俞 鵬，楊哲君，石瑞潔，孫偉新，3，陳曉虎，沈 樂

（1. 江蘇省中醫(yī)院心血管科，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鹽城 224001）

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）以心肌急性缺血、缺氧導(dǎo)致心肌損傷甚至壞死為特征，具有高發(fā)病率、高死亡率的流行病學(xué)特點，臨床根據(jù)不同表現(xiàn)可分為不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）、急性非ST 段抬高性心肌梗死（acute non - ST elevation myocardial infarction，NSTEMI）和急性ST 段抬高性心肌梗死（acute ST elevation myocardial infarction，STEMI）三類，后二者統(tǒng)稱為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），程度更為嚴(yán)重［1，2］。ACS 的發(fā)生與動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂密切相關(guān)，其進展隱匿，起病急驟，給社會造成繁重負(fù)擔(dān)。近年來，隨著酶學(xué)的發(fā)展，心肌壞死標(biāo)志物，尤其是肌鈣蛋白Ⅰ在ACS 的診斷和危險分層中逐漸成為不可或缺的一環(huán)，由于其往往在發(fā)病3～4 h 后方有變化，早期評估價值有限，一定程度上影響了預(yù)后與轉(zhuǎn)歸。因此，尋找新的特異性生物標(biāo)志物對于ACS 的早期識別和干預(yù)刻不容緩。

代謝組學(xué)起源于20 世紀(jì)90 年代，多用于量化和表征小分子代謝物，如今已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、植物學(xué)等領(lǐng)域［3］，其技術(shù)方法主要包括核磁共振和質(zhì)譜串聯(lián)。相較于核磁共振，質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)靈敏度更高，且覆蓋面廣泛［4］。非靶向代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的一種以同時定量分析大規(guī)模數(shù)據(jù)的優(yōu)勢而為人熟知，多年來在心血管系統(tǒng)的病理、生理機制研究方面取得了顯著成果［5］。研究表明，ACS 雖然內(nèi)表型相似，但個體生物學(xué)差異較大，機制不明，為非靶向代謝組學(xué)的應(yīng)用提供了契機［6］。過去關(guān)于ACS的代謝組學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量潛在的生物標(biāo)志物，如丙氨酸、纈氨酸、同型半胱氨酸等，但大多研究集中與健康受試者比較，未曾將ACS 細分為UA 及AMI 進行研究。本研究以UA 和AMI患者為研究主體，運用LC-MS 技術(shù)分析代謝物，并完善KEGG 富集通路，以期更好地理解二者之間的代謝差異及本質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 病例來源

回顧性選取2019 年11 月～2021 年10 月入住江蘇省中醫(yī)院心血管科、且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的ACS 患者80 例，其中UA 患者33 例，AMI 患者47 例。本研究已通過江蘇省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。倫理批號：2018NL-105-03。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《2020 ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation》［7］、《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南（2016）》［8］及《急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南（2019）》［9］制定。

（1）UA：①靜息性心絞痛：持續(xù)時間＞20 min；②新發(fā)心絞痛：自發(fā)或勞力性發(fā)作；③惡化性心絞痛：既往有相關(guān)病史，近30 d 內(nèi)癥狀加重；或心梗后30 d 內(nèi)出現(xiàn)心絞痛。含服硝酸甘油有效；發(fā)作時12導(dǎo)聯(lián)心電圖可出現(xiàn)一過性ST 段缺血性改變，癥狀緩解后改善；血清肌鈣蛋白（cTn）陰性。

（2）AMI：包 括NSTEMI 和STEMI。NSTEMI：癥狀較UA 更嚴(yán)重，可表現(xiàn)為胸骨后壓榨性疼痛；常向左上臂、頸部或下頜放射，可為間歇性或持續(xù)性；12 導(dǎo)聯(lián)心電圖可出現(xiàn)2 個或更多的相鄰導(dǎo)聯(lián)ST 段下移≥0.1 mV；cTn 增高和/或回落，且至少1次高于正常值上限（參考值上限值的99 百分位值）。STEMI：胸骨后或心前區(qū)劇烈的壓榨性疼痛，可向左上臂、下頜、頸部、肩背部放射；常伴有惡心、嘔吐、大汗和呼吸困難，含服硝酸甘油不能完全緩解；12 導(dǎo)聯(lián)心電圖可見ST 段弓背向上型抬高，伴或不伴病理性Q 波；cTn 增高和/或回落，且至少1 次高于正常值上限（參考值上限值的99 百分位值）。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）年齡30～70 歲，性別不限；（2）符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及上述中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；（3）自愿參與研究，并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）存在重要臟器功能損害者；（2）有嚴(yán)重消化道出血病史和/或顱內(nèi)出血病史者；（3）孕婦或哺乳期婦女；（4）目前參與其他臨床試驗者。

