錄本進行了特征描述，雖然未揭示其與多種黑素瘤相關(guān)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，但值得注意的是，在豬黑色素瘤樣本中，MITF異構(gòu)體的比率遵循其在人類腫瘤中相同的模式，因而推測不排除它在豬的黑色素瘤的發(fā)生和演變中發(fā)揮潛在顯著作用的可能[8]。合適的動物模型對于更好地解析復(fù)雜疾病的發(fā)病機制并確定治療方案至關(guān)重要，Waardenburg綜合征2型(Waardenburg Syndrome type 2，WS2A)在MITF突變的小鼠模型中的隱性模式傳播限制了對相關(guān)病理表型的研究，而豬在解剖、代謝和生理方面與人類更為相似，這突出了豬作為人類黑色素瘤模型的充分性。在過去幾十年間也一直有幾種不同的模型豬被維持，如Hai等通過乙基亞硝基脲誘變將MITF基因DNA結(jié)合區(qū)域的氨基酸進行替換，生成了一個新的WS2A小型豬模型[9]，所篩選出的MITF基因純合突變體豬也可作為研究色素疾病、眼發(fā)育缺陷、聽覺損失和神經(jīng)退行性疾病等復(fù)雜疾病的理想大型哺乳動物模型。目前，已有利用CRISPR/Cas9修復(fù)MITF突變導(dǎo)致的豬眼睛發(fā)育缺陷的報道[10]。

2.2 MITF基因?qū)εＩ爻练e性狀的影響

白化病可導(dǎo)致家畜的外貌不符合品種標(biāo)準(zhǔn)，并可能由于缺乏保護性黑色素而更易受到紫外線傷害，因此在畜牧生產(chǎn)中被廣泛認(rèn)為是一種不利的特征。在多個純種和雜交牛品種中均有完全或部分白化病的報道。德國弗萊維赫牛中被確定了一種與皮膚色素減退、虹膜異色、眼組織缺損和雙側(cè)聽力喪失相關(guān)的顯性遺傳綜合征，與人類中的WS2A對應(yīng)，位于MITF蛋白高度保守堿性區(qū)域內(nèi)的錯義突變(R210I)被確認(rèn)為該綜合征的原因[11]。在棕色瑞士牛中，MITF基因的5′UTR的變異(rs722765315)被認(rèn)為是白色斑點表型最有可能的原因[12]。Wiedemar等發(fā)現(xiàn)牛基因組22號染色體上，包括了MITF基因在內(nèi)的一個19MB的從頭缺失導(dǎo)致了一頭荷斯坦牛的小眼球癥和皮膚色素缺失[13]。張建一等發(fā)現(xiàn)牦牛黑色被毛的皮膚組織中的MITF表達量極顯著高于白色被毛[14]。MITF基因的變異也解釋了意大利的荷斯坦牛和西蒙塔爾牛的斑點和非斑點兩種表型之間的差異，但該基因的變異不是決定這兩個牛品種斑點病的唯一遺傳因素[15]。MITF基因及其與其他基因的互作還在確定埃薩俄比亞的Begait和Fogera牛種群中的斑點表型模式中發(fā)揮了作用[16]。一項對荷斯坦牛的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)包括MITF在內(nèi)的6個基因有望作為檢測2個色素沉積性狀(軀體黑色比例、乳頭顏色)的候選基因[17]。Jivanji等通過對混合品種與性別的大數(shù)量群體牛進行了大規(guī)模的基因繪圖研究，結(jié)果提示存在涉及KIT和其他基因的多個或多等位高度顯著數(shù)量性狀位點(QTL)，該發(fā)現(xiàn)擴展了之前關(guān)于牛MITF變異對皮膚色素沉積影響的研究內(nèi)容，提出了MITF和其他毛色相關(guān)基因候選致病突變之間的新關(guān)聯(lián)[18]。這些研究說明黑色素的形成涉及大量基因的參與和復(fù)雜的生化過程，牛出現(xiàn)白化表型的原因不能追溯到某個單一基因[19]。至今已有包括MITF基因和其他基因的突變被報道與牛的白化病或類似白化病的表型有關(guān)，因此，還需要更多相關(guān)表型的動物樣本與技術(shù)手段來闡明這些基因是否單個或多者結(jié)合才是真正的致因突變。

