紀達，許勁松，姚俊杰，安元銀，趙武，余忠奎，張昌幫

（1.貴州大學漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省水產技術推廣站，貴州 貴陽 550025；3.貴州省臺江縣水產技術推廣站，貴州 臺江 556300）

稻田中養(yǎng)殖的金背鯉Cyprinus carpio var.Jinbei（暫定名）背鰭兩側有兩條穩(wěn)定遺傳的金色條紋、頭蓋骨上有形似金色蝴蝶圖案而得名，俗稱“金邊鯉”、“金線鯉”、“苗鯉”等，主要分布在黔、桂、湘三省交界處。近年來，貴州大學漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心聯(lián)合多個單位以貴州省本土稻田金背鯉為基礎群體，針對貴州省稻田金背鯉開展選育工作。相比于建鯉Cyprinus carpio var.Jian、黃河鯉Cyprinus carpio 等，金背鯉性情溫順，在稻田中不易逃逸，覓食能力強，對溫差的耐受力強、耐低氧，易成活，適應稻田淺水環(huán)境，近年來已陸續(xù)在貴州及周邊省份推廣，是貴州省非常重要的地方稻田魚種質資源。

線粒體DNA（mtDNA）具有遵循母系遺傳、進化速率快等特點；線粒體基因片段D-loop、Cyt b、COI、COII 等已作為一些魚類遺傳多樣性的標記[1-5]。D-loop區(qū)是線粒體基因非編碼區(qū)，缺乏編碼壓力，進化速率更快，可以更為靈敏地反應遺傳多樣性，在生物群體系統(tǒng)進化及遺傳變異等研究中應用較多[6]。Cyt b 基因長度和進化速度適中，是遺傳多樣性、遺傳結構和系統(tǒng)分化的重要分子標記基因[7]。

近年來，對稻田魚的遺傳多樣性研究很多。Ren等[8]采用微衛(wèi)星（SSR）研究了青田田魚（Cyprinus carpio var.qingtianensis），發(fā)現(xiàn)稻田養(yǎng)殖青田田魚群體遺傳多樣性低于野生群體；甘寶江等[9]采用微衛(wèi)星研究廣西稻田養(yǎng)殖金邊鯉的遺傳多樣性，亦發(fā)現(xiàn)稻田養(yǎng)殖群體平均期望雜合度、多態(tài)信息含量、觀測雜合度均低于野生群體。目前貴州省稻田養(yǎng)殖金背鯉的遺傳多樣性尚未明確，本研究聯(lián)合線粒體DNA D-loop、Cyt b 基因分析貴州省5 個金背鯉群體的遺傳多樣性與遺傳結構，旨在更準確地了解貴州省稻田中金背鯉群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀與遺傳結構變異，為金背鯉的種質資源評價提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

前期經過調研發(fā)現(xiàn)，貴州省5 個區(qū)域有金背鯉（圖1、圖2）。2020 年8 月至10 月，先后在貴州省黔東南州的錦屏縣（JP）、黎平縣（LP）、從江縣（CJ）和黃平縣（HP）及都勻市勻東鎮(zhèn)（DY）取125 尾金背鯉樣本，每個采樣點25 尾，體質量為379.4～431.8 g，體長為22.51～24.90 cm（表1）。

表1 采樣信息Tab.1 Sampling information

圖1 金背鯉側面標準照Fig.1 Standard photo of side view of Jinbei commonn carp C.carpio var.Jinbei

圖2 金背鯉背部標準照Fig.2 Standard photo of dorsal view of Jinbei commonn carp C.carpio var.Jinbei

1.2 基因組DNA 的提取與檢測

剪取活金背鯉背部肌肉，無水乙醇-20℃保存。采用擎科生物科技有限公司的動物基因組提取試劑盒提取DNA，獲得的DNA 樣品采用分光光度計檢測樣品OD 值均在1.9 以上，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴增

D-loop 序列和Cyt b 序列引物分別為F1:5'-GGGAGGTAGCACTCCCTTTAT-3'，Y1:5'-TGATTAATTATATTAGAGTATTTAGTGTCGAGCCTC、F1:5'-AAAATCGCTAACGACGCACT，Y1:5'-AACCATC CTGCTAGTGGCATA，PCR 體系總體積均為25 μL，包括模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，金牌MIX（擎科生物有限公司生產）22 μL。PCR 擴增條件均為98℃預變性3 min，98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)，最后72℃終延伸1 min。產物用1%的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察產物長度與濃度，PCR 原液委托擎科生物有限公司進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

