劉 琨，劉軍麟，袁丞達(dá)，陸春婉，殷 梅

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚性病科，海南 ?？?570311；2. 杭州市中醫(yī)院皮膚性病科，浙江 杭州 310005；3. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢科，海南 海口 570311）

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，且受環(huán)境和遺傳因素共同影響。既往研究表明維生素D及其衍生物可通過多種途徑對(duì)銀屑病皮損的治療產(chǎn)生作用。此外，銀屑病患者的血清1，25（OH）2D3水平比對(duì)照組顯著降低，且在銀屑病關(guān)節(jié)炎患者中，血清1，25（OH）2D3水平與疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)［1-3］。血清25（OH）D3水平通常是評(píng)價(jià)人體內(nèi)維生素D3含量高低的指標(biāo)［4］，而血清25（OH）D3水平取決于維生素D 結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein，VDBP）的濃度以及維生素D3與VDBP 親和力。VDBP 由GC 基因編碼，該基因位于染色體4q13.3，長(zhǎng)約64 kb，包含15 個(gè)外顯子。雖有報(bào)道GC 基因及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與癌癥、肥胖、代謝綜合征或其他疾病具有相關(guān)性［5-8］，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有明確報(bào)道表明GC 基因與銀屑病有明顯相關(guān)性。

基于上述情況，本研究在相對(duì)隔離的海南漢族尋常性銀屑病及正常人群中采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)GC 基因及其上、下游各2 kb 區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序，獲取該區(qū)域內(nèi)的所有SNP 并進(jìn)行基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析，以期全面、深入揭示GC 基因與銀屑病的關(guān)系。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2018 年3 月～2020 年2 月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診及病房101 例海南籍漢族尋常性銀屑病患者，所有患者符合尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，男、女性患者分別為65 例、36 例，年齡18～82 歲，平均（45.31±14.05）歲。另從海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢中心收集79 例海南籍漢族健康人為正常對(duì)照，男、女性分別為47 例、32 例，年齡21～78 歲，平均（41.76±12.86）歲。將自祖父輩起為海南籍且無(wú)明確的島外遷入史作為海南籍的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。兩組人群間及人群內(nèi)均無(wú)親緣關(guān)系，且對(duì)照組人群均無(wú)銀屑病家族史。年齡、性別在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為t=1.745，P=0.083；χ2=0.446，P=0.504）。

本研究已通過海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，研究對(duì)象均填寫基本情況表并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 靶基因捕獲測(cè)序 對(duì)兩組樣本的GC 基因及其上、下游各2 kb 區(qū)域進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，步驟如下：（1）樣 本DNA 質(zhì) 量 檢 測(cè)；（2）DNA 片 段 化；（3）末端修復(fù)；（4）3'端加上單個(gè)腺苷酸“A”；（5）連接測(cè)序接頭；（6）文庫(kù)片段篩選；（7）擴(kuò)增文庫(kù)；（8）目的區(qū)域芯片雜交；（9）雜交文庫(kù)清洗及純化；（10）PCR 擴(kuò)增DNA 文庫(kù)；（11）文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)；（12）上機(jī)測(cè)序。該檢測(cè)由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)分析 利用Hardy-Weinberg 檢驗(yàn)在對(duì)照組中對(duì)所有SNP 進(jìn)行檢驗(yàn)。入選SNP 標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）對(duì) 照 組Hardy-Weinberg 檢 驗(yàn) 的P值 大 于0.05；（2）最小等位基因頻率＞0.01。

采用PLINK 2.00 軟件在共顯性模型（以正常純合為參照）、顯性模型（低頻率的等位基因?yàn)轱@性）、隱性模型（低頻率的等位基因?yàn)殡[性）及等位基因模型等4 種遺傳模式下進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。使用Bonferroni 法和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率法（false discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)行校正。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用SIFT Score 軟件預(yù)測(cè)氨基酸改變是否影響基因功能，如SIFT 值＜0.05則表明該變異可嚴(yán)重影響蛋白功能。采用SIFT Score Pred 軟件預(yù)測(cè)其致病性，D 為有害，T 為良性。

2 結(jié)果

本研究通過對(duì)79 例健康對(duì)照和101 例銀屑病病例中的GC 基因及其上、下游各2 kb 進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，共測(cè)得94 個(gè)SNP。按上述標(biāo)準(zhǔn)篩選出93 個(gè)SNP 進(jìn)行基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析。

