葛震，吳遠博，毛琦淇，李宏

作者單位：315211寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（葛震、吳遠博）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（毛琦淇、李宏）

近年來，嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法發(fā)展迅速，特別是在血液惡性腫瘤的治療中。CAR-T指將患者自身外周血中T細胞分離出來并采集，然后將可與腫瘤相關(guān)抗原（TAA）識別的單鏈抗體片段（scFv）通過病毒等載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細胞并利用MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒和piggy Bac轉(zhuǎn)座子等特殊的載體設(shè)計將其整合于細胞內(nèi)基因組中，使T細胞表面表達嵌合抗原受（CAR）。CAR-T細胞與TAA識別并結(jié)合后，誘導(dǎo)了構(gòu)象變化，通過TCR/CD3的 鏈或Fc RI的 鏈向T細胞傳遞活化信號和共刺激信號，導(dǎo)致細胞因子釋放和轉(zhuǎn)錄因子表達，最終引起對腫瘤細胞的細胞毒性反應(yīng)[1]。本文針對目前CAR-T在肝癌中的應(yīng)用現(xiàn)況，討論了目前的障礙和可能的解決方案，并描述了提高CAR-T細胞對HCC患者療效的潛在策略。

1 CAR-T的發(fā)展歷程

CAR主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)主要是由能以非MHC限制性的方式直接識別TAA的單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)序列（scFv）（如CD19sc Fv、CD33sc Fv等）和鉸鏈組成，連接到跨膜結(jié)構(gòu)域上；跨膜區(qū)主要是I型二聚體跨膜蛋白，如CD4、CD8、CD28[2]。胞內(nèi)區(qū)是免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM），通常是TCR/CD3和Fc RI，當(dāng)胞外區(qū)與TAA結(jié)合后，向T細胞傳遞活化信號和共刺激信號。

數(shù)年來，CAR分子結(jié)構(gòu)不斷優(yōu)化，到目前為止，CAR分子已經(jīng)發(fā)展到了第四代。第一代的CAR只含有一個胞內(nèi)信號激活受體CD3，由于缺少共刺激分子，不能轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號和誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，無法有效地實現(xiàn)CAR-T細胞在體內(nèi)的持續(xù)的增殖。第二代CAR細胞內(nèi)增加了一個共刺激分子，如CD28、CD27、41BB（CD137）、OX40（CD134）或者可誘導(dǎo)共刺激分子（ICOS），即便沒有外源性共刺激分子，T細胞也能持續(xù)增殖并釋放細胞因子。Milone等[3]使用二代CAR-T細胞在急性前B-淋巴細胞白血病小鼠體內(nèi)進行實驗，發(fā)現(xiàn)擁有共刺激分子的二代CAR-T細胞能持續(xù)增殖且活性增強。相比于二代CAR-T細胞，三代細胞內(nèi)加入了兩個共刺激分子，進一步增強細胞因子的分泌并抑制腫瘤生長。第四代CAR分子在二、三代分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上整合表達免疫因子或共刺激因子配體（如IL-12），一旦與靶抗原結(jié)合，激活下游轉(zhuǎn)錄因子（NFAT）來誘導(dǎo)表達IL-12，從而招募環(huán)境中的其他免疫細胞，參與對不表達靶抗原的腫瘤細胞的清除；同時，被募集在腫瘤附近的免疫細胞還可以通過分泌某些細胞因子（如IFN-、TNF-、IL-4和IL-5等）來調(diào)節(jié)腫瘤附近的微環(huán)境，解除其免疫抑制性，通過調(diào)動機體自身免疫力參與對腫瘤細胞的殺傷作用[4]。

CAR-T細胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用取得了驚人的療效，特別是特異性靶向CD19分子的CAR-T（CD19-CAR-T）細胞。臨床研究表明其對晚期復(fù)發(fā)難治性淋巴細胞白血病（ALL）的治療有效率可達到90%，對慢性淋巴細胞白血?。–LL）和部分B細胞淋巴瘤的有效率＞50%[5]。2017年8月30日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了美國諾華公司用于治療血液系統(tǒng)腫瘤的CAR-T療法藥物Kymriah，這一藥物的上市，激發(fā)了研究者對CAR-T治療拓展應(yīng)用于實體瘤的研究熱情。

2 CAR-T細胞治療肝癌的靶點

2.1 Glypican-3（GPC3）GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員，可能在細胞分裂控制和生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞中更高的GPC3表達與肝癌預(yù)后較差有關(guān)。GPC3在HCC和其他腫瘤類型中高表達，同時在正常組織中無法檢測到它[6]。

