黃思軍, 邱晨, 龍超, 龍麗娟,4

1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301;

2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511458;

3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;

4. 三亞海洋生態(tài)環(huán)境工程研究院, 海南 三亞 572000

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是地球上生物多樣性最高的生態(tài)系統(tǒng)之一, 以不到 1%的海洋表面積維持著約25%的海洋生物的生存和繁衍(Spalding et al, 2001)。珊瑚依賴于與蟲黃藻的共生關(guān)系, 使其在寡營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中也能得以生存(Muscatine et al, 1977)。在這種共生關(guān)系中, 蟲黃藻可為珊瑚提供高達(dá)95%的碳源,而珊瑚則為蟲黃藻提供無機(jī)碳進(jìn)行光合作用(Muscatine, 1990)。蟲黃藻在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是一個(gè)單一物種——小亞德里亞共生藻(Symbiodinium microadriaticum) (Freudenthal, 1962), 但隨著對(duì)蟲黃藻超微結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究, 發(fā)現(xiàn)不同蟲黃藻藻株在宿主識(shí)別(Schoenberg et al, 1980)、形態(tài)學(xué)(Blank et al,1989; Trench et al, 1995)、染色體數(shù)目和體積(Blank et al, 1985)、類菌胞素氨基酸(mycosporine-like amino acids, MAAs) (Banaszak et al, 2000)等方面具有明顯差異。后來遺傳方法的應(yīng)用, 如比較核糖體小亞基rRNA 序列(Rowan et al, 1991)、大亞基rRNA序列(van Oppen et al, 2001)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1、

ITS2)(Pochon et al, 2001; Rodriguez-Lanetty et al,2004)、葉綠體psb基因(Moore et al, 2003)、線粒體COX1 基因(Takabayashi et al, 2004)等, 加速了蟲黃藻分類學(xué)的發(fā)展。之后, 隨著進(jìn)化枝 I 的發(fā)現(xiàn),Symbiodinium屬被分為 9 個(gè)譜系(Clade A—I)(Pochon et al, 2010)。Lajeunesse 等(2018)提出將Symbiodinium屬提升為Symbiodinaceae 科, 將之前的9 個(gè)進(jìn)化枝細(xì)分為15 個(gè)譜系(相當(dāng)于屬), 并正式描述了其中的7 個(gè)。

蟲黃藻與珊瑚的研究已獲得了重要的認(rèn)識(shí)。Bongaerts 等(2010)發(fā)現(xiàn)珊瑚宿主的基因型與蟲黃藻的組成密切相關(guān), 珊瑚也可以與多種蟲黃藻共生(Blackall et al, 2015)。Mizuyama 等(2020)推測(cè)蟲黃藻的基因型可能會(huì)影響珊瑚宿主的生態(tài)差異, 這可能有助于珊瑚適應(yīng)復(fù)雜的生存環(huán)境。然而, 珊瑚共生功能體(holobiont)并不僅限于蟲黃藻和珊瑚, 極其多樣的珊瑚細(xì)菌群落的作用也不容忽視(Rohwer et al, 2001)。眾多研究已表明珊瑚可能具有特異性的細(xì)菌群落(Rohwer et al, 2002; Wegley et al, 2007;Morrow et al, 2012; Sharp et al, 2012; Bayer et al,2013; Bosch, 2013), 一些細(xì)菌在珊瑚系統(tǒng)的硫循環(huán)和碳循環(huán)中扮演著重要的角色(Raina et al, 2010;R?decker et al, 2015), 另一些則有利于珊瑚的健康,如珊瑚粘液中發(fā)現(xiàn)的具有抵抗致病菌弧菌的細(xì)菌(Nissimov et al, 2009)。在全球變暖的背景下, 研究人員發(fā)現(xiàn)珊瑚白化過程伴隨著蟲黃藻的離開及細(xì)菌群落的顯著變化(Bourne et al, 2008; Grottoli et al,2018; Yang et al, 2021)。這些都表明珊瑚、蟲黃藻與細(xì)菌群落之間的關(guān)系密不可分(Bourne et al, 2016)。

雖然珊瑚—細(xì)菌, 蟲黃藻—珊瑚的關(guān)系已被廣泛研究, 但蟲黃藻與細(xì)菌之間的關(guān)系卻長(zhǎng)期被忽視(Matthews et al, 2020)。藻細(xì)胞可以產(chǎn)生有機(jī)分子在其周圍形成藻際環(huán)境, 生存于藻際環(huán)境的細(xì)菌被稱為藻際細(xì)菌(Seymour et al, 2017)。藻菌之間的關(guān)系是既密切又復(fù)雜的, 且可以長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。藻吸引過來的有益細(xì)菌可以通過消耗氧來緩解藻生長(zhǎng)過程中的氧氣壓力, 或礦化有機(jī)物為藻提供無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽,甚至可以為藻類提供維生素, 但細(xì)菌的大量繁殖反過來也會(huì)抑制藻的生長(zhǎng)(張?jiān)龌?等, 2018)。早期Ainsworth 等(2015)通過采集珊瑚不同部位的樣本揭示了共生蟲黃藻所在的內(nèi)胚層與上皮細(xì)胞及表面黏液層細(xì)菌群落的顯著差異, 但蟲黃藻所在環(huán)境還包含了其他生物存在, 所以原位采樣并不能準(zhǔn)確得到蟲黃藻密切相關(guān)的細(xì)菌群落。因此目前研究蟲黃藻藻際微生物群落主要通過離體培養(yǎng)的方法(Lawson et al, 2018; Camp et al, 2020; Maire et al, 2021)。隨著核心微生物組的概念被提出(Turnbaugh et al, 2007),也逐漸應(yīng)用在珊瑚領(lǐng)域(Ainsworth et al, 2015;Lawson et al, 2018; Pootakham et al, 2021)。珊瑚的核心微生物組一般被定義為出現(xiàn)頻率30%～100%的微生物類群(Hernandez-Agreda et al, 2017), 核心的定義可以是對(duì)于幾種珊瑚共有的微生物類群而言, 也可以是對(duì)于某種珊瑚時(shí)間尺度上持續(xù)存在的微生物類群而言(Shade et al, 2012)。探尋不同屬蟲黃藻的藻際核心微生物群落具有重要的意義, 這些微生物可能對(duì)蟲黃藻提供關(guān)鍵功能。

