閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，農業(yè)農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

鯉（Cyprinus carpio）是世界上和我國養(yǎng)殖范圍最廣的重要淡水魚類之一[1-5]。目前我國已培育出許多遺傳性狀的鯉品種和品系，如豐鯉（Feng carp）、荷元鯉（Heyumn hybrid carp）、岳鯉（Hybrid yue carp）、三雜交鯉（Three hybridized carp）、美蓉鯉（Furong carp）等[6-10]。鯉雖適應性強，耐寒，食性廣，生長速度快，但其品質較低（肌肉脂肪含量和鮮味氨基酸含量較低等）[11-14]。品質性狀是鯉生產的主要研究目標，對其品質的遺傳改良也是育種工作的一項重要任務。但在改良魚類的遺傳性，培養(yǎng)魚類新品種，尤其是培育遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良新品種的復雜過程中，利用傳統(tǒng)育種技術試圖改良鯉科魚類的品質等培育速度還較慢，單純依靠傳統(tǒng)的選種和雜交育種往往難以達到目的，必須綜合運用多學科的知識和多種現代科學技術，即將傳統(tǒng)的選育種技術和現代生物技術相結合才能更好地達到魚類改良的目的。顯微介導中國對蝦基因鯉是將中國對蝦總DNA 導入受體鯉內，期望通過這兩種基因水平的遠緣雜交技術達到改善鯉的品質，其優(yōu)點是外源基因的高水平表達，克服了鯉品質性狀遺傳力低的問題，使蝦基因的優(yōu)良性狀在受體鯉中得以體現。而通過外源基因的導入，作為生物遺傳改良、培育抗逆和快速生長品種的一種有效技術手段，已成為應用研究發(fā)展的重點[15,16]。

轉錄組（Transcriptome）廣義上指某一生理條件下，特定細胞類群內所有轉錄產物的總和，狹義上主要指mRNA[17]。轉錄組測序技術（RNA-seq technology）是測序轉錄本的RNA 序列，獲得轉錄本的結構和表達特征等相關信息。通過對轉錄組數據分析，能發(fā)現新的基因以及基因表達差異分析，并對重要的代謝通路及其基因進行定位，揭示了特定生物學過程中的分子調控機制[18-20]。目前，這一技術已廣泛應用在魚類研究中。如Ji 等[21]進行鯉的轉錄組測序，鑒定出全長cDNA 序列，其序列與斑馬魚（Barchydanio rerio var）、河豚（Takifugu rubripes）、青鳉（Oryzias latipes）、三刺魚（Gasterosteus aculeatus）相比較發(fā)現，有75.2%的contig 與斑馬魚的參考序列相接近，相似度最高；Liao 等[22]對鯽（Carassius auratus）的肌肉、腎臟、肝臟和腦等多種組織的轉錄組測序發(fā)現，腦部表達基因最多，分布在肌肉組織中的主要是上調基因，肝臟中主要分布的是下調基因，并挖掘出了高質量的SNP 和微衛(wèi)星標記；Mu等[23]在大黃魚（Larimichthys crocea）的脾臟等組織進行了轉錄組測序，經過KEGG 注釋分析，分別得到了多個抗病毒免疫效應因子；趙永麗等[24]對花斑裸鯉（Gymnocypris eckloni Herzensten）的肝、肌肉等多組織進行了轉錄組測序，為了解花斑裸鯉在高原特殊環(huán)境適應、資源保護、相關功能基因特點、科學數據的積累方面的研究奠定了基礎。

本研究通過對顯微介導中國對蝦基因鯉的肌肉轉錄組測序和差異表達分析，找到與氨基酸相關的差異表達基因，并對這些差異表達基因做進一步的功能分析，探明了顯微介導的外源基因在鯉品質改良中的價值，為進一步應用于改善鯉品質性狀提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用顯微介導中國對蝦基因鯉取自黑龍江水產研究所生物技術室，對照魚取自黑龍江水產研究所呼蘭試驗站。顯微介導中國對蝦基因鯉和對照魚各3 尾，均為2 齡。取背部肌肉組織，液氮保存?zhèn)溆?，由百邁客生物科技有限公司完成文庫構建及測序。

1.2 方法

RNA 提?。翰捎肨rizol 方法提取實驗魚和對照魚肌肉總RNA。分別取樣品50 mg 加入1 mL Trizol試劑，研磨，勻漿，培養(yǎng)細胞。向細胞裂解液中加入0.2 mL 的氯仿，充分顛倒混合，1 200 r/min 離心10 min，向上層水相中加入0.5 mL 異丙醇，離心，棄上層，加入1 mL 75%乙醇，7 500 r/min 離心5 min，棄上清，室溫干燥5 min，加入80 μL 無RNAase 水溶解RNA，待完全溶解后，-70℃保存。取適量RNA 樣品分別用紫外分光光度計NanoDrop 8000（Thermo Scientific）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的質量和完整性。