2.1 基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)篩選出的93 個(gè)SNP 在4 種遺傳模式下進(jìn)行 關(guān) 聯(lián) 分 析（圖1～4），有21 個(gè)SNP 在 至 少1 種遺傳模式下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＜0.05）。這些SNP 的OR值 為0.289～2.295，95%CI為0.048～12.670（表1）。 這21 個(gè)SNP 中，16 個(gè)（rs1565 572、rs16845007、rs16846912、rs222009、rs222010、rs222035、 rs222040、 rs2276460、 rs2282678、rs3755967、 rs705120、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653、rs844806）位 于 內(nèi) 含 子區(qū)，3 個(gè)（rs16847118、rs72649506 和rs72649508）位于非翻譯區(qū)域（untranslational region，UTR），2個(gè)（rs4588 和rs4752）位于外顯子區(qū)。

圖1 共顯性模型的卡方檢驗(yàn)曼哈頓圖Fig 1 Manhattan plot of Chi square test based on codominant mode

圖2 顯性遺傳模型的卡方檢驗(yàn)曼哈頓圖Fig 2 Manhattan plot of Chi square test based on dominant mode

圖3 隱性遺傳模型的卡方檢驗(yàn)曼哈頓圖Fig 3 Manhattan plot of Chi square test based on recessive mode

圖4 等位基因模型的卡方檢驗(yàn)曼哈頓圖Fig 4 Manhattan plot of Chi square test based on allelic mode

表1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的21 個(gè)SNP 的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（卡方檢驗(yàn)）Tab 1 Association analyses results of 21 SNPs with statistical differences（Chi square test）

續(xù)表

2.2 生物信息學(xué)分析

位于外顯子11 的rs4588G＞T 為非同義突變，可導(dǎo)致蘇氨酸轉(zhuǎn)換為賴氨酸（Thr→Lys），SIFT Score 為0.481、SIFT Score Pred 為T，而位于外顯子8 的rs4752A＞G 未導(dǎo)致氨基酸的改變，為同義突變。

3 討論

GC 基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、修飾、翻譯后合成分布在3 個(gè)結(jié)構(gòu)域上，由458 個(gè)氨基酸組成的VDBP。不同領(lǐng)域的學(xué)者均認(rèn)為GC 基因與體內(nèi)維生素D 水平及活性顯著相關(guān)，是合成活性維生素D 并發(fā)揮其生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因。本研究旨在SNP 的層面探索GC基因與尋常性銀屑病的關(guān)系。

SNP 可位于基因的任何位置，其中位于外顯子區(qū)域的SNP 稱為編碼SNP，編碼SNP 發(fā)生變異存在兩種形式。一是同義突變，即堿基發(fā)生變異，但翻譯的氨基酸無(wú)變化。本研究中發(fā)現(xiàn)的rs4752 雖然出現(xiàn)了A→G 變異，但其翻譯的仍為半胱氨酸（Cys），并不引起基因功能改變。雖然生物信息學(xué)分析提示該位點(diǎn)翻譯的氨基酸未發(fā)生改變，但在本研究中4 種不同遺傳模式的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中提示其在共顯性、顯性及等位基因3 種遺傳模式下均與銀屑病易感性相關(guān)（分別為P=0.012、P=0.009、P=0.022）。這可能和同義突變雖然不能引起氨基酸的變化，但可以影響信使RNA 的剪切、穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)相關(guān)［10］，這些變化均可對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展，亦可作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)。同義突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的另一種可能：雖然部分同義突變并未影響RNA 剪切，也不影響信使RNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是卻改變了合成蛋白的折疊結(jié)構(gòu)，從而影響了基因功能，據(jù)推測(cè)這可能是變異后的密碼子是罕見密碼子的結(jié)果［11］。另一種是非同義突變，即SNP 導(dǎo)致了氨基酸改變，從而很可能導(dǎo)致基因功能改變。本研究發(fā)現(xiàn)的rs4588G＞T 在共顯性模型中與銀屑病易感性相關(guān)（P=0.028），且生物信息學(xué)分析提示rs4588G＞T 會(huì)將蘇氨酸錯(cuò)譯為賴氨酸。本研究的前期工作提示該SNP 的變異會(huì)導(dǎo)致VDBP 轉(zhuǎn)變?yōu)镚C2 型，且GC2 與25（OH）D3的親和力下降［12］。這提示在生物學(xué)功能上，GC 基因的不同亞型可能會(huì)影響維生素D 相關(guān)信號(hào)在組織或細(xì)胞水平上的傳遞。本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果提 示 該SNP 的SIFT Score 為0.481，SIFT Score Pred 為T，是良性突變。在文獻(xiàn)檢索中我們雖未發(fā)現(xiàn)rs4588 和銀屑病關(guān)聯(lián)，但有研究結(jié)果提示除了與人體內(nèi)維生素D 水平顯著相關(guān)外，其與結(jié)直腸癌的發(fā)?。∣R=2.34，95%CI=1.25～4.37）及2 型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=8.9，95%CI=1.89～41.99，P＜0.001）均 具 有 相 關(guān) 性［5，6］。此 外，也 有 研 究 表 明rs4588 僅與血清維生素D 水平基礎(chǔ)值相關(guān)（P=7.86×10-7），而與補(bǔ)充維生素D 后的血清維生素D水平變化無(wú)關(guān)（P=0.15）［13］。

