李登高 林 睿 穆青慧 周 娜 張焱如 白 薇

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特 010018）

類受體激酶（Receptor-like kinase，RLK）定位在細胞膜上，是植物體內普遍存在的一類蛋白激酶，能夠識別外界的各種信號和刺激，通過磷酸化作用將信號傳遞到胞內，在植物的生長發(fā)育及抗逆境過程中扮演著非常重要的作用［1］。RLK 被認為是植物中最大的基因家族，擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的基因組中分別包含610、1 100個RLK，占據編碼基因的2%［2］。典型的RLK 包含信號肽、可變的胞外結構域、跨膜結構域和胞內的激酶結構域［3］。RLKs的胞外結構域含有高度多樣化的蛋白質結構域，這一特點被用于RLK亞家族的分類［4］。

富含半胱氨酸的類受體激酶（cysteine-rich re?ceptor-like kinases，CRKs）是RLK 家族中的一個大的亞家族，具有典型的RLK 結構域，并且含有DUF26（Domain of Unknown Function 26；PF01657；stress-antifungal domain）功能未知結構域，由于其富含半胱氨酸motif 而命名［4］。CRKs 包含負責信號感知的細胞外結構域、單程跨膜結構域和負責信號轉導的保守的細胞內絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶結構域。大多數CRKs 在其細胞外結構域中擁有2 個DUF26 拷貝，DUF26 結構域在C-X8-C-X2-C 構型中包含3 個保守的半胱氨酸殘基［5］。預測每個DUF26結構域中的半胱氨酸殘基會形成2個半胱氨酸橋，它們可能的作用是作為胞質外氧化還原修飾的靶標［6］。

研究表明CRKs 參與調控光合作用、發(fā)育、氣孔開閉及生物和非生物脅迫等多種生物過程。CRKs 的多個家族成員在植物干旱和高鹽脅迫過程中發(fā)揮作用。擬南芥AtCRK2的過量表達能夠增強對鹽脅迫的耐受性［7］，在41 個擬南芥AtCRKs的T-DNA 插入突變體中發(fā)現有至少21 個突變體在120 mmol·L-1NaCl 的環(huán)境中發(fā)芽延遲［6］。小麥（Triticum aestivum）TaCRK41能夠被ABA 和鹽脅迫誘導下調，在滲透脅迫中參與依賴ABA 的種子萌發(fā)過程［8］。新的研究表明AtCRK41上調表達后抑制抗氧化酶的活性進一步誘導H2O2的積累，H2O2和ABA 信號通過激活MAPK3和MAPK6參與NaCl誘導的細胞死亡［9］。過量表達AtCRK5能夠提高擬南芥對干旱的耐受性［10］。此外，CRKs 還能夠響應氧化脅迫逆境的非生物脅迫誘導，在擬南芥中包括AtCRK6和AtCRK7的20 多 個AtCRKs可 能 參 與了氧化脅迫［11-12］。CRKs家族在植物抗病防衛(wèi)過程中發(fā)揮重要作用。Yadeta 等［13］通過分析細菌鞭毛蛋白flg22 誘導的蛋白組學信息發(fā)現有多個CRKs的豐度顯著增加；在擬南芥中過表達AtCRK28增強了對假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性；在煙草（Nicotiana tabacum）中瞬時表達AtCRK28后誘導了過敏反應的細胞程序性死亡，并且At?CRK28能夠和FLS2-BAK1形成免疫復合物。在擬南芥過表達AtCRK4、AtCRK5、AtCRK6、AtCRK13和AtCRK36都增強了對病原細菌的抗性［14-15］。At?CRK13表達的上調導致了過敏反應相關的細胞程序性死亡并通過引起水楊酸的積累誘導產生對病原 的 抗 性［16］。AtCRK4，AtCRK5，AtCRK19和At?CRK20的過表達也誘導了過敏反應的細胞程序性死亡［14］。AtCRK4、AtCRK6以及AtCRK36的過表達增強了受體模式觸發(fā)的免疫反應［15］。在其他植物中也有研究表明CRKs參與抗病防衛(wèi)反應。例如：大麥（Hordeum vulgare）HvCRK1被鑒定為抗白粉病的負調節(jié)劑［17］、棉（Gossypium hirsutum）中的CRK18賦予了對黃萎病的抗性［18］、小麥TaCRK2定位在細胞膜上，在抵抗小麥殼針孢葉枯?。⊿eptoria triticiblotch，STB）以及誘導HR 過敏反應發(fā)揮重要作用［19］。最新研究表明一個TaCRK家族成員賦予了小麥對殼針孢葉枯病的廣譜抗性［20］，TaCRK10 通過與TaH2A.1 相互作用激活小麥高溫育苗期對條銹?。⊿tripe rust）的抗性［21］，TaCRK3也參與了小麥對紋枯菌（Rhizoctonia cerealis）的抗性［22］。除了在抵抗生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮功能外，最新研究結果表明CRK也參與了植物的生長和發(fā)育過程。AtCRK28 通過微調作用參與了植物的生長和發(fā)育過程，AtCRK28 的功能缺失導致根的分支增多，而AtCRK28過表達品系具有相反的表型，主要表現為根生長緩慢和側根形成減少［23］。

