吳 艷 李 賽 吳可心 穆立薔

（東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 50040）

刺薔薇（Rosa acicularis）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是典型的野生資源植物，主要生長在中國東北、西北、華北等地區(qū)［1］，是優(yōu)質的醫(yī)用與藥用植物［2-3］。刺薔薇果實中維生素C 和超氧化物歧化酶含量極高［4］，且風味物質豐富多樣［5］，是具有較好開發(fā)前景的野果資源。刺薔薇花可提取揮發(fā)油（花精油）［6］。刺薔薇葉片富含單寧，可提制栲膠［1］；同時含有豐富的黃酮和多酚類抗氧化物質［7］?！敽铡趟N薇（R. acicularis‘Luhe’）是俄羅斯從野生刺薔薇中選育出的一個品種，我國經西伯利亞引進。相比于野生刺薔薇，其在觀賞性［8］、抗鹽堿脅迫［9］、花精油得率［6］等方面表現(xiàn)更好，但其抗脅迫性尚不能完全適應高寒或高鹽堿地區(qū)［10］。

代謝組學（Metabonomics）是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后又一新興的組學方法［11］。該方法通過高通量檢測和數據處理對代謝物組群指標進行分析，對生物代謝物質信息進行建模與系統(tǒng)整合，對研究對象進行代謝產物定性定量的分析，進而探究生物體的代謝過程和變化機制［12］。但生物體內代謝途徑和產物眾多且復雜，僅植物的代謝產物就有20 萬～100 萬種［13］。代謝組學方法目前廣泛應用于植物學研究中。其中GC-MS（氣相色譜-質譜聯(lián)用）是一種靈敏度高、分離效果好、較為成熟的代謝組學檢測方法，且有多個大型公共數據庫用以檢測和匹配代謝物數據［14］。

葉片是植物重要營養(yǎng)器官葉的主要組成部分，是植物體光合作用和很多生理活動的主要承擔者，葉片的代謝物數據可以反映整個植物種類的生理特性。目前有關刺薔薇葉片的研究多以提取精油及其抗氧化能力為主［15］，暫缺乏有關葉片的代謝研究。本研究旨在通過GC-MS 代謝組學方法，探究野生刺薔薇和‘魯赫’刺薔薇的葉片代謝差異，分析和總結野生與人工栽培的2 種刺薔薇的葉片代謝差異，為刺薔薇種質資源評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

野生刺薔薇和‘魯赫’刺薔薇葉片于2019 年9月分別取自黑龍江省伊春市湯旺河和哈爾濱市東北林業(yè)大學植物園，均經東北林業(yè)大學穆立薔教授鑒定。選取長勢良好且高度相近的植株，剪切無病蟲害侵染、品相良好的成熟葉片若干，冰袋保存，每種樣品準備3個生物學重復。所有樣品用去離子水洗凈，濾紙吸干，備用［16］。

1.2 樣品制備

精密稱取90 mg 葉片，置入2 mL 離心管；加入2 粒小瓷珠和540 μL 的含內標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1）甲醇，超低溫冷卻（-80 ℃，2 min）；放入研磨機中研磨（40 Hz，2 min），研磨徹底后超聲提取30 min（100 W）；加入300 μL的氯仿，漩渦震蕩（20 Hz，2 min）；加入600 μL的去離子水，重新漩渦震蕩；超聲提取30 min，低溫離心（14 000 r·min-1，4 ℃，10 min）；取700 μL 的上層溶液，導入新的2 mL離心管中，真空離心并濃縮揮干；向試管中加入400 μL 的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg·mL-1），漩渦震蕩（20 Hz，2 min），將試管置入震蕩培養(yǎng)箱（37 ℃，90 min）；取出試管后加入400 μL的BSTFA（含1%的TMCS）和60 μL 的正己烷，漩渦震蕩（20 Hz，2 min），水浴（70 ℃，60 min）；取出樣本，室溫放置30 min，移入GC-MS樣本小瓶［17］。

