王世會(huì)，羅亮，張瑞，郭坤，徐偉，張旭彬，趙志剛

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鹽堿水域漁業(yè)工程技術(shù)研究中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150070；3.黑龍江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，黑龍江 哈爾濱 150010）

河蟹即絨螯蟹（Eriocheir）是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類之一[1]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，河蟹包括中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、合浦絨螯蟹（Eriocheir hepuensis）和日本絨螯蟹（Eriocheir japonicus）三個(gè)有效種[2-4]。河蟹在我國分布范圍較廣，北到黑龍江省綏芬河流域，南至廣西壯族自治區(qū)南流江流域均有野生河蟹的自然分布。從20 世紀(jì)末到21 世紀(jì)初，隨著我國養(yǎng)殖河蟹產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，對(duì)河蟹良種的需求量也逐年增加。截至2021 年4 月，我國共培育了“光合1 號(hào)”[5]、“長(zhǎng)江1 號(hào)”[5]、“長(zhǎng)江2 號(hào)”[6]、“江海21”[7]和“諾亞1 號(hào)”[8]五個(gè)國家級(jí)河蟹新品種。雖然河蟹良種數(shù)量逐漸增多，但良種覆蓋率并不高。除了要加大現(xiàn)有河蟹良種的推廣力度外，開發(fā)新的河蟹種質(zhì)也是重要的途徑之一。

隨著種質(zhì)資源調(diào)查及相關(guān)科研工作開展，越來越多的河蟹種質(zhì)得到證實(shí)[9-13]，其中綏芬河河蟹個(gè)體大而廣受關(guān)注[14]。2003 年黑龍江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站率先開展了“綏芬河河蟹人工繁育及養(yǎng)殖技術(shù)研究”的科技攻關(guān)，培育出大眼幼體80 kg，約1 400萬只[14]。2020 年9 月調(diào)研表明，黑龍江省綏芬河天然水域河蟹雌體成蟹平均規(guī)格為（103.73±2.26）g，其中≥100 g 個(gè)體占比為46.39%；雄體成蟹平均規(guī)格為（148.63±7.27）g，其中≥150 g 個(gè)體占比為46.16%。這些數(shù)據(jù)說明，綏芬河河蟹規(guī)格差異較大，且大規(guī)格河蟹比例較高。同年秋季調(diào)研黑龍江省稻田養(yǎng)殖遼河水系河蟹的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)雌體成蟹平均規(guī)格僅為60 g 左右，雄體成蟹平均規(guī)格僅為103 g 左右。雖然池塘養(yǎng)殖模式河蟹規(guī)格有所提高，但與黑龍江省土著綏芬河河蟹種質(zhì)相比而言，其平均規(guī)格差異仍然較大。因此，系統(tǒng)評(píng)價(jià)綏芬河河蟹種質(zhì)資源，分析其群體遺傳多樣性，對(duì)我省土著河蟹的種質(zhì)開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前開發(fā)利用的河蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記，均以中華絨螯蟹為對(duì)象。而綏芬河河蟹種質(zhì)的分類地位目前存在一定爭(zhēng)議。綏芬河在中國境內(nèi)流經(jīng)東寧市后，隨后進(jìn)入俄羅斯境內(nèi)，在流經(jīng)185 km 后注入阿穆爾灣，進(jìn)入日本海。因?yàn)楹有肪哂袖в紊沉?xí)性，需要海水完成交配繁殖過程，所以綏芬河河蟹被普遍認(rèn)為是從日本海溯游到中國境內(nèi)的符拉迪沃斯托克河蟹，即日本絨螯蟹[13]。趙乃剛等[15]研究發(fā)現(xiàn)：俄羅斯符拉迪沃斯托克的河蟹表型處于中華絨螯蟹和日本絨螯蟹之間，但更接近于日本絨螯蟹。王武等[16]證實(shí)，綏芬河河蟹能夠與遼河水系中華絨螯蟹雜交，雜后代可以完成繁育，說明兩者之間不存在生殖隔離。隨后XU 等[4,17]證實(shí)綏芬河河蟹為中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分布混雜區(qū)，但姜曉東[13]通過地標(biāo)點(diǎn)法表明，綏芬河河蟹應(yīng)屬于中華絨螯蟹，而非日本絨螯蟹。雖然綏芬河河蟹的分類地位有待商榷，但種質(zhì)遺傳多樣性分析的前提是要先確定河蟹樣本數(shù)量、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量以及性比等關(guān)鍵參數(shù)。本研究通過探究影響綏芬河河蟹種質(zhì)遺傳多樣性的關(guān)鍵參數(shù)，以期為綏芬河河蟹遺傳多樣性分析及種質(zhì)開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020 年9 月，在黑龍江省東寧市綏芬河流域（131.18°E，44.07°N）采用地籠捕捉野生河蟹60 只（♀∶♂=1∶1），體質(zhì)量在100～150 g 之間，冷鏈活體運(yùn)輸至黑龍江水產(chǎn)研究所，取其附肢肌肉保存于-80℃冰箱中。