運用Clustal X 1.81 軟件將測序結果進行對位排序并輔以人工調整[10]；運用MEGA v6.0 軟件計算序列的堿基含量、變異位點、各種群間的遺傳距離，并使用鄰接法構建進化樹[11]；運用DnaSP v5.0 軟件統(tǒng)計單倍型（Hap）種類和數(shù)量，計算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性遺傳多樣性（Pi）、繪制核苷酸不匹配分布圖[12]；運用Arlequin v3.5 計算遺傳分化指數(shù)（Fst）和分子變異方差分析，以1 000 次置換分析顯著性，同時進行中性檢驗得到Fu's Fs、Tajima's D值[13]；基因流采用公式Nm≈（1-Fst）/4Fst計算；采用Network 5.0 構建單倍型網(wǎng)絡圖[14]。

2 結果與分析

2.1 金背鯉5 個群體D-loop 和Cyt b 序列堿基組成

對125 尾金背鯉線粒體DNA D-loop、Cyt b 區(qū)進行了擴增與測序，將測序結果兩端不穩(wěn)定部分裁剪，保留了748 bp（D-loop）和902 bp（Cyt b）的序列用于進一步分析。其中，D-loop 序列中4 種堿基平均含量為A（32.6%）、T（33.3%）、C（19.6%）、G（14.5%），其中（A+T）含量為（65.9）%、（C+G）含量為（34.1）%；Cyt b 序列中，4 種堿基平均含量為A（28.9%）、T（26.4%）、C（30.4%）、G（14.3%），其中（A+T）含量為（55.3）%，（C+G）含量為（44.7）%（表2）。

表2 5 個金背鯉群體D-loop、Cyt b 序列堿基組成（n=125）Tab.2 Base composition of D-loop and Cyt b sequences in five populations of Jinbei common carp C.carpio var.Jinbei（n=125）

2.2 基于D-loop、Cyt b 序列的遺傳多樣性參數(shù)

基于D-loop 和Cyt b 序列，5 個稻田金背鯉種群分別界定出21 和28 種單倍型，錦屏群體單倍型多樣度（Hd）和核苷酸多樣度（Pi）序列最低。黎平縣群體D-loop 序列最高，從江縣群體Cyt b 序列顯示最高（表3）。

表3 金背鯉群體線粒體D-loop 序列的遺傳多樣性參數(shù)（n=125）Tab.3 Genetic diversity parameters of mitochondrial D-loop sequence in groups of Jinbei common carp Cyprinus carpio var.jinbei（n=125）

2.3 NJ 系統(tǒng)樹與單倍型網(wǎng)絡結構

以青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii（Gen-Bank 登錄號：NC008661.1）為外群，基于Cyt b 序列構建稻田金背鯉5 個群體的鄰接系統(tǒng)樹（圖3）。結果顯示，金背鯉5 個群體間沒有形成獨立的譜系，種群間進化關系成交叉式嵌套，沒有較為明顯的地理分化。

圖3 基于Cyt b 序列構建單倍型鄰接系統(tǒng)樹Fig.3 Construction of haplotype adjacency system tree based on Cyt b sequence

用Network5.0 軟件基于Cyt b 序列繪制單倍型網(wǎng)絡圖。結果顯示，金背鯉各群體之間沒有形成明顯的地理結構，除都勻群體外，其余群體兩兩之間均有單倍型直接共享。除單倍型Hap3、Hap4、Hap6和Hap9 各自被4 個群體共享，5 個群體間沒有共享單倍型（圖4）。

圖4 基于Cyt b 序列構建單倍型網(wǎng)絡圖Fig.4 Haplotype network based on Cyt b sequence

D-loop 基因NJ 樹顯示（圖5），金背鯉C.carpio var.Jinbei 與黃河鯉C.carpio 聚成一枝，節(jié)點布展值為76，親緣關系最近，又與華南鯉Cyprinus rubrofuscus 與松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu 共同聚成一枝，節(jié)點布展值為45。

圖5 基于D-loop 基因的鯉群體NJ 進化樹Fig.5 NJ phylogenetic tree of Jinbei common carp Cyprinus carpio var.Jinbei population based on D-loop gene

Cyt b 基因NJ 樹（圖6）顯示，金背鯉與華南鯉C.rubrofuscus 聚成一枝，節(jié)點布展值為87，親緣關系最近，又與黃河鯉C.carpio 與甌江彩鯉Cyprinus carpio var.color 共同聚成一枝，節(jié)點布展值為92。

圖6 基于Cyt b 基因的鯉群體NJ 進化樹Fig.6 NJ phylogenetic tree of Jinbei common carp Cyprinus.carpio var.Jinbei population based on Cyt b gene