1.3 GC-MS進樣條件

使用Agilent 7890A 自動進樣器進樣至Agilent 7890B 色譜儀（均為美國安捷倫公司）和5977B 質譜儀，經非極性DB-5 毛細管色譜柱（30 m×250 μm I.D.，美國加州Folsom 公司）分離后進入Agilent 5977B 質譜儀，進樣口溫度260 ℃，He 氣純度99.999%，流速1.0 mL·min-1，分流比1/10；升溫程序為60～125 ℃（8 ℃·min-1）到125～210 ℃（4 ℃·min-1）到210～270℃（5 ℃·min-1）到270～305 ℃（10 ℃·min-1）；終溫305 ℃，保持3 min；EI 源電壓-70 V，溫度260 ℃；質量掃描范圍50～600 m·z-1，采集延遲5 min，采集速率為每秒20個光譜［18］。

1.4 數據處理與分析

使用R 語言XCMS 數據包對原始數據進行降噪、過濾、峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、文庫匹配等預處理［19］，使用Excel 2019 進行峰面積歸一化法處理和對數轉換，使用SIMCA 14.1進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），使用SPSS 25 進行t檢驗，登錄KEGG 官網（https：//www.kegg.jp/）查詢差異代謝物ID 代號，將其代入MBRole 2.0（http：//csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）分析差異代謝通路，使用R 語言進行層次聚類分析和富集代謝氣泡圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 兩種刺薔薇葉片代謝物總體差異

經GC-MS 非靶向代謝組學［20］對2 種刺薔薇葉片進行的代謝組學分析，共匹配出51種代謝物，包括6種氨基酸、12種糖類、4種烷烴類化合物、17種有機酸（不包含氨基酸）、5 種酯類和7 種其他類化合物（見表1）。使用峰面積歸一化法得出各代謝物的相對含量。

表1 兩種刺薔薇葉片的代謝物成分Table 1 Elements of metabolites of leaves from 2 R.acicularis

由于植物葉片含有的代謝物多為沸點較高的非揮發(fā)性物質，須將其進行衍生化處理才能進入氣相色譜儀檢測［21］。本試驗使用的三氟乙酰胺衍生化試劑（BSTFA）含1% 的三甲基氯硅烷（TMCS），原始數據中檢測到的化合物主要為硅烷化后的衍生物［22］，對各代謝物峰面積歸一化的計算應去掉衍生化所帶來的-SiH2-亞甲硅基，才能得出較為準確的峰面積數據。計算的公式如下：

式中：S為代謝物新峰面積，S0為原始數據中的峰面積，M0為衍生化產物的分子質量，n為衍生化增添的Si 原子數量（代謝物原本含Si 原子的不計入），MSi為-SiH2的分子質量（取s30.10）。

2.2 總代謝物PCA分析

對2 種刺薔薇葉片的GC-MS 代謝物總數據進行主成分分析（PCA），在95%的置信區(qū)間內可得R2X=0.751 497，R2X＞0.5（見圖1），說明根據試驗數據建立的PCA 模型穩(wěn)定，可以用于結果解釋以及后續(xù)的處理。從結果圖中可知，‘魯赫’刺薔薇葉片和野生刺薔薇葉片的PCA 模型坐標分別分布于y軸兩側且分布較為均勻，初步證明二者的代謝物存在明顯的不同，且同種間差異較小，可對其進行進一步的差異代謝物研究。

圖1 兩種刺薔薇葉片總代謝物PCA分析Fig.1 PCA analysis of total metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

2.3 總代謝物OPLS-DA分析

對2 種刺薔薇葉片的GC-MS 代謝物總數據進行正交偏最小二乘分析（OPLS-DA），可得R2X=0.966 663，Q2=0.920 560，R2X和Q2均＞0.5，且R2X＞Q2，二者相差極小且接近1，初步說明該模型較為有效可行。繪制2 種刺薔薇葉片代謝物的OPLSDA的3D圖，由圖2可知，2組數據的模型分別位于x=0，y=0 平面兩側，且各自較為聚集，可以有效說明二者間代謝差異較為明顯且同種間差異較小，建立的OPLS-DA模型較為符合預期。

圖2 兩種刺薔薇葉片總代謝物OPLS-DA的3D圖Fig.2 3D diagram of total metabolite OPLS-DA in leaves of two kinds of R.acicularis