Zhu等[7]在晚期HCC患者中使用GC33（一項選擇性靶向GPC3的重組完全人源化單克隆抗體），表明GC33對GPC3高表達組具有抗腫瘤活性，且在所有劑量水平上，GC33都具有良好的耐受性，為選擇性靶向GPC3提供了依據(jù)。Jiang等[8]將GPC3-CAR-T細胞移植到患者來源的三組HCC異種移植（PDX）模型中，評價了體內(nèi)GPC3-CAR-T細胞的細胞毒性。結(jié)果表明GPC3-CAR-T細胞消除了PDX1組和PDX2組中的腫瘤細胞且有效抑制了PDX3組中的腫瘤生長，證明GPC3-CAR-T細胞能夠有效地抑制體內(nèi)原發(fā)性GPC3+HCC的生長。Shi等[9]進行了兩項前瞻性I期研究，讓患有晚期GPC3+HCC的成年患者（Child-Pugh A級）接受自體GPC3-CAR-T細胞療法，13例患者的中位OS為278天。研究還進行了不良反應(yīng)的評估，9例患者中觀察到細胞因子釋放綜合征（CRS），其中8名受試者發(fā)生了自限性的低級CRS（1級或2級），沒有患者發(fā)生3/4級神經(jīng)毒性和CAR-T細胞相關(guān)的輸注反應(yīng)，證明GPC3-CAR-T細胞臨床安全性較高。也有研究表明，抗GPC3和EGFR雙靶向CAR-T細胞在體外對GPC3+EGFR+HCC細胞產(chǎn)生細胞毒性，而且其產(chǎn)生的細胞因子較單靶向T細胞更強，同時在體內(nèi)抑制腫瘤增殖也較抗GPC3-CAR-T細胞更強，為抗GPC3-CAR-T細胞聯(lián)合其他靶向研制藥物提供依據(jù)[10]。

2.2 甲胎蛋白（AFP）AFP具有一系列重要的生理功能，包括轉(zhuǎn)運功能、免疫抑制、誘導(dǎo)凋亡等[11]。胎兒的血清AFP濃度很高，但成人很低。然而，當(dāng)成人發(fā)生肝細胞癌、肝母細胞瘤和畸胎瘤時，AFP會重新表達，因此可作為腫瘤診斷和療效監(jiān)測的血清標(biāo)志物。傳統(tǒng)的CAR-T細胞只能識別腫瘤表面抗原，而不能識別細胞內(nèi)或分泌的抗原?？紤]到所有細胞內(nèi)或分泌的蛋白質(zhì)都被加工成肽，并由腫瘤細胞表面的I類MHCs呈遞，Liu等[12]構(gòu)建的AFP-CAR-T細胞可以選擇性地與HLA-A*02∶01呈遞的AFP 158-166肽結(jié)合，然后脫顆粒，釋放細胞因子，裂解HLA-a*02∶01+/AFP+腫瘤細胞。此外，在HCC異種移植模型和播散性腹膜肝癌模型中，發(fā)現(xiàn)AFP-CAR-T細胞能夠成功抑制腫瘤的生長。與此同時，他們進行了一項I期臨床試驗，成功評估了表達AFP的HCC患者體內(nèi)CART細胞的安全性和有效性（NCT03349255）。因此，用CAR-T細胞靶向細胞內(nèi)和分泌的腫瘤抗原產(chǎn)物是有希望的癌癥治療策略。

2.3 CD147 研究表明CD147促進了HCC細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并有潛力用作腫瘤的重要預(yù)后和治療生物標(biāo)志物。目前已開發(fā)碘-131標(biāo)記的CD147特異性單克隆抗體，可顯著延長腫瘤復(fù)發(fā)中位時間[13]。因此針對CD147的靶向治療可能為HCC提供一種有效的治療策略。