1.2 DNA 提取

采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的磁珠法動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（DP341-2，）提取綏芬河河蟹肌肉組織的DNA，隨后1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA 的完整性。DNA 樣品稀釋至50 ng/μL，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及PCR 擴(kuò)增

從已報(bào)道[18-22]的河蟹微衛(wèi)星引物中篩選出20對(duì)多態(tài)性較高的引物應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)。引物位點(diǎn)特征信息如表1 所示。所有正向引物（5' 端）采用FAM或HEX 熒光標(biāo)記，所有反向引物采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的常規(guī)引物。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL DNA 模板稀釋液、0.5 μL正向引物、0.5 μL 反向引物、2×Es Taq Master Mix（Dye）（CW0690，康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)）和8 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，隨后共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，包括94℃變性30 s，根據(jù)每個(gè)引物適宜的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸10 min。取少量PCR 產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的條帶后，其余PCR 產(chǎn)物置于-20℃貯存?zhèn)溆?。? 個(gè)不同熒光標(biāo)記（1 個(gè)FAM標(biāo)記和1 個(gè)HEX 標(biāo)記）的PCR 產(chǎn)物合并。將混合后的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司毛細(xì)管電泳檢測(cè)，根據(jù)分子標(biāo)記重復(fù)序列數(shù)和擴(kuò)增片段堿基數(shù)范圍，修正目的片段長(zhǎng)度，將目的條帶數(shù)值導(dǎo)入Microsoft Excel 中分析備用[10]。

表1 河蟹微衛(wèi)星引物位點(diǎn)特征Tab.1 Characterization of microsatellite loci in mitten handed crab

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各位點(diǎn)基因片段長(zhǎng)度，確定每個(gè)樣品各位點(diǎn)的基因型。利用Popgen 1.32 軟件分析遺傳多樣性參數(shù)信息，包括等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)威納指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）[23]；采用PIC_Calc 6.0 軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）[24]。

本實(shí)驗(yàn)探究了不同樣本量、位點(diǎn)數(shù)和性別比對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的影響。（1）不同樣本數(shù)量對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的影響分為6 組（60 樣本組、50 樣本組、40 樣本組、30 樣本組、20 樣本組和10 樣本組），每個(gè)樣本組采用的位點(diǎn)數(shù)量均為20 個(gè)，雌雄性別比均為1∶1；（2）不同位點(diǎn)數(shù)量遺傳多樣性參數(shù)影響共分為4 組（20 位點(diǎn)、15 位點(diǎn)、10 位點(diǎn)和5 位點(diǎn)），所用樣本數(shù)量為60 只，雌雄性別比為1∶1；（3）不同性別比對(duì)遺傳多樣性參數(shù)影響分為5 組：全部雌體、雌雄比2∶1、1∶1 和1∶2 及全部雄體，所用樣本數(shù)量為30 只，位點(diǎn)數(shù)量為20 個(gè)。

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANOVA 進(jìn)行方差分析，Duncan 氏法多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣本數(shù)量遺傳多樣性參數(shù)比較