為防止OPLS-DA 模型出現(xiàn)過擬合，對其進行20次的置換檢驗，可知R2X總是大于Q2，說明建立的模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，結果較為可靠（見圖3）。

圖3 兩種刺薔薇葉片總代謝物OPLS-DA的置換檢驗Fig.3 Displacement test of OPLS-DA of two total metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

2.4 差異代謝物的篩選和分析

選擇OPLS-DA模型中變量投影重要性分析值（VIP）＞1 的代謝物數據，使用SPSS 25 對其進行t檢驗，篩選出P＜0.05 的數據，確定為2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物。對各項代謝物的差異倍數值（FC 值）進行以2 為底數的對數換算，以野生刺薔薇葉片為基準，log2FC＜0表示上調，反之則表示下調。

根據表2 可知，篩選出2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物共19 種，以野生刺薔薇葉片為基準，‘魯赫’刺薔薇葉片代謝物中糖類中的β-龍膽二糖、阿拉伯呋喃糖和麥芽糖，有機酸類中的2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸和硬脂酸，烷烴類中的3，8-二甲基-十一烷，其他類中的乙醇胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油表達為下調；有機酸中的4-氨基丁酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸和莽草酸，氨基酸中的L-丙氨酸和纈氨酸，其他類中的雙酚A 單甲醚表達為上調。對2 種刺薔薇葉片的差異代謝物相對含量數值矩陣進行歐式距離矩陣計算，以完全連鎖方法進行聚類分析（見圖4），大致上可將差異代謝物分成分為4 類：第1 類為4-羥基苯甲酸、雙酚A 單甲醚、4-氨基丁酸、綠原酸、L-丙氨酸和莽草酸；第2類為沒食子酸、乳酸、2，3，4-三羥基丁酸、阿拉伯呋喃糖、甘油和蘋果酸；第3類為硬脂酸、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷和麥芽糖；第4類為纈氨酸、乙醇胺、β-龍膽二糖和3，8-二甲基-十一烷。其中第1 類全部為有機酸（含氨基酸），第2類以有機酸（含纈氨酸）為主，第3 類以糖（苷）為主，第4類則成分較為復雜，各類代謝物均含有。

圖4 兩種刺薔薇葉片的差異代謝物的層次聚類分析熱圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of differential metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

表2 兩種刺薔薇葉片的差異代謝物的篩選結果Table 2 Screening results of differential metabolites in leaves of 2 R.acicularis

由以上結果可知，相較于‘魯赫’刺薔薇，野生刺薔薇葉片主要在糖類和糖苷類物質代謝表達上調，在2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸和硬脂酸4種有機酸代謝表達上調，在其他有機酸類物質和氨基酸代謝表達下調。野生刺薔薇葉片在糖（苷）類的相對含量上優(yōu)于‘魯赫’刺薔薇，而‘魯赫’刺薔薇的抗脅迫物質（有機酸、氨基酸）相對含量更高。

2.5 差異代謝通路分析

將19種差異代謝物英文名稱代入KEGG 官網查詢ID，將ID 序列代入MBRole 2.0 得出差異代謝通路名稱和組分數據，使用R 語言繪制富集氣泡圖，選擇impact 值（氣泡面積）較大和-log10（P-val?ue）（顏色鮮艷程度）較大的代謝通路，作為2 種刺薔薇葉片的主要差異代謝通路（見圖5）。由富集氣泡圖可得出二者主要的差異代謝通路有5條，分別是ABC 轉運蛋白通路、苯丙烷的生物合成途徑、苯甲酸的輔酶A 降解途徑、苯甲酸的羥基化降解途徑和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑。另有奎寧酸未被KEGG 收錄ID，將在討論中單獨列出。

圖5 兩種刺薔薇葉片的代謝通路富集氣泡圖Fig.5 Enrichment bubble diagram of metabolic pathway in leaves of two kinds of R.acicularis

由差異代謝通路分析可得，‘魯赫’刺薔薇和野生刺薔薇的葉片主要在ABC 轉運蛋白、苯丙烷的生物合成、苯甲酸的降解和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝這4個方面有顯著的代謝差異。