近年來在多種植物中分別鑒定到了多個CRK家族成員，孫瑩等［24］在龍眼（Dimocarpus longan）中篩選出98 個CRK基因家族的成員［24］。張中起等［25］在陸地棉基因組中鑒定到70 個CRK基因，Zuo等［26］在蘋果（Malus pumila）中鑒定到24個CRK成員，劉河等［27］在梨（Pryusspp.）中鑒定到32 個CRK成員。在棉花、葡萄（Vitis vinifera）、水稻等多種作物中也都有CRKs家族成員的鑒定［28-29］。馬鈴薯（Solanum tuberosum）作為世界重要的主糧作物之一，關于馬鈴薯StCRK的研究僅見張衛(wèi)娜等［30］通過生信分析和試驗驗證相結合的研究結果表明馬鈴薯StCRKs啟動子具有響應多種激素和脅迫的順式調控元件，試驗證據表明StCRK4和StCRK8在干腐病菌（Fusarium sulphureum）和晚疫病菌（Phy?tophthora infestans）誘導后顯著增強，推測這2個基因在響應病原真菌過程起重要作用，目前在馬鈴薯中只鑒定出8 個StCRKs，因此關于馬鈴薯St?CRKs的研究還有待進一步完善。

本研究通過對馬鈴薯蛋白質組和基因組序列與已知的CRK 家族序列進行比對，分析典型保守的CRK 結構域，對潛在的馬鈴薯CRK家族基因特征進行分析鑒定，通過qRT-PCR 技術檢測這些基因的組織表達情況以及對水楊酸和低溫的響應情況，研究CRK基因家族在生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯雙單倍體測序品種DM1-3516 R44 由美國農業(yè)部農業(yè)研究院（Argriculture Research Ser?vice of United States Department of Agriculture，US?DA）提供，由本實驗室MS 培養(yǎng)基快繁保存，光照及培養(yǎng)溫度為16 h光照24 ℃/8 h黑暗20 ℃。組織特異性檢測樣本在溫室中盆栽種植，在開花期分別取根、莖、葉、花的組織樣本，液氮速凍并在-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ弥饕锛盎瘜W試劑同孫瑩的研究試劑［31］。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯StCRKs家族基因的分析鑒定

在http：//plants.ensembl.org/index.html 下載擬南芥蛋白序列，利用基因號提取AtCRKs 蛋白序列，在 數 據 庫http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/下載V6.1 版本馬鈴薯蛋白序列，基于擬南芥的AtCRKs 蛋白家族參考序列調取馬鈴薯中的潛在StCRKs 序列，在NCBI conserved domains data?base 數據庫進行Batch CD-search 比對，在結果中篩選符合StCRKs 結構域特征的序列進行進一步分析。

1.2.2 馬鈴薯StCRKs家族基因的特征分析

蛋白的理化性質在Expasy網站中預測（http：//www.expasy.org），利用Compute pI/Mw 工具計算蛋白的等電點和分子質量，利用ProtParam 工具對不穩(wěn)定系數、消光系數等理化性質進行計算。將St?CRKs基因家族在茄科數據庫（http：//potato.plantbi?ology.msu.edu/integrated_.shtml）中BLAST 比 對 定位到染色體上，進行基因組分布規(guī)律解析。利用MG2C 在線工具進行染色體定位及可視化分析。在數據庫http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/下載馬鈴薯General Feature Format Version 3（gff3）注釋文件，進行基因結構可視化。利用MEGA X 軟件用使用鄰接法（neighbour-joining，NJ）比對馬鈴薯StCRKs 家族蛋白的序列，在Jalview 軟件（版本號1.0）對蛋白結構域進行可視化分析。在基因組序列上截取StCRKs基因起始密碼子前2 000 bp 序列，使用在線工具plantcare 對各基因啟動子元件進行分析。通過MEGA X 軟件用鄰接法對擬南芥AtCRKs 和馬鈴薯StCRKs 家族序列構建系統進化樹Original Tree，用Figtree 軟件（版本號1.4.3）對系統進化樹進行可視化。