Zhang等[14]開發(fā)出一種由Tet-On系統(tǒng)控制的經(jīng)修飾的新型誘導(dǎo)型CAR-T細胞，能夠在存在或去除多西環(huán)素（Dox）時可逆地開啟或關(guān)閉CAR基因表達。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重不良事件時，可以立即終止Dox的供應(yīng)，在這種情況下，T細胞上CD147-CAR的表達將在24～48h內(nèi)恢復(fù)到基線水平。在體外實驗中，（Dox+）Tet-CD147-CAR-T細胞與（Dox－）Tet-CD147-CAR-T細胞和外周血單個核細胞相比，表現(xiàn)出更高的細胞毒性和增加的細胞因子分泌；同時，Tet-CD147-CART細胞對HCC細胞顯示出顯著的細胞毒性，還可以釋放多種免疫刺激性細胞因子來增強抗腫瘤作用。進一步他們在體內(nèi)進行了Tet-CD147-CART細胞抗腫瘤活性的實驗，結(jié)果表明在有DOX存在時，CD147-CART細胞可以有效殺死癌細胞的HCC異種移植物模型。提示CD147-CAR-T細胞可能可以為肝癌患者臨床藥物提供治療選擇。

2.4 CD133 CD133是在各種實體瘤中過表達的五聚糖跨膜糖蛋白，在50%的HCC高表達。Kohg等[15]報道稱，CD133細胞只存在于肝癌組織中，而不存在于非癌肝組織中，并且CD133在肝癌細胞中的表達可能誘導(dǎo)肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，CD133的高表達通常與較高階段的癌癥等級、較差的患者預(yù)后相關(guān)聯(lián)。此外，CD133已被證實是參與癌癥干細胞和內(nèi)皮祖細胞腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物[16]。在一項I期臨床試驗中，接受CD133-CAR-T治療的HCC患者中位生存期為7個月，明顯高于一線治療無效的晚期HCC患者（4個月）。CD133-CAR-T重復(fù)輸注后，可使無法對一線治療產(chǎn)生反應(yīng)的患者獲得相對較長的穩(wěn)定期，同時通過重復(fù)注射能夠有效改善CAR-T細胞治療的持久性，使CD133-CAR-T細胞可以在體內(nèi)長期生存，而CAR基因的持久性也可以有效實現(xiàn)疾病清除和防止復(fù)發(fā)的作用。在II期臨床試驗中，CD133-CAR-T細胞在晚期HCC中具有較好的抗腫瘤活性和可控的安全性。該研究結(jié)果表明總生存期的中位數(shù)為12個月，無進展生存期的中位數(shù)為6.8個月[17]。

2.5 c-Met c-Met是一種由MET原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，它具有高親和力配體-肝細胞生長因子（HGF）。HGF誘導(dǎo)c-Met二聚化激活，從而刺激多個下游信號通路，包括促分裂原激活的蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶以及核因子kappa-B，導(dǎo)致一系列生物學(xué)效應(yīng)，如細胞生長、增殖、侵襲及遷移等[18]。c-Met/HGF信號抑制劑能減少肝細胞腫瘤細胞的增殖，細胞運動性和侵襲性，并促進凋亡，已在HCC臨床前模型中顯示出抗腫瘤潛力，c-Met抑制劑在HCC的治療中也顯示出療效，尤其是對c-Met陽性腫瘤的治療。同時，臨床及臨床前試驗已有部分非選擇性c-Met抑制劑來治療HCC[19]。因此c-Met被認(rèn)為是治療HCC的一個潛在靶點。

Liu等[20]研究c-Met-CARNK細胞在體內(nèi)表現(xiàn)出對人肝癌HepG2細胞具有細胞毒性作用。近期研究也表明，雙特異性c-Met/PD-L1 CAR-T細胞可以通過在體外對HCC細胞顯示出優(yōu)異的細胞裂解能力，產(chǎn)生更多殺傷HCC細胞的細胞因子和更加顯著的抑制小鼠體內(nèi)HepG2異種移植物的腫瘤生長[21]。

2.6 PD-1 程序性死亡受體1（PD-1），也稱為CD279，是一種重要的免疫抑制分子。通過下調(diào)免疫系統(tǒng)對人體細胞的反應(yīng)，以及通過抑制T細胞炎癥活動來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并促進自身耐受[22]。在腫瘤的發(fā)展和生長過程中，肝微環(huán)境中有效的抗腫瘤免疫監(jiān)視受到損害，而PD-1/PD-L1信號通路，參與了上述過程[23]。在HCC患者中，PD-1在CD8+T細胞中的表達增加；此外，在肝癌患者中高表達PD-1與腫瘤浸潤淋巴細胞和衰竭表型相關(guān)。2017年9月，Nivolumab被FDA批準(zhǔn)用于在索拉非尼失敗后的肝癌二線治療的抗PD-1單克隆抗體。盡管部分患者的臨床結(jié)局有所改善，但抗PD-1/PD-L1抑制劑在80%的HCC患者中仍然無效。此外，它們價格昂貴并且引起許多嚴(yán)重的副作用[24]。因此，針對PD-1為靶點的藥物茲待開發(fā)。