1.5 臨床數(shù)據(jù)采集

（1）收集入組患者的一般信息，包括性別、年齡、既往史。（2）空腹8 h 后采血，取樣用于血常規(guī)檢測，包括白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）、血紅蛋白（Hb）、中性粒細胞百分比（N%）；血生化指標(biāo)：包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、葡萄糖（Glu）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）；cTnⅠ；代謝組學(xué)相關(guān)檢測。（3）完善超聲心動圖，記錄左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.6 代謝組學(xué)分析

1.6.1 儀器與試劑 Triple TOF 5600/6600 質(zhì)譜儀；Agilent 1290 Infinity LC 超高液相色譜儀；低溫高速離心機；色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column；Waters，ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm column；乙腈；乙酸銨。

1.6.2 樣本采集與制備 采集肘靜脈血樣本，1 000 r/min，在4 ℃溫度下進行10 min 離心，取上清血漿，在-80 ℃下保存。排除部分溶血樣本后，取出冷凍樣本，在4 ℃溫度下緩慢溶解。后分別取100 μL 樣本，加入400 μL 預(yù)冷的甲醇乙腈溶液，渦旋時間為60 s，而后在-20℃環(huán)境下放置1 h，以14 000 RCF在4 ℃溫度下離心20 min，取上清液進行冷凍干燥，保存于-80℃環(huán)境中。

1.6.3 色譜和質(zhì)譜分析 色譜條件：樣品采用Agilent 1290 Infinity LC 超高液相色譜系統(tǒng)HILIC 色譜柱進行分離。流動相：A 為含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水的水溶液，B 為乙腈。流動相的流速為每分鐘0.3 mL，柱溫為25 ℃。梯度洗脫程序為：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，65% B；7～8 min，40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，95% B；9.1～12 min，95% B。

質(zhì)譜條件：分別采用電噴霧離子源正、負(fù)離子模式進行檢測。樣本檢測完畢后，采用AB Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀采集一級和二級譜圖。HILIC 色譜分離后的ESI 條件：Gas 1：60，Gas 2：60，Curtain gas：30，source temperature：600 ℃，IonSapary voltage：±5 500 V；TOF MS scanm/zrange：60～1 000 Da，product ion scanm/zrange：25～1000 Da，TOF MS scan accumulation time：0.20 s/spectra，product ion scan accumulation time：0.05 s/spectra；二級質(zhì)譜采用information dependent acquisition 獲得，并采用high sensitivity 模 式。Declustering potential：±60 V，collision energy：（35±15）eV，IDA 設(shè) 置 如 下：Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：6。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling 預(yù)處理后，進行多變量和單變量統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

本研究最終納入患者80 例，其中UA 患者33例，AMI 患者47 例。

2.1 一般情況

比較UA 組與AMI 組的性別、高血壓史、糖尿病史、房顫史：經(jīng)卡方檢驗，兩組性別（P=0.438）、高血壓史（P=0.238）、糖尿病史（P=0.408）、房顫史（P=0.362）無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

比較UA 組與AMI 組的年齡、血常規(guī)（WBC、RBC、PLT、Hb、N%）、血生化（ALT、AST、Glu、TC、TG、LDL-C、HDL-C）、cTnⅠ、LVIDd、LVIDs、EF：經(jīng)t檢 驗，兩 組 年 齡（P=0.571）、RBC（P=0.642）、PLT（P=0.691）、Hb（P=0.642）、Glu（P=0.509）、TG（P=0.694）、HDL-C（P=0.794）、LVIDd（P=0.447）無顯著差異。而WBC（P=0.032）、N%（P=0.037）、ALT（P=0.001）、AST（P=0.002）、TC（P=0.007）、LDL-C（P=0.004）、cTn Ⅰ（P=0.016）、LVIDs（P=0.020）、EF（P=0.025）存 在 差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 UA 組與AMI 組一般情況比較Tab 1 Comparison of general condition between UA group and AMI group