近年來, 南海三亞灣鹿回頭海域珊瑚礁在人類活動(dòng)和全球變化的共同影響下, 覆蓋率已經(jīng)下降了70%左右(Zhao et al, 2012)。我國學(xué)者對(duì)該地區(qū)珊瑚共附生微生物進(jìn)行了大量的研究: Zhou 等(2011)對(duì)該區(qū)域44 種珊瑚的蟲黃藻類型做了詳細(xì)的調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)主要為C、D 型蟲黃藻; 李淑 等(2011)發(fā)現(xiàn)蟲黃藻密度整體呈現(xiàn)夏季低、冬季高的特點(diǎn); Li 等(2014)揭示了澄黃濱珊瑚的黏液、組織和骨骼的細(xì)菌群落的季節(jié)變化; 吳家法 等(2015)發(fā)現(xiàn)放線菌門、α—變形菌綱、γ—變形菌綱、厚壁菌門和擬桿菌門為四種珊瑚來源的主要菌群。然而, 尚未有文獻(xiàn)對(duì)該珊瑚礁區(qū)域分離的蟲黃藻進(jìn)行藻際細(xì)菌群落的系統(tǒng)分析。本研究對(duì)該區(qū)域珊瑚組織分離出的5 個(gè)屬的6株蟲黃藻進(jìn)行了離體培養(yǎng), 旨在研究不同株系蟲黃藻藻際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異, 并找出與蟲黃藻相關(guān)的核心細(xì)菌類群。

1 材料與方法

1.1 蟲黃藻純系藻株的獲得、培養(yǎng)、DNA 提取和測(cè)序

6 株蟲黃藻(表1)從中國海南省三亞鹿回頭海域(109°28′26″E, 18°12′43″N)的4 種珊瑚的骨骼表面組織中分離純化獲得。珊瑚樣本的初處理和蟲黃藻純系的獲取按照Yang 等(2020)描述的方法進(jìn)行。經(jīng)純化后的藻細(xì)胞置于裝有IMK 培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶,在鹽度 34‰、溫度 23℃、光照強(qiáng)度為 60μmol photons·m–2·s–1、明暗周期為14h:10h 的環(huán)境條件下培養(yǎng)。待指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取藻液離心去除上清液得到藻細(xì)胞, 使用E.Z.N.A.? HP Plant DNA kit (Omega Bio-Tek, USA)試劑盒提取基因組DNA。藻株的ITS2序 列 使 用 引 物 ITS intfor2 (5'—GAATTGC AGAACTCCGTG—3')和 ITS2 CLAMP (5'—GGG ATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT—3') (Qin et al, 2019)PCR 擴(kuò)增得到, PCR 產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。另外, 依據(jù)培養(yǎng)過程中蟲黃藻對(duì)玻璃基質(zhì)培養(yǎng)瓶的附著能力差異, 分為懸浮型蟲黃藻(SYSC-2-8、SYSC-14-11)和貼壁型蟲黃藻(SYSC-2-1、SYSC-17-3、SYSC-24-3、SYSC-28-9): 貼壁型蟲黃藻大部分藻細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部貼壁生活, 小部分存在于藻液中; 懸浮型蟲黃藻則絕大部分藻細(xì)胞懸浮生活, 幾乎無藻細(xì)胞貼壁。