2.4 貴州省5 個金背鯉地理種群間的遺傳分化

基于D-loop 序列，5 個金背鯉群體間的遺傳距離在0.003～0.051 之間，其中黎平與從江群體間的遺傳距離最大，為0.051；錦屏與都勻群體間的遺傳距離最小，為0.003?；贑yt b 序列5 個金背鯉群體間的遺傳距離在0.003～0.006 之間，遺傳距離普遍較近（表4）。

表4 基于D-Loop 和Cyt b 序列的5 個金背鯉群體間及群體內遺傳距離Tab.4 Genetic distances between and within populations of Jinbei common carp Cyprinus.carpio var.Jinbei based on D-Loop and Cyt b sequences

5 個金背鯉群體間D-loop 序列的遺傳分化系數(shù)Fst值在-0.00108～0.33265 之間，其中都勻群體和從江群體間的Fst值最大，為0.33265；黃平群體與黎平群體間Fst值最小，為-0.00108。錦屏和從江群體分別與其余種群達到極顯著差異（P＞0.001）（表5）。

5 個金背鯉群體間Cyt b 序列的遺傳分化系數(shù)Fst值在-0.00565～0.2588 之間，其中都勻群體和錦屏群體間的Fst值最大，為0.2588；與D-loop 基因相同，黃平群體與黎平群體間Fst值最小，為-0.00565。除黃平與錦屏、黎平、從江群體未達到極顯著差異外（P＞0.001），其余群體間遺傳分化均達到極顯著差異（P＜0.001）（表5）。

黎平群體與黃平群體D-loop、Cyt b 序列基因流（Nm）均為無限大（Inf），錦屏群體與黃平群體基因流（Nm）分別為3.888、1.970，從江群體與黃平群體基因流（Nm）分別為4.381、6.842，其余種群間基因流（Nm）均＜1（表5）。

表5 五個金背鯉群體間的FST 與基因流Tab.5 The values of FST and gene flow among five populations of Jinbei common carp C.carpio var.Jinbei

AMOVA 分析結果顯示，基于D-loop 序列，群體間、群體內分子變異率分別為6.87%、93.13%，分子變異主要在群體內。群體總的遺傳分化系數(shù)Fst為0.06871，達到了極顯著性差異（P＜0.0001），說明金背鯉不同群體間發(fā)生了顯著遺傳變異?；贑yt b序列，群體間、群體內分子變異率分別為13.45%、86.55%，分子變異主要在群體內。群體總的遺傳分化系數(shù)Fst為0.13447，達到了極顯著性差異（P＜0.0001）（表6）。

表6 基于D-loop、Cyt b 基因的分子變異方差分析Tab.6 Analysis of variance of molecular variation（AMOVA）based on D-loop and Cyt b genes

2.5 稻田金背鯉的種群歷史動態(tài)

基于D-loop、Cyt b 基因，結合中性檢驗和核苷酸不匹配分析，對貴州省5 個稻田金背鯉群體及總體進行歷史動態(tài)研究。Fu’s Fs 和Tajima’s D 檢驗結果顯示，僅有錦屏群體、Cyt b 基因Tajima’s D 檢驗分別為-2.12144、-1.77969，且達到顯著性差異（P＜0.05），從江群體D-loop 基因Tajima’s D 檢驗為-2.57188，Cyt b 基因Fu’s Fs 中性檢驗為-3.84710，二者均達到顯著性差異（P＜0.05），其余均未達到顯著性差異（P＞0.05）。核苷酸不匹配分布圖（圖7）顯示，基于D-loop、Cyt b 基因，5 個稻田金背鯉群體的錯配分布曲線均呈現(xiàn)雙峰或多峰型，表明5 個群體歷史上均未出現(xiàn)種群擴張。

圖7 基于Cyt b 和D-loop 基因的5 個地理種群核苷酸不匹配分布圖Fig.7 Nucleotide mismatch distribution of five geographical populations of Jinbei common carp based on Cyt b and Dloop genes

3 討論

3.1 貴州省稻田金背鯉D-loop、Cyt b 基因堿基特點和遺傳多樣性現(xiàn)狀

3.1.1 貴州省稻田金背鯉D-loop 和Cyt b 基因堿基組成特點

金背鯉線粒體DNA D-loop 和Cyt b 基因堿基組成呈明顯的反G 偏倚。金背鯉5 個地理種群線粒體DNA D-loop 基因堿基平均組成為A（32.6%）、T（33.3%）、C（19.6%）、G（14.5%）；Cyt b 基因堿基平均組 成 為A（28.9%）、T（26.4%）、C（30.4%）、G（14.3%），其中G 含量明顯低于其他三種堿基含量，體現(xiàn)了線粒體DNA 堿基反G 偏倚的特點[15]。金背鯉線粒體DNA D-loop 和Cyt b 基因（A+T）含量（65.9%、55.3%）明顯大于（C+G）含量（34.1%和44.7%），體現(xiàn)了脊椎動物線粒體基因堿基分布不均的特點[16]。