本次研究尚發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子區(qū)的16 個(gè)易感SNP，其中11 個(gè)SNP 未見與疾病具有相關(guān)性的報(bào)道（rs1565572、rs16845007、rs222009、rs222010、rs2276460、 rs2282678、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653 及rs844806），其余5 個(gè)SNP（rs222040、 rs16846912、 rs222035、 rs3755967、rs705120）與其他疾病或血清25（OH）D3水平存在相關(guān)性。

一項(xiàng)來自挪威的578 對(duì)新生兒母子（女）參與的研究表明胎兒的rs222040 是新生兒臍帶血中25（OH）D3水平相關(guān)性最強(qiáng)的預(yù)測(cè)因子（P＜0.001）。該研究進(jìn)一步證實(shí)除了肝臟外，胎盤中也可表達(dá)GC 基因，但母體和胎兒中的VDBP 是否參與胎盤維生素D 的轉(zhuǎn)運(yùn)尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證［14］。在有2 207名高加索婦女參與的有關(guān)血清25（OH）D3與維生素D 代謝通路基因的相關(guān)研究中也表明rs222040 與血清25（OH）D3基礎(chǔ)值高度相關(guān)（P=1.59×10-4）［13］。

來自上海的3 108 人參與的研究提示，單倍型rs842999/rs705120/rs222040/rs4588/rs7041/rs104 88854 GAGTAC 是導(dǎo)致25（OH）D3水平降低的風(fēng)險(xiǎn)因素（P=2.0×10-5），而低水平的25（OH）D3也與VDBP 水平降低顯著相關(guān)。據(jù)此，研究者推測(cè)GC基因的變異導(dǎo)致VDBP 水平降低進(jìn)而引起血清25（OH）D3水平降低，但他們認(rèn)為這一結(jié)果由該單倍型中內(nèi)含子區(qū)域的SNP（包括rs222040）導(dǎo)致的可能性不大，而非同義突變的rs4588 可能是其潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)［15］。此外，一項(xiàng)關(guān)于家族性哮喘及維生素D 代謝信號(hào)通路的相關(guān)研究表明，rs222040 與血清總IgE 水平升高相關(guān)而與維生素D 水平不相關(guān)（PIgE=0.016，P25（OH）D3=0.382）［7］。這 提 示 本 研 究 中發(fā)現(xiàn)的部分變異也可能并不直接對(duì)尋常性銀屑病發(fā)病產(chǎn)生影響，而只是一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，它和真正的尋常性銀屑病的易感位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡。

2010 年1 篇 載 于Lancet 上 的 文 獻(xiàn) 提 示，rs3 755967 與體內(nèi)低水平的25（OH）D3水平顯著相關(guān)（P=2.42×10-75）［16］。此后多名學(xué)者對(duì)rs3755967 進(jìn)行了進(jìn)一步研究。其中一項(xiàng)浙江舟山2 658 名孕婦參與的GC 基因多態(tài)性與孕婦體內(nèi)25（OH）D3水平及補(bǔ)充維生素D 后25（OH）D3水平變化的關(guān)聯(lián)研究表明［17］，rs3755967 在整個(gè)妊娠周期 中均與 較低的25（OH）D3水平相關(guān)（P≤0.0001），且在孕早期補(bǔ)充維生素D 后，不同的基因型（CT/TT）與體內(nèi)25（OH）D3水平上升差異明顯相關(guān)（P值均＜0.0001）。該研究還發(fā)現(xiàn)rs3755967 和rs7041 呈高度LD（r2＞0.96）?；谠撽P(guān)聯(lián)分析結(jié)果，研究者認(rèn)為是rs4588和rs7041 這兩種非同義突變合成的不同亞型的VDBP 對(duì)維生素D 親和力的差異導(dǎo)致了妊娠周期中25（OH）D3水平不同及補(bǔ)充維生素D 后體內(nèi)25（OH）D3上升的差異變化，而非rs375596 對(duì)血清游離25（OH）D3水平有直接影響。