1.2.3 SCRKs基因組織特異性表達分析

在馬鈴薯盆栽苗開花期分別對根、莖、葉、花組織取樣，液氮速凍，用Trizol 法提取RNA，用DN?ase（RNase free）去除DNA 并反轉錄成cDNA，反轉錄方法按照Tian等［32］的方法進行。根據馬鈴薯St?CRKs的cDNA 序列設計上下游引物，以EF1α基因（GenBank：AB061263.1）為 內 參（ef1α-3：ATTG?GAAACGGATATGCTCCA & ef1α-4：TCCTTACCT?GAACGCCTGTCA），用qRT-PCR 方法分析馬鈴薯StCRKs基因在開花期不同組織的轉錄水平，qRTPCR 引物利用http：//www.biorun.com/tools 在線工具設計，引物序列見表1。qRT-PCR 采用TaKaRa TB GreenPremix ExTaq?Ⅱ試劑盒。反應體系：cDNA 1.0 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ5.0 μL，ddH2O；95 ℃10 min；95 ℃10 s，58 ℃30 min，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。組織特異性及所有的基因表達分析qRT-PCR試驗均在實時熒光定量PCR 儀（LightCycler480，美國）進行。

表1 18個StCRKs基因信息和引物Table 1 18 StCRKs gene information and primers

1.2.4 馬鈴薯StCRKs低溫和BTH誘導響應

數據分析是蛋白質組學技術最重要的步驟。利用生物信息學，運用特定的算法，根據蛋白質或蛋白質酶解物肽段的分子量與蛋白質數據庫進行比對，從而鑒定出樣品中的蛋白質種類。目前用于蛋白質組學鑒定的軟件有多種，較常用的有MaxQuant、X!Tadam和Mascot 等。

將培養(yǎng)32 d的馬鈴薯DM試管苗用0.67 mmol·L-1BTH 處理，分別在0、2、4、8 h 后取樣，提取RNA 反轉錄成cDNA。用qRT-PCR 方法分析馬鈴薯St?CRKs基因在水楊酸類似物處理后的轉錄響應。將培養(yǎng)32 d 的馬鈴薯DM 試管苗用4 ℃低溫處理，分別在0、2、4、8 h 后取樣，提取RNA 反轉錄成cD?NA。用qRT-PCR 方法分析馬鈴薯StCRKs基因在低溫處理后的轉錄響應，反轉錄及qRT-PCR 方法同上。

1.2.5 數據分析

試驗數據采用SPSS Statistics 26 及Microsoft Excel 2016 進行統計分析，采用Prism 8 進行圖表繪制，組織特異性分析采用單因素多因子多重比較，BTH 和4 ℃誘導處理數據采用t檢驗等差分析方法進行試驗組與對照組的顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StCRKs家族基因的分析鑒定

為分析鑒定馬鈴薯CRK 蛋白，利用擬南芥的CRKs 在NCBI conserved domains database 數 據 庫的Batch CD-search 比對，在結果中篩選符合St?CRKs結構域特征的序列。在2個馬鈴薯數據庫中通過比對分析共鑒定到26 個StCRKs基因，其中有8 個StCRKs張衛(wèi)娜等［30］已經在2020 年發(fā)表。因此我們將已經新鑒定的18 個StCRKs分別命名為St?CRK9～StCRK26，各基因名對應的序列號見表1。如 圖1 所 示18 個StCRKs均 有Stress-antifung 以 及STKc_IRAK 或PKc_like superfamily 結構域，除St?CRK12外，其余17 個StCRKs具有跨膜結構域。StCRK12、StCRK13、StCRK22根據數據庫注釋有1 個DUF26，StCRK14有1 個完整的DUF26 和突變1 個半胱氨酸殘基的DUF26，其余14 個StCRKs均具有2個DUF26。

圖1 StCRKs蛋白的結構域和功能模體A.StCRKs蛋白的多序列比對；B.StCRKs蛋白保守結構域模式圖；C.StCRKs蛋白的功能模體Fig.1 Structural domains and functional motifs of StCRKs proteins A.Multiple sequence alignment of StCRKs proteins；B.Conserved structural domain pattern map of StCRKs proteins；C.Functional modalities of St?CRKs proteins

