盧 錕，仲嘉玥，張 慧，劉 洋，王 森，楊 奧，李 澤

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.食品與工程學(xué)院；c.湖南省“一帶一路”熱帶干旱經(jīng)濟(jì)林國(guó)際聯(lián)合研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.通道南楚農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 懷化 418500）

黑老虎Kadsura coccinea是木蘭科Magnoliaceae南五味子屬Kadsura的常綠藤本植物，別名布福娜、冷飯團(tuán)、臭飯團(tuán)、酒飯團(tuán)等，廣泛分布于我國(guó)廣東、廣西、海南、江西、浙江、福建、湖南、貴州、四川、云南等?。▍^(qū)）[1-2]。黑老虎是一種集食用價(jià)值、藥用價(jià)值、綠化價(jià)值、觀賞價(jià)值于一體的極具開發(fā)潛力的多用途新型果樹。就藥用價(jià)值來說，其根、莖、葉中含有綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸等具有重要藥理活性的化合物[3]。在黑老虎根、莖、葉這3 個(gè)器官中含有不同濃度的精油，精油中共含有116 種揮發(fā)性成分，這些成分可用于治療皮膚炎癥[4]。黑老虎種子和果皮的提取液具有抑制酪氨酸酶活性的功效，可作為美容產(chǎn)品中活性成分的重要來源[5]。除此之外，黑老虎還具有明顯的抗腫瘤、抗HIV、抗炎、保肝、抗氧化等作用[6-7]。鑒于黑老虎的應(yīng)用價(jià)值極高，有研究人員對(duì)其進(jìn)行了深入研究，開發(fā)了黑老虎SSR 標(biāo)記，可為其群體遺傳學(xué)研究以及種質(zhì)資源收集、保存、評(píng)價(jià)以及良種選育提供依據(jù)[8]。目前，低產(chǎn)低效嚴(yán)重制約了黑老虎產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，主要原因之一就是無性繁殖技術(shù)不成熟，良種化程度低。黑老虎苗木主要是實(shí)生苗，不能保持母本的優(yōu)良性狀，子代生長(zhǎng)性狀良莠不齊，不利于其規(guī)模化育苗和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[9-10]。前人對(duì)黑老虎無性繁殖扦插及嫁接技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究，黑老虎扦插后苗木根系較弱，生根率僅為(75.99±0.30)%，扦插育苗技術(shù)不成熟[11-12]；黑老虎嫁接技術(shù)也是一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容，黑老虎傷口處容易產(chǎn)生大量的黏液，影響嫁接成活，黑老虎嫁接成活率為80%[13]。此外，扦插和嫁接繁殖受季節(jié)限制，尚不能滿足黑老虎產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。

組織培養(yǎng)具有繁殖速度快，不受季節(jié)限制及可培養(yǎng)脫毒苗等優(yōu)點(diǎn)，是快速繁殖優(yōu)良植物品種的一條重要途徑，具有廣闊的商業(yè)化前景[14-15]。組織培養(yǎng)技術(shù)還可應(yīng)用于種質(zhì)保存、體細(xì)胞無性變異和突變體篩選、次生代謝物的生產(chǎn)以及林木育種等[16]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不受材料種類限制，可利用種子、葉片、帶芽莖段等多種組織器官作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。孫艷艷等[17]以‘玲瓏’楓香葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，最終初步建立了‘玲瓏’楓香葉片愈傷組織增殖培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo)體系。因此，利用植物組培技術(shù)培育黑老虎脫毒苗，有利于黑老虎品質(zhì)的提高及產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[18]。目前，關(guān)于通過組織培養(yǎng)獲得黑老虎無菌苗的研究報(bào)道較少。梁忠厚[19]研制了適合誘導(dǎo)黑老虎直接胚體發(fā)生和植株再生的培養(yǎng)基，并詳細(xì)報(bào)道了培養(yǎng)基的配制方法；韋榮昌等[20]報(bào)道了將黑老虎莖尖頂端幼嫩葉片培育成完整植株的方法。但是，目前黑老虎帶芽莖段組織培養(yǎng)技術(shù)體系尚不完善，不利于后期進(jìn)行工廠化育苗。本研究中主要以黑老虎帶芽莖段為外植體，通過改變外植體消毒處理方式、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比，研究培養(yǎng)黑老虎無菌苗的適宜條件，旨在為黑老虎的工廠化育苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑老虎帶芽莖段采自通道縣芋頭村（109°47′13.40″E，26°9′49.87″N）。2018年3月，將大田栽培的3年生黑老虎大苗移栽到高30 cm、直徑25 cm 的塑料盆中，剪掉地上部分的莖段和葉片，在中南林業(yè)科技大學(xué)樹木樓實(shí)驗(yàn)室樓頂溫室內(nèi)培養(yǎng)。正常水肥管理3 ～5 個(gè)月后，用再次萌發(fā)的半木質(zhì)化帶芽莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2 方 法