3 討論

為探究刺薔薇的野外條件下的野生種和人工栽培的人工選育栽培種（‘魯赫’刺薔薇）的葉片代謝差異，對野生和‘魯赫’刺薔薇的葉片進行的非靶向GC-MS 代謝組學分析共檢測和匹配出51 種代謝物，PCA 和OPLS-DA 模型可靠，其中利用OPLS-DA 模型共篩選出19種代謝物作為2 種刺薔薇葉片的代謝差異物。以野生刺薔薇作對照，‘魯赫’刺薔薇共有4種糖（苷）類、3，8-二甲基-十一烷、乙醇胺、甘油和少量有機酸表達下調，4種有機酸、2種氨基酸和雙酚A 單甲醚表達上調。糖類物質作為光合作用的最終產物，是植物體內主要的能量和碳骨架來源［23］。在野外條件下，野生刺薔薇葉片的糖類相對含量較高，其光合作用效率可能較‘魯赫’刺薔薇高，但由于二者變量不單一（取材地海拔氣候有一定差別），可在今后的研究中補充葉片凈光合速率對比試驗。部分氨基酸和有機酸是植物的次生代謝產物或重要前體［24-25］，本試驗中的‘魯赫’刺薔薇在人工栽培條件下，部分有機酸類（2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸、麥芽糖、硬脂酸、4-氨基丁酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、L-丙氨酸、奎寧酸、莽草酸、纈氨酸）代謝表達和野生刺薔薇出現(xiàn)差異，說明二者在有機酸類相關次生代謝方面因基因［26］和環(huán)境因子［27-28］出現(xiàn)表達差異。

2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝通路有5 條，主要表現(xiàn)在ABC 轉運蛋白、苯丙烷的生物合成、苯甲酸的降解和部分氨基酸的代謝這4 個方面。ABC 轉運蛋白是一大類跨膜蛋白，植物ABC 轉運蛋白含量高達上百種，與其復雜的代謝活動密切相關，在植物表面蠟質分泌、調節(jié)重金屬含量、次生代謝物運輸等方面發(fā)揮著極其重要的功能［29］。苯丙烷的生物合成途徑是大多數植物次生代謝物的主要來源之一［30］，對植物的生長發(fā)育及應答逆境脅迫起到重要作用［31］。苯甲酸是植物的自毒作用產物［32］，是植物因無益代謝物的過度積累產生的有害產物［33］，苯甲酸的積累會嚴重抑制植物的生長發(fā)育［34］。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與植物的生長發(fā)育、激素調節(jié)和抗脅迫反應密切相關［35］?？鼘幩崾嵌喾N天然芳香族化合物經莽草酸生物合成途徑的關鍵前體［36］，2種刺薔薇葉片在奎寧酸代謝上有顯著差異，但二者并未在整個莽草酸代謝途徑有明顯差異。ABC 轉運蛋白、苯丙烷的生物合成、3 種氨基酸的代謝和植物生長發(fā)育、生物素調節(jié)和環(huán)境應答有密切聯(lián)系。所有的通路均受基因的調控和環(huán)境的影響，并且互相之間也有錯綜復雜的聯(lián)系，如苯丙烷的合成影響氨基酸的合成，苯甲酸會抑制轉運蛋白和氨基酸的轉運等［33］。二者未在整體的代謝通路以及次生代謝上出現(xiàn)差異富集，說明雖然栽培條件不同，但遺傳物質接近的二者葉片的代謝通路并未有整體差異，僅限于前文提到過的5條差異代謝通路。

目前的代謝組學技術還無法做到對生物體進行精準、全面的檢測，本研究依靠GC-MS非靶向代謝組學技術僅能確定2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物與和代謝途徑，無法對其進行更深一步的定量和拓撲關系研究，但本研究的結果可為其基因序列、蛋白質種類和轉錄因子的選取縮小范圍，結合生物信息學對其進行更全面深入的研究，并對相關產業(yè)的發(fā)展提供依據。對于刺薔薇資源植物，在以后的研究中，可結合基因組、蛋白質組和轉錄組等對其進行生長發(fā)育、抗脅迫、觀賞、綠化、營養(yǎng)與藥用價值等方面的研究。