一項(xiàng)美國(guó)團(tuán)隊(duì)利用上海乳腺癌研究中心Ⅰ期及Ⅱ期數(shù)據(jù)的GWAS 研究表明rs3755967 與中國(guó)女性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性［18］，而一項(xiàng)來自國(guó)內(nèi)關(guān)于中國(guó)女性乳腺癌的分層研究則提示，rs3755967 的CT 基因型與乳腺癌低風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（OR=0.77，95%CI=0.62～0.96，P=0.021）。結(jié)合既往的流行病學(xué)調(diào)查，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為GC 基因通過影響體內(nèi)活性25（OH）D3水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，在乳腺細(xì)胞中，低水平的25（OH）D3可能會(huì)削弱酶的活性和減少1，25（OH）2D3的生成來調(diào)節(jié)這一作用。此外，該研究尚發(fā)現(xiàn)rs17467825、rs2298850、rs3755967 和rs2282679 高度連鎖不平衡（r2=1.0、0.9、1.0），結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，他們認(rèn)為rs2282679 與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而rs3355967 位于內(nèi)含子區(qū)域，可能參與基因表達(dá)調(diào)控或影響氨基酸修飾，確切原因需要進(jìn)一步探索［8］。另有研究顯示，VDBP 還可能通過非維生素D 信號(hào)通路直接參與包括趨化作用和巨噬細(xì)胞活化在內(nèi)的抗腫瘤過程。該研究認(rèn)為VDBP 參與激活巨噬細(xì)胞分子，并通過葡萄糖苷酶去糖基化形成VDBP-巨噬細(xì)胞激活因子，增強(qiáng)促凋亡酶的活性，最終通過JAK1/2 和p38 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展［19］。

一項(xiàng)有79 366 名參與者的國(guó)際研究證實(shí)，歐洲和北美人群中rs3755967 與血清25（OH）D3水平降低顯著相關(guān)（P=4.7×10-343）［20］，這一結(jié)論與德國(guó)一項(xiàng)8 417 名老人參與的研究結(jié)果相似［21］。而另一項(xiàng)相關(guān)研究提示rs3755967 與阿拉伯人及南亞人的血清25（OH）D3低水平顯著相關(guān)，與東南亞人的血清25（OH）D3水平不相關(guān)［22］。這提示rs3355967 可能在不同種族間的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同，亦有可能由于被檢測(cè)人群的生活環(huán)境不同，導(dǎo)致結(jié)果有所差異。

此外，rs222035、rs222040 及rs705120 被證實(shí)分別與血清游離25（OH）D3水平、家族性哮喘及血清25（OH）D3基 線 水 平 存 在 相 關(guān) 性，且rs7041、rs222035 和 rs842999 高 度 連 鎖 不 平 衡（r2＞0.92）［7，13，23，24］。

本研究尚發(fā)現(xiàn)3 個(gè)位于UTR 的SNP（rs1684 7118、rs72649506、rs72649508），經(jīng)檢索，均未發(fā)現(xiàn)與銀屑病相關(guān)的報(bào)道，尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究揭示，在海南籍漢族人群中，有21個(gè)與尋常性銀屑病有關(guān)的易感SNP，位于GC 基因的內(nèi)含子、外顯子及UTR，其中外顯子上的SNP 可導(dǎo)致蛋白改變，且有較大可能影響基因功能。這表明GC 基因與尋常性銀屑病的易感性存在關(guān)聯(lián)，但因本研究樣本量較小，尚待在大樣本量和/或其他人群中進(jìn)行更大規(guī)模的探索，并進(jìn)而通過功能學(xué)研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉琨：并列第一作者，負(fù)責(zé)病例標(biāo)本收集、實(shí)驗(yàn)操作及論文初稿寫作等；劉軍麟：并列第一作者，負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、文章撰寫指導(dǎo)及修改工作；袁丞達(dá)：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理，文章修改；陸春婉：并列通訊作者，負(fù)責(zé)病例和對(duì)照標(biāo)本收集、實(shí)驗(yàn)操作；殷梅：通訊作者，對(duì)照樣本收集、文獻(xiàn)檢索及文章內(nèi)容審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。