1.2.1 外植體取樣及前期處理

在晴天上午，選取生長(zhǎng)健壯的半木質(zhì)化黑老虎帶芽莖段帶回實(shí)驗(yàn)室。剪去葉片后，切成3 ～4 cm 長(zhǎng)的莖段，每莖段帶1 個(gè)腋芽。將帶芽莖段放在三角瓶中用自來水沖洗1 ～2 遍，放入洗潔精沖洗1 ～2 遍，再用流水反復(fù)沖洗60 min，最后用無菌水清洗3 ～5 次，以免莖段分泌的大量黏液影響正常的消毒處理。

1.2.2 外植體材料消毒

分別以溫室盆栽和大田培養(yǎng)的黑老虎植株的帶芽莖段為外植體，在無菌條件下用75%的酒精溶液、5%的次氯酸鈉溶液、0.1%的升汞溶液對(duì)黑老虎帶芽莖段進(jìn)行消毒處理，75%酒精溶液的消毒時(shí)長(zhǎng)分別設(shè)置為1.5、2.0、3.0 min，5%次氯酸鈉溶液的消毒時(shí)長(zhǎng)分別設(shè)置為0、23、25 min，0.1%升汞溶液的消毒時(shí)長(zhǎng)分別設(shè)置為0、30、35、40、45、50 min。消毒過程中用鑷子在燒杯中不斷攪動(dòng)，消毒完成后用無菌水沖洗5 ～6 遍。在培養(yǎng)皿中用無菌濾紙吸干莖段表面的水分，用小刀切掉莖段兩端褐化的部分，將帶芽莖段接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，25 d 后統(tǒng)計(jì)污染率及褐化率。

1.2.3 外植體培養(yǎng)

初始腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，其中含蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，培養(yǎng)基pH 為5.5 ～5.8。在無菌條件下，將經(jīng)消毒的外植體接種到含6-BA（0、1.0、2.0 和3.0 mg/L）、IAA（0、0.1、0.2、0.5 和1.0 mg/L）、GA3（0、1.0 和2.0 mg/L）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽，培養(yǎng)溫度為(26±1) ℃。暗培養(yǎng)5 d 后轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 100 ～2 200 lx，光照12 ～14 h/d。25 d 后統(tǒng)計(jì)腋芽的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。

繼代增殖培養(yǎng)以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，其中含蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，培養(yǎng)基pH 為5.5 ～5.8。在無菌條件下，將經(jīng)初代培養(yǎng)獲得的腋芽切下，接種到加入不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑ZT（0、1.0 和2.0 mg/L）、IAA（0、0.1 和0.2 mg/L）、2-iP（0、1.0和2.0 mg/L）、IBA（0、0.1 和0.5 mg/L）、6-BA（0、1.0、2.0 和3.0 mg/L）的培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(26±1) ℃。暗培養(yǎng)2 d 后轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 100 ～2 200 lx，光照12 ～14 h/d。30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。增殖系數(shù)為增殖后芽總數(shù)量與接種時(shí)芽總數(shù)量的比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析（Duncan 氏法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)黑老虎莖段的消毒效果

不同消毒處理對(duì)大田栽培黑老虎帶芽莖段的消毒效果見表1。由表1可知，大田直接采回的黑老虎帶芽莖段難以誘導(dǎo)出腋芽，腋芽成活率均為0。消毒時(shí)長(zhǎng)超過50 min，腋芽全部褐化死亡（圖1A），褐化后也會(huì)出現(xiàn)污染現(xiàn)象（圖1B）；消毒時(shí)長(zhǎng)少于40 min，莖段容易被污染（圖1C）。即使是培養(yǎng)30 d 后，已長(zhǎng)大腋芽的基部仍會(huì)長(zhǎng)出大量菌絲（圖1D），1 周后培養(yǎng)基完全被污染。說明通過以上消毒方式無法解決大田黑老虎帶芽莖段難消毒的問題。