轉錄組文庫的構建和測序：提取的總RNA 檢測OD260/280在1.86～1.96 之間，RIN 值在7～10 之間，濃度、體積、總量等都符合用于cDNA 測序文庫的構建。cDNA 合成按照RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa）反轉錄試劑盒說明書進行。文庫的構建參見王步勇等[25],具體流程如下：經反轉錄，分離純化得到mRNA，再將mRNA 反轉錄合成第一鏈和第二鏈cDNA，末端修復，3’末端加上堿基“A”，接頭連接，PCR 富集，經文庫質量控制，在HiSeq 平臺上測序。

基因序列組裝及序列比對：對cDNA 文庫測序得到的數據為原始數據raw data，進一步過濾掉質量不好的reads 后，得到的數據為clean reads，再利用StringTie[26]軟件對比對上的reads 進行組裝，通過比對效率，可以評估所選參考基因組組裝是否能滿足信息分析的需求。StringTie 是基于最優(yōu)化理論建立的算法,利用比對信息構建多可變剪切圖譜,運用構建流量網絡,從而根據最大流量算法來對reads 進行組裝和評估其表達量。同Cufflinks 等其他軟件相比,該軟件可以構建更完整的轉錄本和更好的評估表達量。

新基因功能注釋：使用BLAST[27]軟件將發(fā)掘的新基因與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數據庫進行序列比對，使用KOBAS2.0 得到新基因的KEGG Orthology 結果，預測完新基因的氨基酸序列后使用HMMER 軟件與Pfam 數據庫比對，獲得新基因的注釋信息。

差異表達基因分析：在兩個不同條件下，表達水平存在顯著差異的基因或轉錄本，稱為差異表達基因（DEG）或差異表達轉錄本（DET）。差異表達分析得到的基因集合叫做差異表達基因集，用“A_vs_B”的方式命名。根據兩（組）樣品間表達水平的相對高低，差異表達基因可以劃分為上調基因（Up-regulated Gene）和下調基因（Down-regulated Gene）。上調基因在樣品（組）B 中的表達水平高于樣品（組）A 中的表達水平，反之為下調基因，上調和下調是相對的，由所給A 和B 的順序決定。篩選條件為log2FC≥2 且FDR＜0.01。對篩選出的差異表達基因做GO 功能分析和KEGG 通路分析[28,29]。

實時熒光定量PCR：提取顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉組織的總RNA，再反轉錄cDNA，隨機選取4 個差異表達基因，設計引物，以cDNA 為模板，β-肌動蛋白（beta-actin）作為內參基因，對顯微介導中國對蝦基因鯉進行實時熒光定量PCR 驗證，按照Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）熒光定量PCR 試劑盒進行，每個試驗樣品檢測3 次，結果與轉錄組測序結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉轉錄組測序

經測序，6 個樣品共獲得Clean Data 52.67 Gb，每個樣品平均6.32 Gb。Clean Data 質量值大于或等于30 的堿基所占的百分比都在94.16%及以上。Clean Data 中G 和C 兩種堿基占總堿基的百分比在48%以上，與參考基因組的比對效率從77.44%到81.67%不等（表1）。

表1 顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉轉錄組數據分析結果Tab.1 The results of muscle transcriptome sequencing for the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.2 差異表達分析

通過與鯉參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000951615.2）的序列比對，共檢測到417 個差異基因，其中上調基因246 個，下調基因171 個。圖1 中的每個點代表一個基因，上調差異表達基因為紅點，下調差異表達基因為綠點，非差異表達基因為黑點。橫坐標表示某一個基因在兩樣品中表達量差異倍數的對數值；縱坐標表示基因表達量變化的統(tǒng)計學顯著性的負對數值。

圖1 顯微介導中國對蝦基因鯉差異表達火山圖Fig.1 The volcano plot of differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.3 表達的轉錄本GO 注釋

對于已表達的基因進行GO 功能分類，共有12 995 個轉錄本可比對至GO 數據庫，其中8 835個轉錄本與代表紅色部分的生物過程（Biological Process）相關，1 119 個轉錄本與代表綠色部分細胞組成（Cellular Component）相關，3 041 個轉錄本與代表藍色部分的分子功能Molecular Function）相關。圖2 中的縱坐標：左邊代表基因數目所占百分比，右邊代表基因數目；橫坐標：代表GO 分類。

