安麗霞，吳小葉，王偉偉

（1.晉中信息學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.朔州市平魯區(qū)畜牧獸醫(yī)中心，山西 朔州 036000）

MiRNA-17-5p 是miRNA-l7-19 家族的成員，廣泛分布在動(dòng)物多種組織中[1]。至今miRBase（22.0）數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋了37 個(gè)物種的miR-17-5p 序列，在脊椎動(dòng)物中進(jìn)化保守[2]，參與細(xì)胞分化[3]、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)[4]、與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程相關(guān)[5]。研究表明，miR-17-5p 在動(dòng)物繁殖相關(guān)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。其中，miR-17-5p 對(duì)鼠黃體血管的形成必不可少[6]，而其在綿羊胎兒性腺和幼鼠的性腺中也具有高表達(dá)[7，8]。在斑馬魚(yú)（Barchydanio rerio var.）卵巢濾泡細(xì)胞中，miR-17-5p 在卵黃形成早期的表達(dá)量高于晚期[9]。miR-17-5p 作為抑制癌細(xì)胞的小RNA，其表達(dá)與雌激素水平相關(guān)，在人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）細(xì)胞系中，雌激素能改變其表達(dá)量[5]。目前，有關(guān)尼羅羅非魚(yú)性腺中miR-17-5p 的表達(dá)以及魚(yú)類性腺中miR-17-5p 對(duì)雌激素應(yīng)答反應(yīng)特征等尚未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究采用熒光定量PCR 的方法檢測(cè)了miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)性腺中及雌二醇（E2）處理后性腺中的表達(dá)特征，并采用生物信息軟件預(yù)測(cè)了miR-17-5p 的靶基因，對(duì)靶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)性別控制的潛在調(diào)控功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

1.1.1 miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)性腺中的表達(dá)

60 日齡的尼羅羅非魚(yú)雌、雄魚(yú)各6 尾，麻醉后解剖取其精巢和卵巢，放于液氮中速凍，隨后-80℃保存，用于提取總RNA。

1.1.2 雌二醇對(duì)miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)性腺中表達(dá)的影響

取雌雄的尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)各50 尾，平均體質(zhì)量為（43.1±0.2）g，平均體長(zhǎng)為（11.2±0.1）cm，分為4 組：雌二醇處理雄魚(yú)組、對(duì)照雄魚(yú)組、雌二醇處理雌魚(yú)組和對(duì)照雌魚(yú)組，每組25 尾。雌二醇先用無(wú)水乙醇溶解后，再用芝麻油按照體積比1∶10 稀釋，胸鰭基部腹腔注射，濃度為10 mg/kg 體質(zhì)量。對(duì)照組注射無(wú)水乙醇與芝麻油（體積比1∶10）的混合液。注射2 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 時(shí)，取實(shí)驗(yàn)魚(yú)精巢和卵巢組織（每次每組各取4 尾魚(yú)），置于液氮中速凍后，于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 的提取

根據(jù)文獻(xiàn)[10]提取精巢和卵巢總RNA，測(cè)定RNA的濃度和完整性。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)測(cè)序獲得的尼羅羅非魚(yú)miR-17-5p 序列設(shè)計(jì)特異性引物：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTA-3'，引物由上海生工合成，下游引物為T(mén)AKARA試劑盒自帶的通用引物。

1.4 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量

利用SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR 試劑盒（TaKaRa，RR716）對(duì)總RNA 中的miRNA 及其他小RNA 進(jìn)行Poly（A）加尾反應(yīng)，然后利用Universal Adaptor Primer 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后進(jìn)行熒光定量，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。利用2-ΔΔCT計(jì)算miR-17-5p 的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 軟件分析表達(dá)差異。

1.5 miR-17-5p 靶基因預(yù)測(cè)及其靶基因的生物信息學(xué)分析

由于羅非魚(yú)的相關(guān)信息沒(méi)有在miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄，所以miR-17-5p 的靶基因預(yù)測(cè)以斑馬魚(yú)基因組為基礎(chǔ)進(jìn)行。利用DIANA TOOLS 軟件（http://diana.imis.Athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/index）和TargetScan 軟件（http://www.Targetscan.org/fish_62/）分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，然后利用Venny 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取2 種算法預(yù)測(cè)的靶基因的交集，并利用上海伯豪生物技術(shù)有限公司的富集軟件（http://enrich.shbio.com/index/ga.asp）對(duì)交集靶基因進(jìn)行Gene ontology 富集分析和KEGG pathway分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚(yú)性腺中miR-17-5p 表達(dá)差異

miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)精巢和卵巢組織中均有表達(dá)，在卵巢中的表達(dá)量為精巢的10 余倍，極顯著高于精巢（P＜0.01）（圖1）。