2.2 馬鈴薯StCRKs蛋白家族的特征分析

StCRKs 蛋白的理化性質預測結果見表2，18個StCRKs 蛋白的氨基酸數目在462～723，等電點為5.88～8.93，13 個是堿性蛋白，5 個是弱酸性蛋白。分子質量在51.46～80.18 kDa。StCRK9 為疏水性蛋白，其余17 個StCRK 為親水性蛋白。St?CRK20、StCRK22、StCRK23、StCRK24、StCRK26 共5個蛋白為不穩(wěn)定蛋白，其余11個為穩(wěn)定蛋白。

表2 StCRKs蛋白家族理化信息Table 2 StCRKs family structure and protein physical and chemical information

將18 個StCRKs基因家族定位到染色體上，進行基因組分布規(guī)律解析。如圖2A 所示，新發(fā)現的18 個StCRKs基因分別定位在1、2、11 和12 號染色體上，并且在1、2 和11 號染色體上均顯示出集中的串聯重復排列。對StCRKs基因結構分析發(fā)現，18 個StCRKs基因均含有外顯子，數目在6～11，除了StCRK21基因包含11 個外顯子之外，其他St?CRKs均由6～8個外顯子組成（見圖2B）。

圖2 StCRKs基因的染色體定位以及基因結構A.StCRKs基因家族的染色體定位；B.StCRKs基因家族的基因結構Fig.2 Chromosomal localization and gene structure of StCRKs gene A.Chromosomal localization of the StCRKs gene family；B.Gene structure of the StCRKs gene family

對18 個StCRKs基因的啟動子序列分析發(fā)現有多種順式調控元件（見圖3），其中包括5 種植物激素：赤霉素響應元件、茉莉酸響應元件、脫落酸響應元件、水楊酸響應元件和生長素響應元件；以及干旱、低溫、節(jié)律、損傷誘導、防衛(wèi)、脅迫響應和種子特異性元件。預示著這些StCRKs參與調控了馬鈴薯的生長發(fā)育、晝夜節(jié)律、生物及非生物脅迫等過程。

圖3 StCRKs基因的啟動子調控元件Fig.3 Promoter elements of StCRKs gene

2.3 馬鈴薯StCRKs家族的系統進化樹分析

圖4 StCRKs的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of StCRKs

2.4 SCRKs基因組織特異性表達分析

利用qRT-PCR 方法對馬鈴薯盆栽苗開花期的根、莖、葉和花中的18 個StCRKs進行組織特異性表達分析（見圖5），StCRK9、StCRK14、StCRK15、St?CRK16、StCRK20、StCRK22和StCRK23在根、莖、葉和花中均有表達，而StCRK10、StCRK12、StCRK18、StCRK21和StCRK25共5 個基因在開花期的各組織中都沒有檢測到表達或表達量極低。

圖5 StCRKs基因的組織特異性表達A.根；B.莖；C.葉；D.花Fig.5 Tissue-specific expression of StCRKs gene A.Root；B.Stem；C.Leave；D.Flower

2.5 馬鈴薯StCRKs對低溫的誘導響應

用4 ℃低溫對馬鈴薯試管苗進行低溫脅迫，利用qRT-PCR 方法對StCRKs基因家族18 個成員進行轉錄水平研究，結果如圖6A 所示，沒有檢測到StCRK12、StCRK18和StCRK21的表達。StCRK14的表達沒有出現顯著差異，StCRK15基因在4 ℃低溫脅迫后表達上調，4 h 開始出現快速下調，下調近10倍左右，其余13個基因均在4 ℃低溫脅迫4 h時開始出現顯著上調，其中StCRK16的上調倍數最大，在8 h 時上調了近65 倍，StCRK10上調的速度最快，在4 h時上調了近20倍，但在8 h時和其他上調的StCRKs一樣均在近30倍左右。

圖6 StCRKs基因對低溫和BTH誘導的轉錄響應A.StCRKs基因對低溫誘導的轉錄響應；B.StCRKs基因對BTH 誘導的轉錄響應Fig.6 Transcriptional responses of StCRKs genes to low temperature and BTH A.Transcriptional responses of StCRKs genes to low temperature；B.Transcriptional responses of StCRKs genes to BTH

2.6 馬鈴薯StCRKs對BTH的誘導響應

用植物激素水楊酸類似物BTH 處理馬鈴薯試管苗，利用qRT-PCR 方法對StCRKs基因家族18 個成員進行轉錄水平研究，結果如圖6B 所示，St?CRK10、StCRK12、StCRK18、StCRK21和StCRK23的表 達 量 沒 有 被 檢 測 到；StCRK9、StCRK11、St?CRK13、StCRK14、StCRK15、StCRK16、StCRK19、St?CRK20、StCRK22和StCRK26共10 個基 因經BTH誘導后均出現了表達上調，其中StCRK11的上調倍數最大，在8h 時上調了近17 倍，其次是St?CRK20，在脅迫2 h 后上調了近8 倍，StCRK22在誘導2 h后上調了近4倍。