不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)等位基因數(shù)量如圖1 所示。整體而言，隨著樣本數(shù)量減少，每個(gè)位點(diǎn)的Na值也呈下降趨勢(shì)，其中20 和10 樣本組的Na值下降明顯。等位基因數(shù)越多的位點(diǎn)，Na值下降幅度越大。60 樣本組Eril 3 位點(diǎn)的Na值最高，達(dá)到了26 個(gè)；Eril 1 位點(diǎn)的Na值最低，為7 個(gè)。10 樣本組Eril 16和Esin18 位點(diǎn)的Na值最高，均為12 個(gè)，而Eril 12位點(diǎn)的Na值最低，僅為3 個(gè)。不同樣本數(shù)量蟹各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)量除Eril 1 和Eril 2 位點(diǎn)外，其余10 樣本組各位點(diǎn)的Ne值均最低，從60 樣本組到10 樣本組的Ne值整體上呈下降趨勢(shì)。60 樣本組Eril 3 位點(diǎn)的Ne值最高，達(dá)16.5 個(gè)；Eril 5 位點(diǎn)的Ne值最低，僅2.4 個(gè)。10 樣本組Scaffold242247_151216 位點(diǎn)Ne值最低，僅1.7 個(gè)（圖2）。

圖1 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)等位基因數(shù)量Fig.1 The number of alleles in different individual numbers

圖2 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)量Fig.2 The number of effective alleles at each locus in different sample individual number groups

各位點(diǎn)觀測(cè)雜合度隨著樣本量的減少，除位點(diǎn)Eril 3、Eril 10、Eril 13 和Eril 16 的Ho值相差不大外，其余位點(diǎn)Ho值均變化明顯（圖3）。10 樣本組樣本量太少，明顯影響數(shù)據(jù)的真實(shí)度。

各位點(diǎn)期望雜合度數(shù)值變化情況，除Eril 1、Eril 2、Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點(diǎn)He值隨樣本量變化較大外，其余位點(diǎn)He值隨樣本量變化不大（圖3）。10 樣本組Eril 12 位點(diǎn)He值較60 樣本組下降了27.8%。

圖3 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)觀測(cè)雜合度Fig.3 The number of observed heterozygosity at each locus in different sample individual number groups

圖4 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)期望雜合度Fig.4 The number of expected heterozygosity at each locus in different sample individual number groups

各位點(diǎn)多態(tài)性信息含量變化情況，絕大部分位點(diǎn)隨樣本量變化不大，僅20 和10 樣本組的Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點(diǎn)PIC 值變化較大，其中10 樣本組Eril 12 位點(diǎn)PIC 值較60 樣本組下降幅度最大，約40%（圖5）。

圖5 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)多態(tài)性信息含量Fig.5 The polymorphism information content at each locus in different sample individual number groups

各位點(diǎn)香農(nóng)威納指數(shù)隨著樣本量的變化，I 值變化明顯。其中10 樣本量組與其它樣本量組差異較大。其中Eril 12 位點(diǎn)I 值較60 樣本組下降了51.04%，說明10 樣本組的樣本量太少，顯著影響了整體數(shù)據(jù)的真實(shí)度（圖6）。

圖6 不同樣本數(shù)量各位點(diǎn)香農(nóng)威納指數(shù)Fig.6 The Shannon Wiener Index at each locus in different sample individual number groups

不同樣本數(shù)量20 個(gè)位點(diǎn)的平均遺傳多樣性參數(shù)，60 樣本組與30～50 樣本組、20 樣本組和10 樣本組平均Na值存在顯著性差異（圖7-a）（P＜0.05），30～50 樣本組內(nèi)平均Na值無顯著性差異（圖7-a）（P＞0.05）。50～60 樣本組與20～40 樣本組、10 樣本組的平均Ne值存在顯著性差異（圖7-a）（P＜0.05），50～60 樣本組內(nèi)、20～40 樣本組內(nèi)平均Ne值則無顯著性差異（圖7-a）（P＞0.05）。不同個(gè)體數(shù)的平均Ho值、He值和PIC 值則無顯著性差異（圖7-b）（P＞0.05）。30～60 樣本組與20 樣本組、10 樣本組I值存在顯著性差異（圖7-b）（P＜0.05）。