圖2 顯微介導中國對蝦基因鯉基因的GO 功能分類Fig.2 Gene ontology analysis for the differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.4 表達的轉錄本KEGG pathway 注釋

為了進一步了解轉錄本的生物學功能，進行KEGG 代謝通路注釋。共有241 968 個轉錄本比對到273 個KEGG代謝通路中。其中，對照魚為121 413個（對照魚1 為41 044 個，對照魚2 為40 259 個，對照魚3 為40 110 個），實驗魚為120 555 個（實驗魚1 為39 680 個，實驗魚2 為41 643 個，實驗魚3為39 234 個）。圖3 中橫坐標為富集因子（Enrichment Factor），縱坐標表示通路名稱，圖3 中每一個圓表示一個KEGG 通路。

圖3 顯微介導中國對蝦基因鯉差異表達基因KEGG 通路富集分析結果Fig.3 KEGG enrichment analysis for the differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.5 RT-PCR 分析

為了驗證結果的可靠性，從轉錄組數據的分析中，選出c7950（蘇氨酸脫水酶）上調基因和c41918（氨甲?；?磷酸合成酶）、c39168（乙胺基轉移酶）、c39902（脯氨酰4-羥化酶）等4 個下調基因，進行了RT-PCR 檢測。結果與轉錄組分析結果一致。在氨基酸代謝通路中，由于所關注的c41918 基因的下調，可使天門冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量增加；而c39902 基因在精氨酸和脯氨酸代謝代謝通路中，下調導致脯氨酸積累。圖4 中這兩個基因都低于對照組，表明基因是下調的。

圖4 顯微介導中國對蝦基因鯉差異表達量分析圖Fig.4 Differential expression analysis for the genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

3 討論

轉錄組測序的優(yōu)點不僅是檢測范圍廣泛（如不同的環(huán)境條件、每個物種的不同發(fā)育階段等），而且也是篩選差異表達基因和挖掘功能基因的重要手段[30]。有關鯉轉錄組研究已有報道，如劉思嘉等[31]比較研究了松浦鏡鯉（Songpu mirror carp）及荷包紅鯉（Cyprinus carpio Red var.vuyuanensis）的轉錄組，檢測了兩種魚在低溫環(huán)境條件下的表達基因的差異，通過對相關基因在耐受低溫環(huán)境條件下與信號通路參與的評定，探索了兩種魚在低溫條件下的分子調控機制；趙剛等[32]對巖原鯉（Procypris rabaudi）轉錄組進行了測序，獲得了許多轉錄組信息，為巖原鯉在抗病性、遺傳育種和資源恢復上提供了幫助；Liang 等[33]對黑龍江野鯉（Cyprinus haematopteru）進行了轉錄組測序研究，發(fā)現參與蛋白定位、蛋白轉運、蛋白加工、內吞作用、胰島素、溶酶體和生物節(jié)律調控等相關代謝通路的低溫響應基因被顯著富集；王蘭梅等[34]分析了生長速率不同的福瑞鯉2 號（freshwater fisheries research center,FFRC 2 strain）肌肉組織的轉錄組，比較分析了福瑞鯉2 號的2 個轉錄組文庫，鑒定出了mb、myl2b、fhl1、tnni1、pdk2 和lamb3 等6 個魚肌肉生長相關的關鍵基因,這一發(fā)現也為魚類新品種優(yōu)良生長性狀以及后續(xù)的基因功能研究奠定了基礎。這些研究主要是鯉在低溫下分子調控機制和在抗逆性狀上的轉錄組分析方面的報道，而基于對鯉品質性狀的轉錄組測序研究少有報道。目前，為了能在顯微介導中國對蝦基因鯉中找到可控制高氨基酸性狀的基因，本實驗室在對顯微介導中國對蝦基因鯉的外源基因檢測、氨基酸和蛋白質含量的測定以及重金屬含量的測定等方面做了大量的工作[13,14]。在此基礎上，本研究對顯微介導中國對蝦基因鯉進行轉錄組分析，旨在挖掘與鯉氨基酸相關的基因。在測序前，檢測了測序樣本外源基因和氨基酸，選出已整合外源基因且氨基酸總量高的顯微介導的中國對蝦基因鯉和對照鯉各3尾用于轉錄組測序，利用生物信息學對測序結果進行分析。結果6 個樣品測序數據經質量控制后，共得到52.67 Gb 的有效數據，發(fā)現了10 634 個新基因。經GO 功能富集與KEGG Pathway 顯著性富集分析，共篩選出差異基因417 個，其中246 個上調基因，171 個下調基因。進一步分析中發(fā)現18 個差異表達基因與氨基酸相關，其中14 個下調基因（Down-regulated Gene），4 個上調基因（Up-regulated Gene），下調基因要多于上調基因。這些基因主要遍及在組氨酸代謝，色氨酸，精氨酸，絡氨酸等9 個氨基酸代謝通路上。分析中還發(fā)現，氨甲酰-磷酸合成酶（carbamoyl-phosphate synthetase 2，CPS2）酶基因和脯氨酰4-羥化酶（prolyl 4-hydroxylase，P4H）基因在氨基酸代謝通路中能引起氨基酸含量升高。