表1 蟲黃藻藻株來源及分類信息Tab. 1 Source and taxonomic information of zooxanthellae strains

1.2 蟲黃藻分類鑒定

藻株的ITS2 基因型在非冗余蟲黃藻ITS2 數(shù)據(jù)庫Sym-ITS2 (http://sym-its2.marinegenomics.cn)進(jìn)行匹配得到(Shi et al, 2021)。再結(jié)合NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ITS2 序列比對(duì)的結(jié)果(Altschul et al, 1990)以及系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)蟲黃藻分類進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。系統(tǒng)發(fā)育分析所需的參考序列選自NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫中與本實(shí)驗(yàn)6株蟲黃藻相近的23 株蟲黃藻(A—E 型)的ITS2 序列,選擇甲藻Ansanella granifera作為外群。系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA X 軟件中的最大似然法構(gòu)建(Kumar et al, 2018), 使用Hasegawa—Kishino—Yano (HKY)模型計(jì)算, 可信度檢測(cè)1000 次, 并通過在線可視化工具(EvolView v3)進(jìn)行可視化(Subramanian et al,2019)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在純系藻株培養(yǎng)半年后開展, 期間定期將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基以保持蟲黃藻活性。此時(shí)蟲黃藻藻際細(xì)菌群落已經(jīng)穩(wěn)定, 且與蟲黃藻密切相關(guān)的細(xì)菌類群被保留下來(Behringer et al, 2018;M?nnich et al, 2020)。為了比較蟲黃藻不同株系微生物群落的差異, 取指數(shù)生長(zhǎng)期的6 株蟲黃藻培養(yǎng)至平臺(tái)期并收集藻液, 藻培養(yǎng)條件同上, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。參照Liu 等(2019)對(duì)顆粒粒徑的分類方法, 使用3μm 的孔徑將培養(yǎng)物藻液中的細(xì)菌分成兩類: 自由生細(xì)菌和顆粒附著生細(xì)菌。藻液用注射器擠壓的方式依次通過裝有3μm 和0.2μm 聚碳酸酯膜(PC, 25mm, Millipore, United States)的可更換膜過濾器(25mm, Whatman, UK), 并收集3μm 和0.2μm濾膜, 即3μm 和0.2μm 樣本。預(yù)實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證3μm 濾膜可完全截留所有的藻細(xì)胞, 因此3μm 濾膜上的細(xì)菌主要為藻液中附著藻細(xì)胞顆粒的細(xì)菌, 圖中標(biāo)記為“3μm”。0.2μm 濾膜上的細(xì)菌主要為自由生細(xì)菌,圖中標(biāo)記為“0.2μm”。對(duì)于貼壁型蟲黃藻(4 株), 還額外采集了沉底貼壁的培養(yǎng)物——Settling 樣本(將上層藻液倒盡后, 用無菌刀片刮取獲得), 圖中標(biāo)記為“Settling”, Settling 樣本的細(xì)菌主要附著在沉底貼壁的藻細(xì)胞上。0.2μm、3μm 和Settling 樣本代表著藻際細(xì)菌群落的三類細(xì)菌。所有樣本(n=48): 蟲黃藻的3μm 和0.2μm 樣本各6 株(n=36, 包含三個(gè)生物學(xué)重復(fù)), 以及4 株貼壁型藻的Settling 樣本(n=12, 包含三個(gè)生物學(xué)重復(fù)), 均液氮速凍儲(chǔ)存在–80℃冰箱直至DNA 提取。

1.4 DNA 提取和16S rRNA 基因測(cè)序

為避免試劑盒帶來的誤差, 所有樣本的DNA均使用DNeasy PowerSoil Kit (MoBio Laboratories,Carlsbad, CA)提取, 液氮速凍后立即儲(chǔ)存在–80℃冰箱中待分析。選擇 515FmodF-806RmodR 引物(Walters et al, 2015)對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因的V4 高變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增, 該過程在ABI GeneAmp?9700 (applied biosystems, thermofisher scientific)儀器上進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)包含 10ng DNA 模板、0.8μL 正向引物(5μmol·L–1)、0.8μL 反向引物(5μmol·L–1)、5×transStart FastPfu 緩 沖 液 4μL、0.2μL BSA、2μL dNTPs(2.5mmol·L–1)、0.4μL FastPfu Polymerase, 添加無核酸酶水(thermofisher)至總體積為20μL。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)PCR 重復(fù)。PCR 條件為: 95℃預(yù)變性3min,95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 30 個(gè)循環(huán), 72℃延伸10min, 產(chǎn)物最后在10℃保存。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上檢測(cè), 然后用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 回收290～310bp 的PCR 產(chǎn)物。用Quantus Fluorometer 定量后, 根據(jù)每個(gè)樣本的測(cè)序量要求, 將樣本按對(duì)應(yīng)比例混合。每個(gè)樣本的PCR純化產(chǎn)物的擴(kuò)增子文庫由 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit (Bioo Scientific, United States)按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備, 利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 16S rRNA 基因序列分析

16S rRNA 基因序列選擇QIIME2 v 2021.2(Bolyen et al, 2019)進(jìn)行分析, 具體步驟按Maire 等(2021)的方法進(jìn)行, 得到擴(kuò)增子序列變異(amplicon sequence variant, ASV)表及代表序列?；谂cSILVA 138 (Quast et al, 2013)數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因的 V4 區(qū)域 70%的相似性, 利用 featureclassifier 插件通過預(yù)先訓(xùn)練的樸素貝葉斯分類器進(jìn)行代表序列的注釋。過濾掉線粒體和葉綠體序列, 得到最后的注釋表。測(cè)序原始序列及處理過程見附表S1, 將樣本元數(shù)據(jù)文件、ASV 表、注釋表導(dǎo)入R 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)菌群落分析使用R 版本4.1.1 和phyloseq、vegan、ggplot2、tidyverse、indicspecies、yyplot、ggBubbles、VennDiagram、UpSetR 包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。對(duì)所有樣本序列進(jìn)行抽平(按照所有樣本中最小的序列數(shù))后, 每個(gè)樣本含有27069 條序列, 該深度足以捕獲樣本間的多樣性。選取 Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Pielou 指數(shù)作為α 多樣性指標(biāo), α 多樣性數(shù)據(jù)兩組間的差異用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。群落組成(β 多樣性)的差異使用Bray-Curtis相異矩陣計(jì)算, 整體差異的顯著性通過相似性分析(ANOSIM)進(jìn)行檢驗(yàn), 兩兩之間的顯著性則在整體差異顯著后用置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)進(jìn)一步確定, 使用多維尺度變換(non-metric multidimensional scaling, NMDS)進(jìn)行排序分析。16S rRNA 基因數(shù)據(jù)都具有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。物種組成分析時(shí)豐度取3 個(gè)重復(fù)的平均值作為結(jié)果, 其余需要統(tǒng)合分析時(shí)將至少在兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中出現(xiàn)的ASV 定義為該樣本的ASV 再進(jìn)行分析。參照Maire等(2021)對(duì)細(xì)菌核心屬的定義, 把存在于所有藻株的屬定義為核心屬, 得到A—E 型蟲黃藻的核心屬,以及3 種粒徑樣本各自的核心屬。