圖7 不同樣本數(shù)量遺傳多樣性參數(shù)比較Fig.7 Comparison of genetic diversity parameters in different sample individual number groups

2.2 不同位點(diǎn)數(shù)量遺傳多樣性參數(shù)比較

60 個(gè)樣本量不同位點(diǎn)數(shù)量的遺傳多樣性參數(shù)如圖8 所示。不同位點(diǎn)數(shù)的平均Na、Ne、Ho、He、PIC和I 均無顯著性差異（P＞0.05）。由20 位點(diǎn)到15 位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)值差別不大，而5 位點(diǎn)的參數(shù)下降較為明顯，標(biāo)準(zhǔn)誤值明顯增大。說明位點(diǎn)數(shù)少會(huì)影響群體遺傳多樣性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

圖8 不同位點(diǎn)數(shù)量遺傳多樣性參數(shù)比較Fig.8 Comparison of genetic diversity parameters in different premier loci in different sample individual number groups

2.3 不同性別比遺傳多樣性參數(shù)比較

30 樣本量不同性別比的遺傳多樣性參數(shù)如圖9 所示。不論哪種性別組合，不同位點(diǎn)數(shù)的平均Na、Ne、Ho、He、PIC 和I 均無顯著性差異（P＞0.05），說明雌雄性別比對(duì)群體遺傳多樣性分析無顯著影響。

3 討論

遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種資源狀況的重要依據(jù)和從本質(zhì)上揭示物種起源、變異和進(jìn)化的重要手段[25]。遺傳多樣性參數(shù)包括等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)性信息含量（PIC）和香農(nóng)威納指數(shù)（I）等[12]，與基因豐度呈正相關(guān)[26]。

本研究表明：不同樣本數(shù)量綏芬河河蟹Na值差異較大，主要原因是Na嚴(yán)重依賴于樣本量的大小，大樣本量包含更多的等位基因[27]。針對(duì)同一位點(diǎn)Esin18 而言，遼河、黃河和長(zhǎng)江水系野生與養(yǎng)殖中華絨螯蟹共360 個(gè)樣本的Na為34 個(gè)[10]，長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹早熟與晚熟品系共480 個(gè)樣本的Na為52 個(gè)[28]，長(zhǎng)江、甌江、閩江和南流江水系野生河蟹共128 個(gè)樣本的Na為39 個(gè)[12]。而本研究綏芬河河蟹共60 個(gè)樣本的Na為23 個(gè)，明顯低于已往文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)值，主要原因有三點(diǎn)：一是本研究樣本量為60個(gè)，而上述相關(guān)研究的樣本量顯著多于本研究的樣本量；二是綏芬河河蟹為單一地理群體，而上述相關(guān)研究為多地理群體，多地理群體會(huì)增加基因豐富度；三是本研究所用位點(diǎn)為針對(duì)中華絨螯蟹開發(fā)的分子標(biāo)記，對(duì)綏芬河河蟹種質(zhì)可能存在一定的不適性。因此本研究Na值會(huì)較低。其余位點(diǎn)如Esin42、Esin67、Scaffold256287_157596、Scafold16450_13154、Scaffold387247_202848、Scaffold101834_74240、Scaf fold242247_151216、Scaffold306931_218734 等Na值與已往報(bào)道文獻(xiàn)[10,12,28]數(shù)值的差異原因同上。本研究中不同樣本量每個(gè)位點(diǎn)的Ne值均小于Na值，可能是等位基因在不同樣本量中分布不均勻、等位基因頻率分布不均所致[29]。