Pan等[25]研制出攜帶PD-1-CH3融合蛋白（sPD1）的GPC3特異性CAR-T細胞，并證實其可以特異性識別、裂解的GPC3陽性HCC細胞，同時在體內(nèi)實驗中顯示出比GPC3-CAR-T細胞更高的腫瘤抑制能力。與此同時，GPC3-28Z-sPD1 T細胞治療的小鼠中觀察到腫瘤中CD3陽性T細胞的數(shù)量增加，顆粒酶B水平升高和Ki67表達水平降低。這些數(shù)據(jù)共同表明，攜帶sPD1的GPC3特異性CART細胞顯示出有望用于治療HCC患者。近期研究表明，PD-1的破壞增強了CART細胞對肝癌的體內(nèi)抗腫瘤活性，改善了帶有腫瘤的小鼠中CAR-T細胞的持久性和浸潤性，并增強了GPC3-CAR-T細胞在異種移植腫瘤中對腫瘤相關(guān)蛋白基因表達的抑制作用，也顯示出PD-1對CAR-T細胞中的應(yīng)用有巨大作用[26]。

3 CAR-T細胞治療肝癌所面臨的困難及策略

3.1 腫瘤特異性抗原的缺乏 CAR-T細胞治療HCC成功的障礙之一是難以找到理想的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。盡管針對HCC的靶點有很多，例如AFP、CD147及GPC3等，但其特異性不強。此外，由于腫瘤組織異質(zhì)性這一特點導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)移部位的腫瘤即使亞型相同遺傳類型也不同，造成了CAR-T療效不佳。由于這些靶點的表達不同，單一的CAR-T治療策略可能并不適用于所有HCC患者。此外，TAA不僅在癌細胞中表達，而且在正常細胞中也以低水平表達，因此在健康組織中引起靶向、腫瘤外毒性。目前，T細胞工程中主要應(yīng)用了3種類型的雙特異性CAR，即雙靶CAR、串聯(lián)CAR和通用CAR。通過使用兩個或多個細胞外抗原識別基序設(shè)計特異性更強的CAR-T細胞來增強CAR-T結(jié)合實體瘤靶點的有效性。Kloss等[27]首先報道了一種帶有嵌合共刺激受體（CCR）的次優(yōu)CAR細胞（前列腺特異性膜抗原PSMA和前列腺干細胞抗原PSCA），只有當(dāng)這兩種靶抗原同時出現(xiàn)在腫瘤細胞表面時，雙T細胞才會被完全激活，并殺死了表達這兩種抗原的細胞，從而顯著增強特異性，使正常細胞不受影響。

3.2 T細胞活性維持時間短 CAR-T在各種實體瘤患者體內(nèi)的活化維持時間從22d到9個月不等[28]，維持時間短，影響患者預(yù)后。選用特定亞型的T細胞用于編輯CAR-T細胞，如幼稚性T細胞（表達CD62L），與效應(yīng)T細胞相比，此種CAR-T細胞具有更強的在患者體內(nèi)持續(xù)存在的能力[29]。

另一種用于延長CAR-T在體內(nèi)的活化時間的方法是通過敲除T細胞內(nèi)的特定基因。鋅指（TALEN）技術(shù)被用來永久性地刪除T細胞中TCRa和b的表達[30]。這些T細胞通過CAR而非TCR定向刺激對CD19抗原產(chǎn)生應(yīng)答，這表明同種異體的CAR-T細胞并不會產(chǎn)生移植物抗宿主病，這是向產(chǎn)生通用供體T細胞方向邁出的重要一步。因此，無論供體來源如何，都有可能產(chǎn)生具有最佳移植效果的T細胞庫，從而規(guī)避個性化患者產(chǎn)品固有的可變性。