2.3 MITF基因?qū)︸R色素沉積性狀的影響

馬的白色斑點表型在一些品種中受到高度重視，與經(jīng)濟價值直接相關(guān)，斑點表型變化范圍可從很小的白色斑點到完全的白色。已有的研究證實MITF、EDNRB、KIT、PAX3和TRPM1基因代表了馬白色斑點表型的一部分已知候選基因[20]。Haase等報道KIT和MITF位點的一系列單倍型突變的積累是Franches-Montagnes馬白斑的主要決定因素[21]。Hauswirth等同樣發(fā)現(xiàn)MITF和PAX3的突變導(dǎo)致美國夸特馬的“濺白”色和其他白色斑點表型，并伴隨部分個體耳聾，這些“濺白”色的馬在MITF基因黑素細(xì)胞特異性啟動子中有一個10 bp的插入變異，除了“濺白”毛色的夸特馬中，這一啟動子插入變異還存在于其他品種的“濺白”毛色馬中，并且在具有白色斑點表型的其他品種馬的MITF基因中還發(fā)現(xiàn)了另外兩個非同義突變；MITF和PAX3基因的幾個獨立突變，加上之前已報道的EDNRB和KIT基因的變異，共同解釋了在更大范圍具有更極端白色斑點的馬的表型[22]。Negro等報道KIT和MITF基因的變異與西班牙Menorca純種馬(純色)和西班牙純種馬(具有不同毛色表型)的白色斑紋模式有關(guān)[23]。Henkel等在一個美國花馬家族分離出了具有白色斑點和藍色眼睛表型的個體，且其中部分個體耳聾，全基因組測序顯示白色斑點馬的MITF基因存在一個橫跨外顯子6～9的63 407 bp的大片段雜合子缺失，該結(jié)構(gòu)變異與色素脫失和耳聾風(fēng)險增加的綜合征表型非常吻合，并與人類WS2A相對應(yīng)[24]。新疆哈薩克馬具有獨特的斑點毛色表型，其中3種表型(白斑點騮毛馬、白斑點栗毛馬、青毛馬)的騮毛、栗毛的形成與MITF基因的表達量存在相關(guān)性，而其他斑點類型可能與其他調(diào)控基因有關(guān)[25]。由于馬斑點表型多變，缺乏規(guī)律性，關(guān)于馬毛色調(diào)控的遺傳機制仍未解析。已有的研究表明，MITF基因與其他毛色基因的復(fù)雜協(xié)同作用對馬各種斑點表型的調(diào)控機理有待進一步深入挖掘。

2.4 MITF基因?qū)d羊和山羊色素沉積性狀的影響

羊的毛色和花紋是具有重要生物學(xué)、經(jīng)濟和社會意義的重要特征之一。在藏羊中的研究表明，MITF基因可能與藏羊眼圈周圍黑色被毛和頸部棕黑色被毛有關(guān)[26]。楊玉靜等通過體外實驗證明綿羊黑素細(xì)胞中過表達MITF可提高黑色素的生成量[27]。Saravanaperumal等總結(jié)了7個MITF可變剪接體在美利奴綿羊皮膚中的表達情況，證明MITF基因的表達是通過一個內(nèi)含子6剪接事件介導(dǎo)的[28]。MITF基因還可受到G蛋白偶聯(lián)受體143(GPR143)、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的調(diào)控，參與綿羊被毛顏色的形成[29-30]。許冬梅等的研究表明MITF mRNA的3'UTR可受到miR-186-5p的靶向，MITF的表達和翻譯受到抑制，從而降低綿羊黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成[31]。Li等在芬蘭綿羊群體中的全基因組掃描研究表明，MITF基因是綿羊毛色性狀的潛在候選位點[32]。任航行等對不同膚色山羊皮膚組織的表達量分析顯示，MITF基因表達量無顯著差異，提示MITF基因在山羊身體著色機制中的作用有待于進一步研究[33]。此外，Jin等和Edea等開展的基因組選擇特征分析表明，MITF基因可能在那曲藏山羊和埃塞俄比亞綿羊群體的高海拔適應(yīng)中起著重要的作用，這也為綿羊和山羊種質(zhì)資源的保護和利用提供了新的理論基礎(chǔ)[34-35]。以上研究對MITF基因影響綿羊和山羊著色特征的遺傳機制尚未完全闡明，仍有待于進一步深入研究。