2.2 PLS-DA

建立PLS-DA 模型，參數(shù)（R2Y，Q2）如表2 所示。從圖1（A）、（B）的PLS-DA 得分圖可見，UA 組與AMI 組在正、負(fù)離子模式均具有一定的區(qū)分度，提示兩組血漿樣本存在代謝差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 PLS-DA 模型參數(shù)Tab 2 PLS-DA model parameters

2.3 OPLS-DA

建立OPLS-DA 模型，參數(shù)（R2Y，Q2）如表3所示。從圖1（C）、（D）的OPLS-DA 得分圖可見，UA 組與AMI 組在正、負(fù)離子模式均具有一定的區(qū)分度，提示兩組血漿樣本存在代謝差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 PLS-DA 和OPLS-DA 模型得分圖Fig 1 Scores of PLS-DA and OPLS-DA models

表3 OPLS-DA 模型參數(shù)Tab 3 OPLS-DA model parameters

2.4 單變量統(tǒng)計分析

常用的單變量統(tǒng)計分析方法中，除了變異倍數(shù)分析、t檢驗，還有綜合前兩種方法的火山圖。圖2 的火山圖中，紅色圓點和藍色圓點即為單變量統(tǒng)計分析篩選的差異代謝物，紅色為上調(diào)，藍色為下調(diào)。

圖2 正、負(fù)離子模式火山圖Fig 2 Volcano plot of positive and negative ion modes

2.5 顯著性差異代謝物

一般來說，具有相似表達模式的代謝物會聚在同一簇內(nèi)。從圖3 的差異代謝物聚類熱圖可見，UA組與AMI 組在正、負(fù)離子模式均有差異，提示兩組的代謝模式明顯不同，可能存在諸多顯著的差異代謝物。

圖3 正、負(fù)離子模式顯著性差異代謝物聚類熱圖Fig 3 Clustering heat map of significant different metabolites of positive and negative ion modes

以VIP＞1.0 為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合Pvalue，篩選UA 組及AMI 組的差異代謝物。如表4 所示，顯著性差異代謝物共有泮托拉唑、乙酰左旋肉堿、棕櫚酰乙醇酰胺、甜菜堿、辛酸、膽紅素、組氨酸、油酸、枸櫞酸鹽、香草醛等54 個，其中正離子模式下顯著性差異代謝物有32 個，負(fù)離子模式下有22 個。

表4 正、負(fù)離子模式差異代謝物Tab 4 Different metabolites of positive and negative ion modes

續(xù)表

2.6 差異代謝物KEGG 通路富集分析

通過Fisher 精確檢驗，對顯著性差異代謝物進行KEGG 通路富集分析，從而確定受到影響的代謝途徑。如圖4 所示，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氨酰-tRNA 生物合成和癌癥的中心碳代謝等通路發(fā)生了顯著變化。

圖4 KEGG 通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis of KEGG pathway

3 討論

ACS 是臨床常見的危急重癥之一，目前診斷多依靠臨床表現(xiàn)、心電圖、心肌標(biāo)志物等，用于癥狀不甚典型的患者，常易導(dǎo)致誤診或漏診。這也提示ACS 的發(fā)病機制中可能還存在其它未知的因素。曾有文獻對ACS 與非ACS 患者的代謝組學(xué)表征進行 對 比，并 得 出 了 一 些 結(jié) 論［10，11］，但 有 關(guān) 于UA 與AMI 的差異代謝物始終未見報道。本研究首次將ACS 拆分為UA 與AMI 進行對照研究，對33 例UA患者和47 例AMI 患者進行回顧性調(diào)查分析，比較其一般情況、血常規(guī)、血生化及心功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組的性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、房顫史、RBC、PLT、Hb、Glu、TG、HDL-C、LVIDd 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而WBC、N%、ALT、AST、TC、LDL-C、cTn Ⅰ、LVIDs、EF 存 在 差 異（P＜0.05），提示UA 與AMI 可能在炎癥、心肌酶譜、膽固醇代謝、心功能等方面有所不同。