本研究在肌肉組織中篩選到的氨基甲酰磷酸合成酶是催化谷氨酰胺、ATP 和碳酸根合成氨甲酰磷酸的酶。它參與生物體內嘧啶核苷酸的合成，是維持生物生理活動的一種重要酶[35]。而催化氨基甲酰磷酸（carbamyl phosphate）生成的酶，有兩種分型，分別為氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ（carbamoyl phosphate synthetase I,CPS-I）和氨基甲酰磷酸合成酶2（carbamoyl phosphate synthetase 2,CPS-2）。而氨基甲酰磷酸合成酶2（carbamoyl phosphate synthetase 2,CPS-2）存在于各種細胞的細胞液中，用谷氨酰胺為原料，合成嘧啶。在氨基酸代謝通路中，首先CPS2在丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路中有兩個功能：一是催化天門冬氨酸（L-Aspartale）合成天門冬氨基甲酰（N-carbamoyl,L-Aspartale）。該基因在所有的轉基因鯉中均表達下調（19.4 倍），就會導致天門冬氨酸（L-Aspartale）增加，進而導致丙氨酸（L-Alaming）的增加；另一個功能是導致谷氨酸（L-Glutamate）的增加，在該通路中原本是催化谷氨酸合成產生氨甲酰磷酸，谷氨酸減少，但由于該基因是下調基因，產物變少，谷氨酸含量增加；其次CPS2 在魚類上的另一個作用是可以將氨轉換成魚類的主要排泄物尿素，在排氨和排尿素兩種排氮的廢物方式上，顯然是直接排氨更省能量，最終對生長也有力。因此CPS2 基因不僅在代謝通路上可使天門冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸增加，也可起到幫助魚類生長的作用。另外，脯氨酰4-羥化酶基因在精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）通路中，由于下調（下調3.5 倍），導致脯氨酸積累。該基因使脯氨酸（probine）向下代謝的三個酶表達下調，脯氨酸積累。結果表明，CPS2 和P4H 在基因鯉中雖然都表達下調，但都在氨基酸代謝通路中引起氨基酸含量的升高。

綜上所述，本實驗通過高通量測序技術獲得了顯微介導中國對蝦基因鯉與對照鯉的轉錄組信息，并通過生物信息學進行了差異分析。測序結果發(fā)現，6 個樣本的測序質量值Q30 堿基百分比在94.0%以上，說明測序質量較好。對顯微介導中國對蝦基因鯉與對照鯉的差異表達基因進行了分析，在氨基酸代謝通路上發(fā)現了與氨基酸相關的一些差異基因。這些基因是否就是隨機轉入鯉中的對蝦DNA 片段所帶來，還有待于進一步研究。從轉錄組的分析結果可知，導入的外源對蝦基因可能參與了一些蛋白質合成與分解等代謝過程的信號通路，從而影響到顯微介導中國明對蝦基因鯉的蛋白質組成，最終影響顯微介導中國明對蝦基因鯉氨基酸的變化。當然，本實驗所獲得的結果也說明，對蝦基因的導入對顯微介導中國對蝦基因鯉的影響也可能不僅是影響單個或幾個信號通路，而是在接納對蝦基因后使得整個機體發(fā)生了一系列更為精細而復雜的代謝變化，這些都還有待于繼續(xù)深入的研究。進一步從基因表達和基因調控等分子水平研究對照鯉和轉基因鯉的差異，不僅有助于深入理解其品質的差異，也有助于更加深入地認識氨基酸和脂肪酸等一系列代謝過程[14]。鯉的品質性狀是鯉生產的重要研究方向，提升鯉品質的遺傳改良已成為首要環(huán)節(jié)。發(fā)現和利用優(yōu)質鯉品種的遺傳資源，篩選和鑒定控制鯉品質性狀的功能基因，闡明品質性狀形成的分子調控機理，是現代生物技術與傳統(tǒng)方法共同改良鯉品質的新方法和新途徑，對提高鯉品質性狀具有重要意義。在研究中發(fā)現的一些基因在影響鯉的氨基酸變化中存在一定的相關性，這為本研究提供了重要的參考依據。