2.5 MITF基因?qū)ρ蝰勆爻练e性狀的影響

羊駝是一種毛用偶蹄哺乳家畜，具有多種毛色表型，可為毛紡織業(yè)提供重要的原材料。體外實驗證明MITF的磷酸化能夠促進羊駝皮膚黑素細(xì)胞黑色素形成[36]。另外，MITF基因可受到多種miRNA，如miRNA-25、miR508-3p、miRNA-96-5p、miR-380-3p、miR-143-5p的靶向，從而調(diào)控羊駝的色素沉著[37-42]。Wang等研究顯示MITF表達量還受到FGF21基因通過ERK1/2通路介導(dǎo)，從而影響羊駝黑素細(xì)胞的黑色素形成[43]。Anello等對白色和有著色的美洲羊駝的研究表明，MITF-M的表達水平在不同毛色表型的美洲羊駝上存在顯著差異，并且MITF-M表達的下調(diào)參與了美洲羊駝白色表型的產(chǎn)生，但導(dǎo)致白色皮毛顏色的原因仍有待進一步闡明[44]。

2.6 MITF基因?qū)ν蒙爻练e性狀的影響

何孟頡等對5個不同毛色表型的兔群體研究表明，MITF基因的表達可能影響獺兔皮膚和被毛的顏色[45]。牛曉艷等報道MITF基因的外顯子1、5、7中發(fā)現(xiàn)一些多態(tài)性與獺兔毛色有顯著關(guān)聯(lián)，是影響其毛色的關(guān)鍵基因[46]。Hu等研究發(fā)現(xiàn)不同毛色獺兔皮膚中黑色素含量及毛色表型基本一致，且MITF基因在黑色皮膚組織中的表達水平最高，表明與黑色素的形成有關(guān)[47]。MITF基因還可能受到SLC7A11基因的敲低和POU2F1基因異常表達的影響，從而影響兔的色素沉著[48-49]。王曼曼鑒定了家兔MITF基因的6種剪接異構(gòu)體(MITFX1-X6)并分別轉(zhuǎn)染到永生化兔黑色素細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)均顯著增加了黑色素細(xì)胞中總黑色素和真黑色素含量[50]，說明剪接異構(gòu)體并未影響MITF基因在兔黑色素細(xì)胞中的表達，但不同異構(gòu)體的下游信號通路存在著差異。黃燕平等報道了MITF基因在不同顏色獺兔(黑色、青藍紫色、白色)中的表達量水平差異極顯著，暗示MITF基因參與了獺兔毛色的形成[51]。已有的研究結(jié)果拓展了MITF基因在兔色素沉積中的作用，為后續(xù)深入解析兔色素沉積的遺傳機理提供了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)語

迄今已有超過150個基因在細(xì)胞或者亞細(xì)胞水平上被確認(rèn)參與調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞發(fā)育和黑素形成的不同途徑，提示轉(zhuǎn)錄后黑色素生成和著色基因表達調(diào)控機制的復(fù)雜性[52]。家畜群體產(chǎn)生的大量的自發(fā)突變體為解析MITF基因?qū)谒丶?xì)胞的遷移、增殖、分化和生存提供了便利，研究結(jié)果拓展了家畜色素沉積機制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為開展選育符合市場需求色彩特征的家畜提供了重要參考。這些研究結(jié)果既對現(xiàn)有的動物色素沉著機制提供理論補充，也為在治療動物色素相關(guān)疾病的研究中尋找藥物的作用靶點提供新線索，但同時也仍需進一步開展MITF基因與其他遺傳因子的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。另外，在人類中因患者數(shù)量少和難以建立針對嚴(yán)重顯性疾病的動物模型，對相關(guān)散發(fā)性綜合征的臨床病理和分子特征的研究受到一定阻礙，色素沉積有關(guān)疾病如黑色素瘤發(fā)生的機制目前尚未完全解析。而一些家畜(豬、牛、馬)中也可見相似特征的散發(fā)性綜合征，有望在后基因組時代為深入探索人類臨床病例的遺傳病因及相關(guān)分子機制提供合適的大型哺乳動物模型。隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展、測序成本降低、高密度SNP芯片基因分型技術(shù)發(fā)展、大型共享數(shù)據(jù)庫可用性提升，配合日益完善的生物信息學(xué)分析手段，全基因組序列大數(shù)據(jù)的可獲得性大大提高，可在各種家畜上開展快速解析遺傳結(jié)構(gòu)，為深入研究動物黑色素沉積的內(nèi)在調(diào)控機制提供更充分的理論依據(jù)。