2 結(jié)果

2.1 蟲黃藻的分類鑒定

選取本實(shí)驗(yàn)中的6 株蟲黃藻的ITS2 序列和23株相近的蟲黃藻序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建(圖1)。結(jié)合蟲黃藻的 ITS2 基因型, 得到藻株的分類結(jié)果:SYSC-17-3 屬于Symbiodinium屬(A6 型, ITS2)、SYSC-28-9 屬于Breviolum屬(B1 型), SYSC-2-1 屬于Cladocopium屬 (C1 型 ), SYSC-24-3 屬 于Durusdinium屬(D1 型), SYSC-2-8 與SYSC-14-11 屬于Effrenium屬(E101 型), 用MEGA X 軟件進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)SYSC-2-8 和SYSC-14-11 的ITS2 序列相似度為100%。

圖1 基于ITS2 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML 法)本實(shí)驗(yàn)的6 株蟲黃藻用紅色字體標(biāo)注。Ansanella granifera 為外類群。支上的數(shù)字為1000 次自展支持率(%)。6 株蟲黃藻被分為貼壁型(SYSC-2-1, SYSC-17-3, SYSC-24-3, SYSC-28-9)和懸浮型(SYSC-2-8 和SYSC-14-11)Fig. 1 Maximum-likelihood phylogenetic tree based on ITS2 sequences. The six strains of zooxanthellae in this experiment are marked in red. Ansanella granifera is used as the outgroup. The bootstrap value (%) with 1000 replicates is shown above the branch. The six zooxanthellae strains are classified into anchorage-dependent living lifestyle (SYSC-2-1, SYSC-17-3,SYSC-24-3, SYSC-28-9) and free-living lifestyle (SYSC-2-8 and SYSC-14-11), as indicated in the pictures

2.2 蟲黃藻藻際細(xì)菌的多樣性和組成

序列抽平后共有629 個(gè)ASVs 進(jìn)入到之后的α和β 多樣性分析。所有樣本中古菌的序列占比均小于0.133%, 由于其相對(duì)豐度極低, 本研究中的以下結(jié)果將描述為“細(xì)菌群落”。

Chao1 指數(shù)可以指示物種豐富度, Pielou 指數(shù)反映群落中物種的均一程度, Shannon 指數(shù)則反映群落的整體多樣性。基于這3 種α 多樣性指數(shù)對(duì)這6 株藻的平臺(tái)期樣本細(xì)菌群落進(jìn)行比較, 兩兩之間顯著性差異采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)3μm 和0.2μm 樣本中貼壁型蟲黃藻細(xì)菌群落的Chao1 指數(shù)均顯著高于懸浮型藻(P＜0.05, 圖2a;P＜0.001, 圖2b),其Settling 樣本菌群的Chao1 指數(shù)也顯著大于懸浮型蟲黃藻的3μm 樣本菌群(P＜0.01, 圖2b、c)。這說明貼壁型蟲黃藻不論在自由生細(xì)菌(0.2μm)還是附著藻細(xì)菌(3μm 和Settling)物種豐富度均顯著大于懸浮型蟲黃藻。3μm 樣本中貼壁型蟲黃藻的Shannon指數(shù)也顯著高于懸浮型蟲黃藻(P＜0.01, 圖2h), 但這可能是由于Chao1 指數(shù)的巨大差異造成的, 因?yàn)镻ielou 指數(shù)無顯著差異。

圖2 6 株蟲黃藻藻際細(xì)菌群落的Alpha 多樣性(Chao1、Pielou、Shannon 指數(shù))包括所有蟲黃藻藻株的3μm 和0.2μm 樣本, 及4 株貼壁型藻的Settling 樣本。顯著性標(biāo)記***表示P＜0.001; **表示P＜0.01; *表示P＜0.05Fig. 2 The α diversity indices (Chao1, Shannon, Pielou) of phycosphere bacterial communities in six zooxanthellae strains,including 3 μm and 0.2 μm samples of all zooxanthellae strains, as well as “Settling” samples of four anchorage-dependent living algae. Significance code: ***, P ＜0.001; **, P ＜0.01; *, P ＜0.05