本研究中，不同樣本數(shù)量綏芬河河蟹Ho差異較大，主要原因是Ho很容易受到樣本量的影響[30]。He受樣本數(shù)量影響相對(duì)較小，本研究中僅20%位點(diǎn)受到樣本量影響，其余80%位點(diǎn)則相對(duì)較為穩(wěn)定，這與阮惠婷等[30]在飄魚（Pseudolaubuca sinensis）中的研究結(jié)果相似，因此He可以作為遺傳多樣性分析的重要參數(shù)，He數(shù)值越大，表明遺傳多樣性越高。PIC 是反應(yīng)群體的遺傳變異和等位基因位點(diǎn)多樣性的重要指標(biāo)[31]。當(dāng)PIC≥0.5 時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25＜PIC＜0.5 時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)；PIC≤0.25 時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)。本研究中僅20 和10 樣本量Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點(diǎn)PIC 值變化較大，且數(shù)值均大于0.5，說明綏芬河河蟹天然群體遺傳多樣性很高，但樣本量較少會(huì)影響PIC 數(shù)值的精確性。I 是反應(yīng)群體均勻性分布的一個(gè)重要指標(biāo)，一般情況下I 值介于1.5～3.0 之間[32]。本研究中10樣本量95%位點(diǎn)I 值明顯低于20～60 樣本量I 值，說明I 值受低樣本量影響較大。而超過20 樣本量后，I 值受樣本量差異影響較小。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，影響河蟹遺傳多樣性參數(shù)的位點(diǎn)數(shù)從6[33,34]到30 個(gè)[28]不等。本研究中20、15、10 和5 位點(diǎn)四種情況對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的影響結(jié)果表明：5 位點(diǎn)對(duì)Ne、Ho、He、PIC 和I 值影響較大，且標(biāo)準(zhǔn)誤數(shù)值偏大。這與目前無文章采用5 位點(diǎn)分析河蟹群體遺傳多樣性相一致[12,34,35]。Wang 等[12]采用30 只樣本量，8 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析長(zhǎng)江、甌江、閩江和南流江水系野生河蟹群體顯示，Ne分別為10.266、9.969、9.491 和7.308；熊良偉等[18]采用30 只樣本量，10 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析遼寧養(yǎng)殖、江蘇養(yǎng)殖和長(zhǎng)江野生群體的遺傳多樣性參數(shù)，表明每個(gè)群體的Ne分別為8.710、8.770 和9.030；劉青等[10]采用60 只樣本量，29 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析遼河、黃河和長(zhǎng)江水系野生與養(yǎng)殖中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性參數(shù)，表明每個(gè)群體的Ne值分別為13.080、13.757、14.099、13.550、14.006 和14.078；Li 等[28]采用60 只樣本量，30 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹早熟品系表明,不同選育世代（G0-G3）的Ne分別為16.729、13.391、15.038 和14.981，晚熟品系（G0-G3）的N 分別為16.591、14.775、13.236 和14.942。在檢索河蟹群體遺傳多樣性相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)一般樣本量較多的文獻(xiàn)，其應(yīng)用的位點(diǎn)數(shù)也較多，而Ne值受樣本量、檢測(cè)群體等多因素影響，因此，單純依靠現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道無法確定最小的位點(diǎn)數(shù)目。而本研究表明，60 只樣本量，20、15、10 和5 位點(diǎn)的Ne分別為8.870、9.464、8.432 和7.836，標(biāo)準(zhǔn)誤分別為0.971、1.214、1.512 和2.989。相同群體樣本量可以精確不同位點(diǎn)數(shù)量對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的影響數(shù)據(jù)。不同性別比對(duì)河蟹遺傳多樣性參數(shù)影響目前暫無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究表明，性別比對(duì)遺傳多樣性參數(shù)無顯著性影響，故在實(shí)驗(yàn)期間性別比對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的影響可以忽略不計(jì)。

綜上所述，不同樣本量對(duì)綏芬河河蟹各位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)Na、Ne和Ho影響較大，且10 樣本量降低了參數(shù)PIC 和I 數(shù)值。5 位點(diǎn)明顯降低參數(shù)Ne、Ho、He、PIC 和I 數(shù)值，性別比對(duì)參數(shù)無顯著影響。