3.3 CAR-T細胞歸巢 CAR-T細胞向腫瘤部位高效遷移從而直接與腫瘤細胞結(jié)合是CAR-T細胞療法成功的關(guān)鍵。趨化因子在淋巴細胞遷移中起主要作用，如CXCR2、CXCR3和CCR5。因此，可將腫瘤組織高表達的趨化因子相應(yīng)受體整合于CAR-T細胞中作為靶點。這種方法最初是通過趨化因子受體CXCR2在T細胞中的表達來證明的，CXCR2對黑色素瘤腫瘤細胞產(chǎn)生的趨化因子CXCL1（Groa）具有特異性[31]。Moon等[32]運用痘苗病毒在小鼠間皮瘤模型中瘤內(nèi)遞送趨化因子CXCL11時，發(fā)現(xiàn)CAR-T浸潤水平和抗腫瘤效果顯著增加。Smith等[33]研究表明與全身給藥相比，局部注射需要的細胞數(shù)量更少、毒性反應(yīng)更低。趨化因子系統(tǒng)是復(fù)雜的，因此，為了有效靶向CAR-T細胞，需要了解腫瘤產(chǎn)生的一系列趨化因子的組合效應(yīng)，以制定一種策略，專注于重要的歸巢趨化因子，避免其他腫瘤表達的趨化因子的潛在調(diào)控作用。

3.4 腫瘤微環(huán)境的免疫抑制 腫瘤微環(huán)境具有氧化應(yīng)激、營養(yǎng)耗竭、酸性pH環(huán)境和缺氧等特性，可降低CAR-T細胞活性。Juillerat等[34]發(fā)現(xiàn)共表達缺氧誘導(dǎo)因子的CAR-T細胞可在腫瘤微環(huán)境中獲得更強的活性，在體外正常氧水平下該種CAR表達低下，但在低氧條件下CAR表達水平顯著提高。IL-12的產(chǎn)生與CAR活性密切相關(guān)，共表達IL-12的CAR-T細胞能保證IL-12在腫瘤微環(huán)境中局部產(chǎn)生，影響了腫瘤基質(zhì)內(nèi)的局部抑制細胞，誘導(dǎo)了巨噬細胞活性，導(dǎo)致對癌癥的免疫攻擊范圍擴大，包括對CAR靶抗原表達缺失的腫瘤細胞的攻擊[35]。

3.5 不良反應(yīng) CAR-T細胞治療過程中產(chǎn)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)也是應(yīng)用于實體腫瘤的主要挑戰(zhàn)，例如急性呼吸窘迫綜合征、CRS及嚴(yán)重神經(jīng)毒性（SNT）等。CAR-T細胞治療的毒性增加主要有兩種機制：（1）CAR-T細胞免疫治療后最危及生命的毒性是靶向毒性，如CRS。CART細胞與靶腫瘤細胞上的抗原結(jié)合后被廣泛激活，導(dǎo)致大量炎性細胞因子的釋放。CRS癥狀包括發(fā)燒、疲勞、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、譫妄、幻覺及低血壓，甚至嚴(yán)重的多器官衰竭。其嚴(yán)重程度與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)。IL-6似乎是CRS的主要調(diào)節(jié)因子，因此改善這一副作用的關(guān)鍵策略是直接用IL-6R抑制劑tocilizumab阻斷IL-6；（2）另一種類型的毒性來自CART細胞與正常細胞的靶抗原結(jié)合，導(dǎo)致健康細胞和器官的破壞。例如，在神經(jīng)母細胞瘤的治療中，GD2特異性CAR-T細胞治療存在致命的神經(jīng)毒性，提示GD2可能是CAR-T細胞治療的不合適的靶向抗原。為了降低這種毒性的風(fēng)險，提高CAR-T細胞靶抗原特異性顯得尤為重要，如上文中提及的雙靶CAR-T細胞。

4 總結(jié)與展望

盡管CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得了令人印象深刻的成果，但想要實現(xiàn)實體瘤的可靠治愈，CAR-T細胞的研究和應(yīng)用要還有很長的路要走，尤其是HCC。如本文所提許多有希望的針對HCC的CAR-T細胞治療策略已經(jīng)在臨床前模型中實施，并顯示出有希望的結(jié)果。CAR-T在臨床前和臨床研究中均被證明是一種有前途的HCC治療方法。進一步優(yōu)化CAR的設(shè)計，以提供更好的T細胞活化、識別特異性、抗腫瘤活性和安全性控制。尋找最佳信號和共刺激域繼續(xù)提高CAR-T治療的療效。應(yīng)用雙靶CAR提高腫瘤細胞識別特異性，限制對正常細胞的意外攻擊?？朔庖咭种颇[瘤微環(huán)境，對CAR修飾的T細胞進行更多的修飾（IL12、PD1、CTLA4）。建立標(biāo)準(zhǔn)的臨床方案，包括患者預(yù)處理、細胞因子支持和其他潛在的聯(lián)合治療。隨著這些技術(shù)難題的不斷突破，相信CAR-T將會在實體瘤的治療中獲得更好的效果。