基于NMDS 分析發(fā)現(xiàn), 3 株貼壁型蟲黃藻(A、B、D 型)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似, 且按3 種粒徑的樣本聚類,而同為貼壁型的C 型蟲黃藻的細(xì)菌群落則明顯獨(dú)立于其他藻株。另外2 株懸浮型藻株(E 型)在NMDS 圖中位置相近, 說明二者具有類似的細(xì)菌群落。統(tǒng)計(jì)分析表明, 首先, 假設(shè)藻際細(xì)菌群落包含3μm、0.2μm 以及Settling 樣本(貼壁型蟲黃藻特有), 不考慮3 種樣本之間細(xì)菌比例影響, 則6 株蟲黃藻藻際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)整體之間具有顯著差異(ANOSIM,P=0.001); 其次, 除了3 株蟲黃藻(A、B、D 型)兩兩之間無明顯差異, 6 株蟲黃藻細(xì)菌群落兩兩之間均存在顯著差異(PERMANOVA,P＜0.05, “bh”法校正); 另外, 對(duì)于任意一株貼壁型蟲黃藻, 其3 種粒徑樣本整體上存在顯著差異(ANOSIM,P≤0.01)(圖3)。

圖3 基于Bray-Curtis 相異指數(shù)的蟲黃藻藻際細(xì)菌群落的非度量多維標(biāo)度(NMDS)分析ANOSIM 分析指示6 株蟲黃藻藻際細(xì)菌群落的整體差異Fig. 3 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis based on the Bray-Curtis dissimilarity among bacterial community of zooxanthellae. Three types of samples are represented by different shapes (circles for 0.2μm samples, triangles for 3μm samples, and squares for Settling samples). The ANOSIM analysis indicates the overall similarity among the six algal strains

依據(jù)與非冗余SILVA 數(shù)據(jù)庫比對(duì)得到的注釋結(jié)果, 對(duì)蟲黃藻不同株系3 種粒徑樣本的細(xì)菌群落進(jìn)行分析。在門水平上, α-變形菌(Alphaproteobacteria)在所有樣本中均占主導(dǎo)地位(>25%); 按0.2μm、3μm以及 Settling 的順序, α-變形菌占比逐漸降低,Myxococcota 門占比逐漸升高, 這說明不同菌群對(duì)自由生活或是附著生活的選擇不同; 不論是自由生細(xì)菌(0.2μm)或是附著藻細(xì)菌(3μm 和Settling), 懸浮型蟲黃藻的α-變形菌的比例均明顯高于貼壁型蟲黃藻, 而浮霉菌(Planctomycetes)和Myxococcota 門的相對(duì)豐度則顯著低于貼壁藻株(Mann—Whitney U testP＜0.01); 除藻株 14-11(＜1%)外, 擬桿菌門(Bacteroidota)在所有蟲黃藻樣本中均有一定的相對(duì)豐度(6% 38%)(圖4a)。在屬水平上, 所有藻株的0.2μm 和3μm 樣本均含有較高比例的大洋柄菌屬(Oceanicaulis, >9%)細(xì)菌, 但在貼壁型藻的Settling樣本中占比則極低(＜1%), 其更傾向于浮游生活。懸浮型蟲黃藻與貼壁型蟲黃藻在0.2μm 樣本細(xì)菌屬差異顯著, 除了共有的大洋柄菌屬(Oceanicaulis), 懸浮型蟲黃藻以拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia, >10%)和紅桿菌科未分類菌屬(UC Rhodobacteraceae, >22%)為主, 而貼壁型蟲黃藻主要以海命菌屬(Marivita,除藻株2-1 外豐度>57.17%)為主。我們對(duì)懸浮型蟲黃藻的主要附著藻細(xì)菌(3μm)與貼壁型蟲黃藻的主要附著藻細(xì)菌(Settling)進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)懸浮型蟲黃藻主要附著藻細(xì)菌類群為大洋柄菌屬(Oceanicaulis,>24%)、紅桿菌科未分類菌屬(UC Rhodobacteraceae,>12%)和海桿菌屬 (Marinobacter, >7%), 而貼壁型蟲黃藻的主要附著藻細(xì)菌為拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia, >15%)、nannocytastaceae 科未分類屬(UC nannocytastaceae, >6%)和Ekhidna(>11%)。貼壁型蟲黃藻的3μm 樣本菌群兼具了0.2μm 和Settling 樣本菌群的特征: 含有 0.2μm 樣本的大洋柄菌屬(Oceanicaulis)和海命菌屬(Marivita), 及Settling 樣本的拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)和nannocytastaceae科未分類屬(UC nannocytastaceae)。藻株2-1(C 型)的細(xì)菌群落似乎介于懸浮型藻與貼壁型藻的特征之間, 其Settling 樣本具有明顯的貼壁型藻株特征(主要菌群相似), 但 0.2μm 樣本菌群缺少海命菌屬(Marivita), 反而具有懸浮型藻株的優(yōu)勢(shì)菌群紅桿菌科 未 分 類 菌 屬(UC Rhodobacteraceae) 。 兩 株Effrenium屬的蟲黃藻雖然優(yōu)勢(shì)菌群相似, 但在嗜青霉屬(Algiphilus)、Pyruvatibacter屬、Owenweeksia等屬上具有顯著差異(圖4b)。

圖4 蟲黃藻藻際細(xì)菌群落在不同樣本中的組成a. 門水平的蟲黃藻藻際細(xì)菌群落物種組成, 在所有樣本中總相對(duì)豐度＜0.01%的屬歸為其他, 其中變形菌門細(xì)分為α-變形菌、β-變形菌和γ-變形菌; b. 屬水平的蟲黃藻藻際細(xì)菌群落組成圖, 相對(duì)豐度＜1%歸為其他Fig. 4 Zooxanthellae associated bacteria community composition profiles in different samples(3 μm, 0.2 μm, Settling). (a)Bacteria community composition profiles at phylum level. Relative abundance ＜0.01% was classified into others. Phylum Proteobacteria was subdivided into α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria. (b) Bacteria community composition profiles at genus level. Relative abundance ＜1% was classified into others