3.1.2 貴州省5 個稻田養(yǎng)殖金背鯉群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀

單倍型多樣性、核苷酸多樣性指數(shù)是評價群體遺傳多樣性的兩項重要指標。Was G 等[17]將單倍型多樣性、核苷酸多樣性以0.5、0.005 作為高低的標準，都勻、黃平群體為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型；錦屏群體為低單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型；黎平和從江群體為高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性類型；楊博等[18]和向燕等[19]分別對青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）和浪白魚（Anabarilius grahami）線粒體DNA 進行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)所研究群體也出現(xiàn)高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性。向燕等[20]推測，所研究的群體是由一個數(shù)量較小的有效種群擴張而成，黃平、都勻地處貴州中部偏東，兩地金背鯉與外界金背鯉基因交流不多，數(shù)量較少的金背鯉群體在兩地各自擴張，加上單倍型多樣性較核苷酸多樣性短時間內積累快，出現(xiàn)高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型。本文在采樣前期大量走訪調查發(fā)現(xiàn)，從江與黎平靠近廣西邊界，與廣西金背鯉群體基因交流較多，出現(xiàn)高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性類型。而同為地處廣西邊界的錦屏，地理環(huán)境相對從江和黎平較為封閉，加上錦屏當?shù)氐咎镳B(yǎng)魚重心主要偏向本地魚“呆鯉”，導致遺傳多樣性逐年降低，出現(xiàn)低單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型。

3.1.3 貴州省稻田金背鯉群體整體遺傳多樣性現(xiàn)狀

相比于其他鯉，基于D-loop 基因，貴州省稻田金背鯉總體單倍型多樣性適中（0.672），高于河南省黃河鯉（0.572）、江蘇省福瑞鯉（0.136）、黑龍江省松浦鏡鯉（0.362）[21]，及廣西省建鯉（0.6160）[22]，低于貴州省清水江鯉（0.961）、江蘇省太湖鯉Cyprinus carpio Linnaeus（0.800）[21]，江西省興國紅鯉Cyprinus carpio var.singuonensis（0.9050），及黑龍江鯉（0.9310）[22]；核苷酸多樣度較低（0.00533），低于貴州省清水江鯉（0.007）、江蘇省太湖鯉（0.010）、河南省黃河鯉（0.007）、黑龍江省黑龍江鯉（0.008）[21]、廣西省建鯉（0.0065），及江西省興國紅鯉（0.0067）[22]，金背鯉的種質資源保護應引起重視。

3.2 貴州省稻田金背鯉5 個種群遺傳分化

魚類群體之間的遺傳距離是反應群體分化程度的主要指標[23]，Shaklee 等[24]提出屬、種和種群三級水平上的遺傳距離分別為0.9、0.3、0.05，本研究遺傳距離分析結果顯示，從江群體較其余群體遺傳距離明顯較遠（表4）。Crawford 和Littlejohn[25]提出，各群體間的遺傳距離越小，群體間的遺傳速度就越快，相似系數(shù)就越大，表明從江群體于其余群體親緣關系相對較遠。研究結果不符合地理距離模型原則，地理距離與遺傳距離呈反向相關，如黎平群體與從江群體地理距離最近，而遺傳距離反而最遠。吳俁學等[26]同樣研究發(fā)現(xiàn)，地理位置較遠的貴定縣大鯢（Andrias dauidianus）群體和松桃縣大鯢群體遺傳距離較小，并推測貴州喀斯特地形對大鯢種群造成了地理隔離,大鯢種群間可能通過地下暗河進行基因交流。同理推測，可能是貴州卡斯特山區(qū)相對獨立封閉的稻田環(huán)境造成了小范圍地理隔離。與野生群體不同，稻田養(yǎng)殖魚類之間基因交流受人為影響很大，貴州省少數(shù)民族聚集交錯，形成“大聚居、小雜居”的形式，少數(shù)民族之間文化差異可能會影響稻田魚就近引種，從而導致群體間遺傳距離不符合地理距離模型。