3 討論

利用已知的擬南芥AtCRKs 蛋白序列與馬鈴薯數據庫比對，共鑒定到26個StCRKs，其中有8個（StCRK1～StCRK8）張衛(wèi)娜等［30］已經鑒定發(fā)表，這8個StCRKs 分布在2、3 和5 號染色體上，并且存在2個串聯重復基因簇。本研究中發(fā)現的18 個St?CRKs分布在1、2、11和12號染色體上，有3個串聯重復基因簇，其中1號染色體上有9個StCRKs串聯重復在一起，這種高度相似的串聯重復基因簇在擬南芥等其他物種中也較為常見［33］。通過蛋白保守結構域分析顯示StCRK14有1 個完整的DUF26和突變1 個半胱氨酸殘基的DUF26，并且StCRK14是在1 號染色體上的串聯重復基因，通過與St?CRK15的核苷酸的比對過程中發(fā)現有99%的覆蓋度“Query Cover”，有90.17%的一致性“Per.Ident”，StCRK14含突變1個半胱氨酸殘基的DUF26，推測是由基因串聯復制事件演化而來，這種現象在植物中較為常見［34］。18 個StCRKs基因的啟動子序列分布著5 種植物激素、種子特異性、干旱、低溫、節(jié)律、傷誘導以及防衛(wèi)和脅迫響應等調控元件。這些響應元件在18 個StCRKs中既有相同的順式調控元件，又有特有的調控元件，例如有13 個St?CRKs 的啟動子有赤霉素響應元件，而種子特異性調控元件和傷誘導響應元件都只在1 個基因的啟動子中發(fā)現。這種順式作用元件在CRK家族不同成員間的差異交叉分布也存在其他植物中［27］。這表明StCRKs的生物學功能既有一定的冗余性又有其各自獨特的功能，不同的StCRKs之間通過冗余/獨有以及拮抗/協同的方式實現功能調控網絡［6］。

StCRKs家族中不同基因的表達部位不同，有9個StCRKs在根、莖、葉、花4 個不同組織中均能檢測到表達，而有3 個StCRKs未能在開花期的任何組織中檢測到表達，這可能與基因表達具有時空特異性相關，低的表達豐度和StCRKs成員間的高度同源性和家族成員的數量都可能影響到對St?CRKs表達的準確檢測，這種差異表達模式在其他植物中也較為常見，如陸地棉GhCRKs［25］和蘋果MdCRKs［26］都顯示出不同的組織特異性表達模式。

鹽、干旱、冷、熱脅迫以及病原菌都可以導致植物CRK基因家族部分成員表達水平的改變［25］。在低溫信號響應中，StCRK12、StCRK18、StCRK21缺乏低溫脅迫響應啟動子元件，并沒有在低溫脅迫中響應表達。然而是否有相應啟動子元件并不能完全作為判定響應誘導的依據，如StCRK11缺乏低溫響應元件，但能夠響應低溫脅迫信號，可能的原因是StCRK11含有脫落酸信號響應信號元件。脫落酸信號通路在植物抗低溫等非生物脅迫反應的過程中發(fā)揮重要作用［35-36］，這樣的信號交叉網絡為植物應對逆境提供了非常有效的策略。目前關于CRK 調控低溫脅迫的研究還未見報道，但是 本 研 究 中StCRK10、StCRK13、StCRK16、St?CRK22、StCRK23、StCRK24基因的啟動子上具有低溫響應元件，并且有14 個StCRKs受低溫不同程度的誘導表達，故CRK 很有可能也參與了植物對低溫的響應，后續(xù)還需深入研究提供進一步的證據。

綜上所述，結合張衛(wèi)娜等［30］的發(fā)現，目前在馬鈴薯中共發(fā)現26個StCRKs，而在擬南芥中發(fā)現At?CRKs家族有超出40 個成員，在陸地棉中有70 個成員［25］，在龍眼中甚至有98 個CRK基因家族成員［24］。張衛(wèi)娜等［30］報道的StCRK4和StCRK7在本研究使用的數據庫v6.1 中暫未發(fā)現，但在數據庫v3.4 中可以比對到。因此，隨著馬鈴薯數據庫的更新和注釋，可能還有新的StCRKs 等待進一步挖掘。CRKs 作為一類重要的類受體激酶其在生物脅迫、非生物脅迫以及在生長發(fā)育過程中的作用還有待進一步鑒定和在育種方面的開發(fā)。