進一步對納入患者的血漿樣本進行非靶向的LC-MS 代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明，二者的代謝水平互異。以VIP＞1.0 且Pvalue＜0.05 為指標(biāo)，檢測出了54 種顯著變化的代謝物，如泮托拉唑、乙酰左旋肉堿、棕櫚酰乙醇酰胺、甜菜堿、辛酸、膽紅素、組氨酸、油酸、枸櫞酸鹽、香草醛等，并涉及脂類、酚類、酮酸、羧酸、類固醇、羥基酸等。研究結(jié)果顯示，UA組中相對含量較高的物質(zhì)包括泮托拉唑、乙酰左旋肉堿、甜菜堿、辛酸、香草醛、L-賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、戊酸、乙酰甘氨酸、D-核糖，而AMI組中相對含量較高的物質(zhì)包括棕櫚酰乙醇酰胺、D-脯氨酸、乙二醇單乙醚、肌氨酸、氧化脯氨酸、膽紅素、L-亮氨酸、組氨酸、油酸、枸櫞酸鹽、蘭索拉唑等。與此同時，KEGG 通路富集分析得出的代謝途徑包括ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氨酰-tRNA 生物合成、癌癥的中心碳代謝等。在此就主要的幾種差異代謝物及代謝通路淺作討論。

泮托拉唑、乙酰左旋肉堿、甜菜堿、辛酸、香草醛在UA 組表達上調(diào)。其中，PPZ 能夠減少促炎細胞因子的釋放，抑制氧化應(yīng)激、炎癥和血脂異常相關(guān)的組織損傷［12］。在一項大鼠試驗中，PPZ 被證實通過抑制細胞內(nèi)信號通路MAPK（ERK1/2，JNK，p38）-NF-κB 減輕缺血再灌注損傷［13］。乙酰左旋右減是一種內(nèi)源性分子，參與能量代謝的同時具有抗氧化特性，能有效保護自由基，恢復(fù)和穩(wěn)定線粒體活性，并調(diào)節(jié)腦神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、多巴胺、氨基酸、脂質(zhì)等，并且能保護組織免受缺血再灌注損傷［14，15］。甜菜堿能改善氧化應(yīng)激下的硫氨基酸代謝，抑制核因子-κB 活性和NLRP3 炎癥小體激活，調(diào)節(jié)能量代謝，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡，進而發(fā)揮抗炎的作用［16，17］。與此同時，甜菜堿能通過抗氧化、保護線粒體的方式防止異戊腎上腺素誘導(dǎo)的心肌功能障礙的進一步發(fā)展，保護心功能［18］。研究發(fā)現(xiàn)，辛酸作為一種中鏈脂肪酸，在抑制動脈粥樣硬化進展和內(nèi)皮功能障礙方面作用確切。體外實驗表明，辛酸能通過TLR4/NF-κB 信號通路抑制血漿中炎性細胞因子的表達，改善ApoE 缺乏小鼠的動脈粥樣硬化，推測其可能是預(yù)防和改善動脈粥樣硬化及相關(guān)慢性炎癥疾病的潛在物質(zhì)之一［19］。此外，多項研究表明，香草醛及其主要代謝物在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激方面亦具有一定的潛力，未來有望在炎癥性疾病治療中得到推廣［20］。

棕櫚酰乙醇酰胺（palmitoyl ethanolamide，PEA）、膽紅素、組氨酸、油酸、枸櫞酸鹽在AMI 組中表達上調(diào)。其中，PEA 廣泛存在于神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞、免疫細胞等與炎癥相關(guān)的組織細胞中，并通過激活PPAR-α 產(chǎn)生鎮(zhèn)痛抗炎的作用［21］。此外，PEA 水平的升高可能與冠狀動脈功能惡化存在相關(guān)性，并可在一定程度上預(yù)測冠脈內(nèi)皮功能障礙，尤其是當(dāng)PEA≤2.465 ng/mL 時，其預(yù)測內(nèi)皮依賴性冠脈血管擴張準(zhǔn)確率更高［22］。膽紅素不僅具有清除過度產(chǎn)生的活性氧和抑制血管平滑肌細胞增殖的能力，而且能減弱單核細胞的趨化活性，減少促炎細胞因子的產(chǎn)生，其含量與心血管疾病和心血管危險因素呈負(fù)相關(guān)，因此亦是動脈粥樣硬化的保護因子［23，24］。組氨酸作為一種α-氨基酸，與炎癥標(biāo)志物呈反比。當(dāng)組氨酸的含量下降時，促炎細胞因子的濃度持續(xù)上升，而補充組氨酸具有改善炎癥、減輕氧化應(yīng)激的功能，進而減輕AMI 所致的心肌損傷［25］。油酸的抗炎和抗凋亡活性在心肌修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用，包括降低心臟組織脂質(zhì)過氧化水平、增強抗氧化能力、減少膠原纖維沉積等［26］。近年來，枸櫞酸鹽逐漸成為炎癥中備受關(guān)注的靶點［27］。已有研究證實，枸櫞酸鹽預(yù)處理可以改善小鼠的心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡，同時提高左室射血分?jǐn)?shù)及心排出量，從而改善心功能［28］。