2.3 蟲黃藻藻際細(xì)菌群落之間的共享及核心群落的鑒定

為了減小雜質(zhì)ASVs 的影響, 將至少出現(xiàn)在兩個(gè)重復(fù)中的ASV 定義為該藻樣品的ASV。原本629個(gè)ASVs, 篩選過濾后得到120 個(gè)ASVs(19.1%)用于之后的分析。對(duì)于任意的一株藻: 其不同粒徑樣本中共享的ASVs 比例不低于75%, 3μm 樣本的ASVs數(shù)最多, 幾乎所有來自Settling 樣本的ASVs 都與3μm 樣本共享(圖5)。從藻株之間ASVs 的共享來看,所有藻株只共享4 個(gè)ASVs, 藻株2-1 含有最高比例的特有 ASVs(28.85%), 藻株 2-8 則沒有特有ASVs(圖6)。兩株藻之間共有的ASVs 占兩株藻全部ASVs 的比例范圍在12.33%～46.05%, 懸浮型藻和貼壁型藻同組內(nèi)部藻株之間的共享ASVs 占比較二者組間明顯更高(表2)。所有藻株均含有7 個(gè)屬的細(xì)菌: 川西氏菌(Henriciella)、拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、海桿菌屬(Marinobacter)、大洋柄菌屬(Oceanicaulis)、生絲單胞菌科未分類菌屬(UC Hyphomonadaceae)、紅桿菌科未分類菌屬(UC Rhodobacteraceae)和 nannocytastaceae 科未分類屬(UC nannocytastaceae), 它們代表了A—E 型蟲黃藻藻際核心細(xì)菌類群。之后, 我們比較了不同粒徑樣本各自的核心屬, 發(fā)現(xiàn)0.2μm 樣本和3μm 樣本的核心屬組成非常相似: 3μm 樣本總共6 個(gè)核心屬與0.2μm 樣本共享了5 個(gè), 且共享的屬豐度比例也極其接近。Settling 樣本核心屬與0.2μm 樣本和3μm樣本有較大的差異, 例如在大洋柄菌屬(Oceanicaulis)、海桿菌屬(Marinobacter)上豐度較小,而在拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、Reichenbachiella、假洪吉氏菌屬(Pseudohongiella)、OM182_clade、Ekhidna上擁有較高的豐度(圖7)。

圖5 蟲黃藻藻際細(xì)菌基于ASV 水平在不同樣本(3μm、0.2μm 和Settling)中的共享情況Fig. 5 Shared ASVs in different samples [3 μm, 0.2 μm and Settling (specific to anchorage-dependent living algae)] in each zooxanthellae strain

圖6 不同蟲黃藻細(xì)菌群落之間共享ASVs 的情況Fig. 6 The UpSet diagram showing the shared ASVs between different zooxanthellae strains

圖7 6 株藻0.2μm、3μm、Settling 樣本核心屬之間的比較四個(gè)不同顏色的區(qū)域塊對(duì)應(yīng)著四種類型的核心屬, 自上而下依次是: 0.2μm、3μm 和Settling 樣本的核心屬; 3μm 和Settling 樣本的核心屬; Settling 樣本的核心屬; 3μm 樣本的核心屬Fig. 7 Comparing the core genera in 0.2μm, 3μm, and Settling samples of 6 zooxanthellae strains. Four different colored area blocks correspond to 4 types of core genera, from top to bottom: core genera of 0.2 μm, 3 μm and Settling samples; core genera of 3μm and Settling samples; core genera of Settling samples; core genera of 3μm samples

表2 不同蟲黃藻株兩兩之間共享ASVs 比例Tab. 2 The ratio of shared ASVs between different zooxanthellae strains

3 討論

珊瑚共附生細(xì)菌群落的研究已有相當(dāng)豐富的史料, 但蟲黃藻與細(xì)菌之間的關(guān)系往往被忽視, 而珊瑚組織中的細(xì)菌群落中有一部分是與蟲黃藻密切相關(guān)的。我們的研究通過離體培養(yǎng)的方法把蟲黃藻與細(xì)菌聯(lián)系起來, 藻株包括了懸浮型和貼壁型蟲黃藻,涵蓋了5 個(gè)屬, 而類似研究并未包含Effrenium屬(Lawson et al, 2018; Maire et al, 2021)。同時(shí), 對(duì)藻株培養(yǎng)物3 種粒徑(0.2～3μm, 自由生活; >3μm, 附著于藻體或顆粒物; Settling, 沉底貼壁藻體上)的樣本進(jìn)行了細(xì)菌群落分析, 0.2～3μm 粒徑的細(xì)菌被認(rèn)為是自由生細(xì)菌, >3μm 粒徑的細(xì)菌被認(rèn)為是吸附藻或顆粒物的細(xì)菌(Grossart et al, 2005), Settling 樣本的細(xì)菌主要與沉底貼壁藻密切相關(guān)。