Balloux 和Nicolas[27]曾提出了群體間遺傳分化的標準：當Fst＜0.05 時表示種群間無遺傳分化；當0.15＞Fst＞0.05 時表示種群間產生了較小的遺傳分化；當0.25＞Fst＞0.15 時表示種群間產生了中度的遺傳分化；Fst＞0.25 表示種群間產生了較大的遺傳分化。本研究中，基于D-loop 和Cyt b 基因，從江群體與其余4 個群體均產生過較大遺傳分化（Fst＞0.25）。除黃平群體外，從江群體與其余3 個群體均出現(xiàn)基因流Nm＜1 的情況，再次表明從江群體出現(xiàn)較大遺傳分化，尤其是與黎平群體，兩個種群間D-loop、Cyt b 區(qū)均出現(xiàn)基因流Nm＜1 的情況，表明從江群體與其余群體之間基因交流少，這也就不難解釋5 個群體間沒有共享單倍型?；贒-loop、Cyt b 基因，黎平和黃平群體遺傳分化指數(shù)均小于0.05，基因流無限大，表明兩個地理種群進行了密切的基因交流，未產生遺傳分化，兩個群體可以看成一個群體。

NJ 鄰接樹（圖3）和單倍型網(wǎng)絡圖（圖4）均顯示，金背鯉5 個群體間沒有形成明顯的譜系結構和地理結構。AMOVA 分析結果（表6）顯示，基于Dloop、Cyt b 基因5 個金背鯉群體的遺傳變異系數(shù)分別為0.0687、0.1345，群體間變異分別占6.87%、13.45%，群體內變異分別占93.13%、86.55%，幾乎所有變異都發(fā)生在種群內部，表明稻田金背鯉群體間差異明顯小于群體內部差異，群體間未形成較大遺傳分化，再次表明群體可能是由一個數(shù)量較小的有效種群擴張而成。

D-loop、Cyt b 基因構建的NJ 樹不同，D-loop基因NJ 樹顯示，金背鯉與黃河鯉最先聚成一枝，然后和華南鯉、松浦鏡鯉聚在一起，而Cyt b 基因NJ樹顯示，金背鯉與華南鯉最先聚成一枝，再與黃河鯉聚在一起。同為線粒體兩個基因構建的NJ 樹存在差異，這與鄒輝等[22]的研究類似，鄒輝等推測原因可能是D-Loop 區(qū)遺傳學上多樣性豐富有關。兩個基因構建的NJ 樹表明，金背鯉與黃河鯉、華南鯉親緣較近，與甌江彩鯉、松浦鏡鯉存在一定親緣關系。

3.3 貴州省稻田金背鯉種群歷史動態(tài)

Fu's Fs、Tajima's D 中性檢驗和核苷酸不匹配分布圖能有效反應種群是否發(fā)生過擴張。Fu's Fs 檢驗傾向于反應種群近期發(fā)生的擴張，而Tajima's D 檢驗對種群歷史擴張更為敏感[28]。通常，當Fu's Fs、Tajima's D 中性檢驗出現(xiàn)顯著負值，核苷酸不匹配分布圖出現(xiàn)單峰的時候，可以認定種群發(fā)生過擴張。本研究中，基于D-loop 和Cyt b 基因，各群體中性檢驗均未出現(xiàn)顯著性負值（表3），核苷酸不匹配分布圖均表現(xiàn)為雙峰或多峰（圖7），表明金背鯉群體歷史上未出現(xiàn)過種群擴張。

3.4 稻田魚種質資源保護

近年來，隨著稻田養(yǎng)魚的發(fā)展，“稻田魚”的種質資源現(xiàn)狀越來越受關注，如浙江省稻田青田田魚群體遺傳多樣性低于野生群體[8]，甘寶江等[9]研究發(fā)現(xiàn)，相比于野生群體，稻田鯉群體遺傳多樣性呈現(xiàn)出下降趨勢。程磊等[29]研究發(fā)現(xiàn)，廣西禾花鯉因為受到其他鯉品種雜交影響導致種質遺傳漸滲。本研究基于D-loop 和Cyt b 基因，發(fā)現(xiàn)錦屏群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性極低，處于瀕危狀態(tài)，此地金背鯉的保護迫在眉睫。黃平、都勻群體為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型，各地理群體之間總體基因交流不多，既要加強群體間基因交流，也要定向選育，避免外源鯉的基因污染。同時，因地制宜，結合各地地理環(huán)境、水文特征等因素開展合理的保護措施。為彌補線粒體DNA 評估遺傳多樣性的不足，未來應利用單核苷酸多樣性（SNP）等分子標記技術，從核基因角度評估貴州省稻田養(yǎng)殖金背鯉群體遺傳多樣性，豐富貴州稻田金背鯉種質資源基礎數(shù)據(jù)。