圖1 組織培養(yǎng)過程中黑老虎莖段的污染狀況Fig.1 Contamination of the stem segment with bud of K.coccinea during tissue culture

表1 不同消毒處理對(duì)黑老虎莖段的消毒效果?Table 1 Disinfection effects of different disinfection treatments on the stem segment with bud of K.coccinea

不同消毒處理對(duì)溫室盆栽黑老虎莖段的消毒效果見表1。由表1可知，黑老虎帶芽莖段的污染率得到了明顯控制，并且腋芽誘導(dǎo)成活率明顯提高。由此可見，溫室盆栽黑老虎帶芽莖段帶菌少，各消毒處理的效果明顯，普遍比大田栽培帶芽莖段的消毒效果好。其中，使用75%酒精消毒2 min+0.1%升汞消毒45 min 處理的外植體污染率和褐化率最低，污染率為18.5%，褐化率為21.7%。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑老虎莖段初代培養(yǎng)的影響

將消毒后的黑老虎帶芽莖段接種到初代培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，各培養(yǎng)基中腋芽的生長(zhǎng)情況見表2和圖2。

圖2 初代培養(yǎng)中黑老虎莖段腋芽生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of axillary buds in stem segment of K.coccinea in primary culture

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑老虎莖段初代培養(yǎng)的影響?Table 2 Effects of different plant growth regulators on primary culture of the stem segment with bud of K.coccinea

由表2可知：培養(yǎng)基中僅加入IAA 或GA3時(shí)，腋芽長(zhǎng)勢(shì)弱；加入6-BA 和IAA 時(shí)，腋芽的生長(zhǎng)狀況隨著6-BA 濃度的變化而變化，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時(shí)，腋芽的生長(zhǎng)狀況較好。所以最終確定黑老虎帶芽莖段的初代培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，誘導(dǎo)率可達(dá)46.2%，且初代培養(yǎng)中增殖系數(shù)達(dá)8.0 以上。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑老虎帶芽莖段繼代培養(yǎng)的影響

將經(jīng)初代培養(yǎng)獲得的腋芽切下，接種添加ZT、IAA、2ip 或添加IBA、6-BA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上，進(jìn)行腋芽的增殖培養(yǎng)，增殖結(jié)果見表3。由表3可知：ZT、IAA 和2ip 組合的處理中增殖系數(shù)均不高，腋芽的增殖效果并不明顯；在添加IBA、6-BA 的處理中，腋芽的增殖系數(shù)較高，生長(zhǎng)狀況較好。因此適宜黑老虎腋芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，最高增殖系數(shù)可達(dá)8.5。繼代培養(yǎng)中黑老虎莖段腋芽增殖情況如圖3所示。

圖3 繼代培養(yǎng)中黑老虎莖段腋芽增殖情況Fig.3 Proliferation of axillary buds in stem segments of K.coccinea in subculture

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑老虎莖段繼代培養(yǎng)的影響?Table 3 Effects of different plant growth regulators on subculture of the stem segment with bud of K.coccinea

3 結(jié)論與討論

對(duì)采集的大田和溫室盆栽黑老虎帶芽莖段進(jìn)行消毒處理，對(duì)比兩者的污染率、褐化率及腋芽誘導(dǎo)率，結(jié)果表明溫室盆栽黑老虎帶芽莖段的消毒效果優(yōu)于大田黑老虎，因此，以黑老虎帶芽莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選室內(nèi)培養(yǎng)的植株進(jìn)行采樣。以溫室盆栽黑老虎的帶芽莖段為外植體時(shí)，75%酒精消毒2 min，再用0.1%升汞消毒45 min 處理的污染率和褐化率最低，此時(shí)污染率為18.5%，褐化率為21.7%。將消毒后的帶芽莖段接種到初代培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，誘導(dǎo)率可達(dá)46.2%，且增殖系數(shù)能達(dá)8.0 以上。將經(jīng)初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的腋芽從基部切下后接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，得到的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，最高增殖系數(shù)可達(dá)8.5。