圖1 miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)精巢和卵巢中的表達(dá)差異Fig.1 Expression difference of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia

2.2 尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)17α-乙炔雌二醇處理后，性腺中miR-17-5p 的表達(dá)變化

17α-乙炔雌二醇處理尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)后，性腺中miR-17-5p 的表達(dá)量變化顯著。與對(duì)照組相比，E2 處理后2d、7d、14d 和21d，卵巢中miR-17-5p的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），28 d 后，其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。17α-乙炔雌二醇處理2 d 和7 d 后，精巢中miR-17-5p 的表達(dá)量分別極顯著和顯著降低，至14 d 時(shí)表達(dá)量回升高。注射E2 后，性腺中miR-17-5p 表達(dá)趨勢(shì)仍為精巢的表達(dá)量顯著低于卵巢（P＜0.01）（圖2）。

圖2 17α-乙炔雌二醇處理尼羅羅非魚(yú)后精巢和卵巢中miR-17-5p 表達(dá)量的變化Fig.2 Change in expression level of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia exposed to 17α-ethinyl estradiol

2.3 通過(guò)軟件預(yù)測(cè)miR-17-5p 的靶基因

通過(guò)DIANA TOOLS 和TargetScan 軟件分別預(yù)測(cè)出miR-17-5p 的潛在靶基因分別為526 和6 612個(gè)，其交集靶基因?yàn)?33 個(gè)（圖3）。

圖3 Diana 與Targetscan 預(yù)測(cè)的miR-17-5p 靶基因的交集數(shù)Fig.3 The intersection of miR-17-5p target genes predicted by Diana and Targetscan

2.4 交集靶基因的功能分析

利用伯豪公司的富集軟件對(duì)333 個(gè)交集靶基因的Gene ontology 分析和KEGG 通路分析見(jiàn)圖4。Gene ontology 分析結(jié)果顯示，333 個(gè)靶基因中有238個(gè)基因分別富集到了214 個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目（Biological process）、72 個(gè)分子生物學(xué)功能條目（Molecular function）和31 個(gè)細(xì)胞組分條目（Cellular component）。顯著富集的前30 個(gè)GO 條目（圖4），主要包括生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和蛋白質(zhì)修飾等相關(guān)過(guò)程，其中與繁殖相關(guān)的FZD3B、CAPRIN2、WNT8B、WNT9B和SMO 富集到了經(jīng)典WNT 信號(hào)通路（canonical Wnt signaling pathway）。除這5 個(gè)基因外，MYLIPA富集到了WNT 信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）。

圖4 交集靶基因GO 富集分析Fig.4 GO analysis of intersection target genes

KEGG 通路分析結(jié)果顯示，333 個(gè)交集靶基因中83 個(gè)基因富集到72 個(gè)KEGG 通路，顯著富集的前30 個(gè)KEGG 通路見(jiàn)圖5。與繁殖相關(guān)的通路有MAPK 信號(hào)通路（包括的靶基因有：GNG12A、TAOK3B、MAP3K3、TAOK3A、FGF4 和CHUK）、TGFbeta 信號(hào)通路（包括的靶基因有：AMH 和SMAD1）、WNT 信號(hào)通路（包括的靶基因有：FZD3B、WNT8B、PLCB3 和WNT9B）和孕酮調(diào)節(jié)的卵母細(xì)胞成熟通路（包括的靶基因有：PDE3B 和SPDYA）。SPDYA 和PLCB3 分別富集到了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路和GnRH 信號(hào)通路中。

圖5 交集靶基因KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of intersection target genes

3 討論

有研究表明，miR-17-5p 是在多種組織廣泛表達(dá)的短鏈非編碼RNA，參與生長(zhǎng)、細(xì)胞的分化和腫瘤細(xì)胞的增值、凋亡等[3-5]。MiR-17-5p 在妊娠42 d的綿羊胚胎雌雄性腺中高表達(dá)，而妊娠72 d 則表達(dá)較低[7]。MiR-17-5p 在幼鼠發(fā)育的卵母細(xì)胞的卵子發(fā)生期高表達(dá)[8]、原生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞中均高表達(dá)[11]。斑馬魚(yú)（Barchydanio rerio var.）卵巢濾泡細(xì)胞中，miR-17-5p 表達(dá)量在卵黃形成的早期高于晚期，且用人絨毛膜促性腺激素（LH）處理后，濾泡細(xì)胞中miR-17-5p 的表達(dá)顯著降低，但不影響其在卵母細(xì)胞中的表達(dá)[9]。而與無(wú)卵黃期的肝臟相比，斑馬魚(yú)的有卵黃期肝臟miR-17-5p 表達(dá)水平高[12]。這些研究說(shuō)明miR-17-5p 在動(dòng)物繁殖中發(fā)揮重要作用。miRNA-17-92 家族的miRNA 在鼠的卵子發(fā)生過(guò)程中是細(xì)胞增殖的促進(jìn)劑和細(xì)胞凋亡的抑制劑[8]。本研究中，60 日齡的尼羅羅非魚(yú)處于精子和卵子發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，miR-17-5p 在精巢和卵巢中均有表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢，說(shuō)明miR-17-5p 參與魚(yú)類幼魚(yú)的性腺發(fā)育。