本研究的6 株蟲黃藻均分離自珊瑚組織。懸浮型藻株2-8 和14-11 為Effrenium屬蟲黃藻, 該屬蟲黃藻被認(rèn)為是營(yíng)自由生活的, 且目前僅有一個(gè)物種(Lajeunesse et al, 2018)。另外四株藻為貼壁型蟲黃藻:藻株17-3 為A6 型(ITS2), 目前該型只在硨磲組織中被發(fā)現(xiàn)或分離(Ishikura et al, 2004; Lajeunesse et al,2004); 藻株28-9、2-1、24-3 分別屬于B1、C1 和D1 型, B1、C1 和D1 型蟲黃藻均有被報(bào)道存在于珊瑚組織中(Garren et al, 2006; Zhou et al, 2012;Reichman et al, 2014; Ng et al, 2016; Gardner et al,2017)。對(duì)該區(qū)域珊瑚內(nèi)共生蟲黃藻的 ITS2 主要基因型進(jìn)行核查, 發(fā)現(xiàn)我們分離出的蟲黃藻類型往往不是珊瑚的優(yōu)勢(shì)類群, 如十字牡丹珊瑚的蟲黃藻主要是C1 型(Zhou et al, 2011), 但我們卻只分離出了B1 型蟲黃藻。海南島周邊叢生盔型珊瑚蟲黃藻類型主要是C、D 混合型(Zhou et al, 2017),但我們卻分離出了A 和E 型。這說明由于操作和培養(yǎng)的種種原因影響, 沒有達(dá)到預(yù)期的分離結(jié)果。藻株可能是珊瑚背景種或共附生于珊瑚。有研究指出珊瑚內(nèi)共生的蟲黃藻往往不可培養(yǎng)或難培養(yǎng),所以分離得到的常為易培養(yǎng)的藻株(Hirose et al,2008)。

本研究中的蟲黃藻藻際細(xì)菌群落的Chao1 和Shannon 指數(shù)顯著低于相關(guān)蟲黃藻離體培養(yǎng)的報(bào)道結(jié)果(Lawson et al, 2018; Camp et al, 2020)。這與分離培養(yǎng)的方法、藻株培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短等都有關(guān)。培養(yǎng)基、溫度等因素會(huì)影響藻和細(xì)菌的生長(zhǎng)(Sakamoto et al, 1997; Xiang et al, 2013), 分離時(shí)帶入的污染雜菌也會(huì)對(duì)蟲黃藻細(xì)菌群落造成影響; 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng), 在操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)水平上一部分細(xì)菌會(huì)丟失, 但在屬水平上仍能保持高度的保守性(>1a), 因此我們進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)從而得到蟲黃藻密切相關(guān)的細(xì)菌類群(Behringer et al, 2018; M?nnich et al, 2020)。另外我們發(fā)現(xiàn)Effrenium屬蟲黃藻的細(xì)菌物種豐富度要顯著低于其他屬, 該屬蟲黃藻被發(fā)現(xiàn)可以以藍(lán)藻(Synechococcusspp.)等細(xì)菌以及小型微藻為食, 這可能會(huì)降低其藻際細(xì)菌物種的相對(duì)豐富度(Jeong et al, 2012)。

我們的研究表明, 變形桿菌(α, γ)為蟲黃藻藻際環(huán)境的主要菌群(在3μm、0.2μm 和Settling 樣本豐度均>25%), 這與培養(yǎng)研究的結(jié)果相近(Lawson et al,2018), 但現(xiàn)場(chǎng)采集的珊瑚內(nèi)共生群落則放線菌相對(duì)豐度更高(Ainsworth et al, 2015)。這可能是由于原位環(huán)境并非只包括蟲黃藻一類生物, 因此原位采樣的結(jié)果并不能準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)蟲黃藻相關(guān)的細(xì)菌群落。我們發(fā)現(xiàn), 懸浮型和貼壁型藻株對(duì)細(xì)菌的選擇具有明顯差異: 拉布倫茨氏菌屬(Labrebzia)大量存在于懸浮型藻株的0.2μm 樣本中, 而貼壁型藻株中比例卻很小; 海命桿菌屬(Marivita)則基本只存在于貼壁型藻中。這不太可能是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化導(dǎo)致, 因?yàn)榕囵B(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本是過量的。最大可能是由于蟲黃藻分泌的有機(jī)物類型不同(Gordon et al, 2010),導(dǎo)致其形成了不同的藻際細(xì)菌群落。恰巧的是E 型蟲黃藻(懸浮型)被認(rèn)為是不可共生的, 而A—D 型蟲黃藻(貼壁型)被認(rèn)為是可共生的, 或許共生關(guān)系與藻際細(xì)菌也存在關(guān)聯(lián)。另外來自Effrenium屬的兩株藻2-8 和14-11 為同種蟲黃藻, 但分離自不同珊瑚, 其優(yōu)勢(shì)菌屬基本相似, 這表明細(xì)菌—蟲黃藻之間可能是物種特異性的(Eigemann et al, 2013;Krohn- Molt et al, 2017; Kimbrel et al, 2019), 并不隨珊瑚宿主改變。懸浮型蟲黃藻自由生細(xì)菌與藻附著細(xì)菌群落相似, 這與類似的藻研究結(jié)果一致(Eigemann et al, 2013)。但對(duì)于任意的一株貼壁型蟲黃藻, 其細(xì)菌群落3 種粒徑樣本整體存在顯著差異, 特別是自由生細(xì)菌和沉底貼壁細(xì)菌之間的差異。但造成這種差異的原因不是菌群的不同, 事實(shí)上3 種粒徑樣本之間共享了絕大部分的ASVs, 差異的ASVs 所占比例較小, 各菌群相對(duì)豐度的差異才是導(dǎo)致同株藻不同樣本細(xì)菌群落差異的原因。對(duì)于不同藻株之間的差異則可以用藻之間ASV 種類的差異來解釋, 兩株藻共享的ASVs 比例越高, 其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也越接近。