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白廣泛參與了細胞代謝等多種生理過程，且在脂肪細胞、巨噬細胞及多種外周組織細 胞 中 均 有 表 達［29，30］。ABC 轉(zhuǎn) 運 蛋 白 家 族 分 為ABC A～G 共7 個亞型科屬，其中ABCA、ABCG 等亞家族在血小板生成和血小板活性中發(fā)揮重要作用［31，32］。多項研究表明，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白具有促進膽固醇外流的功能，通過降低血小板膜上的質(zhì)膜膽固醇/植物甾醇水平，或減少質(zhì)膜膽固醇積累來糾正血小板過度活躍，減少血栓形成，可能是減緩動脈粥樣硬化發(fā)展和預(yù)防動脈粥樣硬化血栓形成的重要靶點［33］。氨酰-tRNA 生物合成近年來被發(fā)現(xiàn)與胃癌存在相關(guān)性，胃組織中的氨酰-tRNA 生物合成通路相對于鄰近的非癌組織明顯上調(diào)，靶向這一通路可能是治療胃癌的一種新策略，但其在心血管疾病中的應(yīng)用目前尚未有報道［34］。

綜上，本研究通過非靶向代謝組學(xué)方法，對UA和AMI 患者的血漿代謝水平進行了表征，獲得了54種富集于ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氨酰-tRNA 生物合成、癌癥的中心碳代謝途徑的差異代謝物，可用于輔助臨床區(qū)分診斷UA 和AMI，同時也為梳理二者的發(fā)病機制提供了新的思路。但由于樣本量的局限，以及未能將空白對照納入研究，導(dǎo)致定性、定量數(shù)據(jù)的缺乏，因此，對于結(jié)果中各代謝物的含量差異如何影響UA 和AMI 的發(fā)病或進展尚不能作定論。另一方面，考慮到代謝物受干擾因素較多，在篩選過程中應(yīng)進一步控制納入患者的年齡、病程、既往基礎(chǔ)疾病、血管病變程度、心功能分級等，盡量使納入患者的基線保持一致，為UA 與AMI 的鑒別提供一定參考。此外，為了進一步證實這些差異代謝物對于二者的區(qū)分能力，后續(xù)尚需建立含有空白對照的前瞻性、大樣本隊列研究，并積極構(gòu)建體內(nèi)、外模型，如將代謝物加入到細胞培養(yǎng)基或通過灌胃的方式注入小鼠體內(nèi)，以觀察代謝物對細胞或小鼠的影響，進而驗證其功能，為代謝組學(xué)在心血管疾病早期防治領(lǐng)域中的精準(zhǔn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

4 小結(jié)

代謝組學(xué)作為一類新興技術(shù)，為包括心血管疾病在內(nèi)的諸多疾病的病理機制研究提供了新的思路［35］。本研究運用了基于LC-MS 技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)方法，分析了UA 與AMI 患者中具有顯著差異的代謝物及相關(guān)通路，這些差異可能反映了ACS中動脈粥樣硬化的發(fā)展進程，并可能為血漿代謝物參與ACS 早期診斷提供方向。然而，這一初步結(jié)論仍然受多種因素的限制，論證力有所欠缺，尚需進一步的驗證與支持，以確定更合適的生物標(biāo)志物以輔助評估ACS 的進展，并進一步確定早期干預(yù)的靶點，改善預(yù)后。

作者貢獻度說明：

俞鵬、沈樂：負(fù)責(zé)相關(guān)資料的分析及文章的撰寫；楊哲君、石瑞潔：參與數(shù)據(jù)資料的收集、整理；孫偉新：負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與修改；陳曉虎：對文章進行了指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。