無性繁殖技術(shù)的發(fā)展解決了傳統(tǒng)人工栽培育種中存在的諸多問題，如周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)不高等，為植物種質(zhì)資源的保存及開發(fā)利用提供了新途徑[21]。目前，常用的無性繁殖技術(shù)包括嫁接、扦插、組織培養(yǎng)等[22]。本文中主要以建立黑老虎帶芽莖段的組織培養(yǎng)技術(shù)體系為目的，選取了生長(zhǎng)健壯、腋芽飽滿的黑老虎帶芽莖段作為外植體，從消毒、初代腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)3 個(gè)方面進(jìn)行了研究。

黑老虎帶芽莖段組織培養(yǎng)技術(shù)體系建立過程中面臨的最大難題是外植體的消毒。不徹底的消毒容易造成污染，獲得無菌苗的可能性較小，過度消毒則使外植體褐化。該問題嚴(yán)重限制了黑老虎無性繁殖脫毒苗的生產(chǎn)，嚴(yán)重阻礙了黑老虎遺傳轉(zhuǎn)化體系的發(fā)展。造成黑老虎帶芽莖段污染的原因較多，可分為內(nèi)部因素與外部因素。內(nèi)部因素是黑老虎的內(nèi)生菌難以消除，外部因素主要為與外界接觸過程中植株附著的細(xì)菌和真菌過多。本研究中選用大田黑老虎的帶芽莖段為外植體進(jìn)行消毒，結(jié)果表明即使帶芽莖段已消毒超過50 min 且發(fā)生褐化，但無法徹底消毒，培養(yǎng)過程中仍被污染。為解決該問題，將2 ～3年生的大田黑老虎苗剪掉地上部分后移栽到花盆中，在溫室內(nèi)培養(yǎng)，待植株長(zhǎng)出新梢后，采集帶飽滿芽的半木質(zhì)化莖段作為外植體，使用75%酒精、0.1%升汞和5%次氯酸鈉進(jìn)行消毒，結(jié)果表明在溫室盆栽植株上采樣可顯著降低初代培養(yǎng)的污染率，成功獲得了黑老虎無菌芽，基本控制了黑老虎帶芽莖段初代培養(yǎng)的污染率。在黑老虎帶芽莖段的消毒過程中，消毒時(shí)長(zhǎng)尤為重要，既要控制污染率，又要控制褐化率。張赫巖等[23]以重瓣榆葉梅的莖段為外植體，使用75%酒精、0.1%升汞和5%次氯酸鈉進(jìn)行消毒，結(jié)果表明消毒時(shí)長(zhǎng)過多和過少均會(huì)影響莖段的存活率，與本研究結(jié)果基本一致。在本研究中發(fā)現(xiàn)：升汞消毒時(shí)長(zhǎng)超過50 min 會(huì)導(dǎo)致莖段褐化嚴(yán)重，莖段成活率低；升汞消毒時(shí)長(zhǎng)少于40 min 則污染率較高。另外，黑老虎帶芽莖段傷口處會(huì)分泌出大量黏液，酒精對(duì)黏液的清理效果較為顯著，升汞對(duì)黑老虎外植體褐化的影響遠(yuǎn)小于酒精，因此最終采用酒精較短消毒時(shí)長(zhǎng)、升汞較長(zhǎng)消毒時(shí)長(zhǎng)聯(lián)合處理外植體的方法，雖然該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，但是其平衡污染率和褐化率的效果較好。

在進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)時(shí)，6-BA 和IAA 聯(lián)合使用的效果明顯優(yōu)于GA3，在培養(yǎng)基添加GA3的處理中誘導(dǎo)率低且腋芽長(zhǎng)勢(shì)較差，但在3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA 處理中得到了生長(zhǎng)旺盛的腋芽，可用于后續(xù)的繼代增殖培養(yǎng)。在繼代增殖培養(yǎng)中，3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA 處理的增殖系數(shù)最高，效果明顯優(yōu)于ZT、IAA、2ip 聯(lián)合使用。

本研究中篩選出了能使帶芽莖段穩(wěn)定萌發(fā)的培養(yǎng)基，培育出了生長(zhǎng)健壯的無菌苗，但無菌苗生根率較低，長(zhǎng)出的根系較弱，無法進(jìn)行煉苗移栽。因此，后續(xù)將進(jìn)一步篩選促進(jìn)黑老虎無菌苗根系發(fā)育的培養(yǎng)基配方。