雌激素是一種類固醇激素，參與多種細(xì)胞和生理過(guò)程以及癌癥等疾病的發(fā)展，在魚(yú)類的性別決定和性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)，miRNA 參與雌激素信號(hào)通路和代謝，也可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)[13]。雌激素可直接調(diào)節(jié)miRNA 的轉(zhuǎn)錄，也可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA 生物合成通路上的關(guān)鍵酶和元件，調(diào)控miRNA 的產(chǎn)生和發(fā)揮功能[12]。在疾病研究中，乳腺癌的誘因之一就是擾亂的雌激素信號(hào)。雌激素處理人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7），會(huì)引起一系列miRNA 表達(dá)降低[14]。miR-17-5p 作為抑制癌細(xì)胞的小RNA，在該細(xì)胞系中，雌激素（E2）能使其表達(dá)降低[5]。雌激素暴露后，斑馬魚(yú)肝臟中的miRNA 表達(dá)量會(huì)降低[12]，但是，miR-17-5p 的表達(dá)未發(fā)生顯著變化。本研究中，尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)腹腔注射雌二醇后，精巢和卵巢中的miR-17-5p 表達(dá)量均顯著降低后又升高，這說(shuō)明在尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的性腺中雌激素能夠顯著降低miR-17-5p 的表達(dá)，調(diào)控性腺發(fā)育。

miRNA 的功能是轉(zhuǎn)錄后水平微調(diào)靶基因的表達(dá)。靶基因預(yù)測(cè)是研究miRNA 功能的重要手段。本研究采用不同的方法對(duì)miR-17-5p 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因取交集，進(jìn)行GO 分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)基因富集于WNT 信號(hào)通路。研究表明，WNT 信號(hào)通路可促進(jìn)綿羊卵泡的發(fā)育，其表達(dá)與雌激素濃度呈正相關(guān)[15]。雌二醇可以調(diào)控WNT 信號(hào)通路基因的表達(dá)[16]。WNT9B 基因?qū)Σ溉閯?dòng)物生殖系統(tǒng)具有重要作用，完全敲除WNT9B 基因后，雌小鼠輸卵管和子宮缺失，雄鼠附睪和輸精管缺失，但卵巢和精巢組織正常[17]。對(duì)miR-17-5p 交集靶基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn)，與繁殖相關(guān)的除了WNT 信號(hào)通路外，還包括MAPK、TGF-beta、卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和GnRH 等信號(hào)通路。MAPK 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)精子的發(fā)生、成熟、凋亡，及精子獲能和頂體反應(yīng)等繁殖過(guò)程[18]，其中FGF4 基因可誘導(dǎo)精子發(fā)生[19]。TGF-beta 信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)生和排卵過(guò)程以及配子形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。AMH（抗苗勒管激素）在雌性青春期之前都不表達(dá)[20]，性成熟后，卵巢的顆粒細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，AMH 會(huì)高表達(dá)[21]。AMH 在雄性青春期前睪丸組織高表達(dá)，與支持細(xì)胞的有絲分裂活性相關(guān)，參與精子發(fā)生[22]。SMAD1 對(duì)精子發(fā)生、發(fā)育和成熟起重要調(diào)節(jié)作用[23]。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟通路以及GnRH 信號(hào)通路都與性腺發(fā)育密切相關(guān)。SPDYA 基因能促進(jìn)非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵的細(xì)胞周期G2 期到M 期的轉(zhuǎn)換[24]。miR-17-5p 靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析有助于進(jìn)一步分析miR-17-5p 在魚(yú)類性腺發(fā)育中的作用。雌二醇也會(huì)影響這些靶基因所在的信號(hào)通路[16]，它們彼此間的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待于進(jìn)一步的研究。

結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p 在尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的精巢和卵巢中均表達(dá)，在卵巢中顯著高表達(dá)，說(shuō)明miR-17-5p 參與尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的性腺發(fā)育。用雌二醇處理后，精巢和卵巢中miR-17-5p 表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明雌二醇可以抑制該miRNA 的表達(dá)。多種軟件預(yù)測(cè)出的靶基因取交集后，多個(gè)靶基因富集與性腺發(fā)育以及繁殖相關(guān)的通路，為分析miR-17-5p的靶標(biāo)關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究其在魚(yú)類性別分化和控制中的作用提供理論依據(jù)。