蟲黃藻藻際細(xì)菌中的川西氏菌(Henriciella)、拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、海桿菌屬(Marinobacter)、大洋柄菌屬(Oceanicaulis)、生絲單胞菌科未分類菌屬(UC Hyphomonadaceae)、紅桿菌科未分類屬(UC Rhodobacteraceae)和 nannocytastaceae 科未分類屬(UC nannocytastaceae)廣泛存在于本研究平臺(tái)期樣本以及過往研究的培養(yǎng)物中(Lawson et al, 2018;Camp et al, 2020; Maire et al, 2021), 表明它們可能是蟲黃藻藻際細(xì)菌的核心類群。但著色桿菌科未分類屬(UC Chromatiaceae)和Endozoicomonas這兩個(gè)比較常見的屬并未在我們的研究中發(fā)現(xiàn)(Neave et al,2017; Lawson et al, 2018)。拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)在懸浮型藻的自由生細(xì)菌和貼壁型藻的沉底貼壁樣本中聚集, 而先前的研究表明其傾向于依附藻生活(Maire et al, 2021), 其具有產(chǎn)生和分解DMSP 的能力(Curson et al, 2017), 并可能對(duì)蟲黃藻受脅迫下產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)具有清除作用(Sunda et al, 2002)。海桿菌屬(Marinobacter)被發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生一種低親和力的雙檸檬酸鐵載體vibrioferrin(VF)以提高蟲黃藻利用鐵的能力(Amin et al, 2009)。大洋柄菌屬(Oceanicaulis)在浮游細(xì)菌中比例較高, 其不僅參與合成維生素B,還能在寡營(yíng)養(yǎng)的條件下有效地吸收磷元素(Guidi et al, 2018), 可能作為蟲黃藻的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備長(zhǎng)期存在于藻際環(huán)境中。紅桿菌科是海洋環(huán)境最豐富的異養(yǎng)菌之一, 可占據(jù)海洋浮游細(xì)菌的20%, 對(duì)多種有機(jī)物進(jìn)行降解, 在生物地球循環(huán)中起到重要作用(Wagner-D?bler et al, 2006; Sharpe et al, 2020)。鼠尾菌屬(Muricauda, 6 株藻中4 株含有)能產(chǎn)生玉米黃素,一種具有清除活性氧(ROS)能力的類胡蘿卜素, 已知可增加蟲黃藻對(duì)光照和溫度的耐受程度(Motone et al, 2020)。此外, 令人驚訝的是在Effrenium屬的兩株實(shí)驗(yàn)藻株的3μm 和0.2μm 樣本中發(fā)現(xiàn)了可能存在于蟲黃藻胞內(nèi)的羅爾斯通菌屬(Ralstonia)。我們對(duì)6 株藻0.2μm、3μm 和Settling 樣本的核心細(xì)菌群落比較發(fā)現(xiàn), 0.2μm 和3μm 樣本的核心菌屬結(jié)構(gòu)相似,這與最近的一項(xiàng)研究結(jié)果基本一致(Maire et al,2021), 而與貼壁沉底樣本有較大差異, 這可能是因?yàn)?μm 和0.2μm 樣本細(xì)菌群落之間交互更密切。我們注意到3μm 樣本的細(xì)菌群落擁有最多的ASV 種數(shù), 它涵蓋了絕大多數(shù)自由生和附著生細(xì)菌類群。在珊瑚礁中, 游離的蟲黃藻會(huì)附著在珊瑚上參與鈣化過程(Frommlet et al, 2015), 因?yàn)楹Ｋ饔枚撾x附著的蟲黃藻可能會(huì)吸引一些其他的細(xì)菌, 最后再次附著在珊瑚上, 由此來增加珊瑚礁細(xì)菌群落的多樣性。

4 結(jié)論

本文以中國南海三亞鹿回頭海域分離的A—E型蟲黃藻進(jìn)行離體培養(yǎng), 通過采集三種不同粒徑樣本對(duì)其平臺(tái)期的細(xì)菌群落進(jìn)行比較分析, 并找尋蟲黃藻藻際細(xì)菌群落的核心類群, 獲得如下結(jié)論:

1) 貼壁型藻(A—D 型)具有比懸浮型藻(E 型)更具多樣性的細(xì)菌群落。兩種生活類型的蟲黃藻對(duì)細(xì)菌的選擇具有顯著差異, 如貼壁型藻的Myxococcota 門細(xì)菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于懸浮型藻, 但α-變形菌相對(duì)豐度則小于懸浮型蟲黃藻。

2) 懸浮型藻(E 型)的3μm 和0.2μm 樣本中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群相似, 而貼壁型藻(A—D 型)的三種粒徑樣本(3μm、0.2μm 和Settling)則表現(xiàn)出整體顯著差異。對(duì)于任意的一株藻, 不同樣本的ASVs 高度共享,且不同樣本細(xì)菌群落的差異主要是由于各組分細(xì)菌豐度差異導(dǎo)致, 而不同藻株藻際細(xì)菌群落差異則可以用細(xì)菌類群差異解釋。

3) 本實(shí)驗(yàn)的 A—E 型蟲黃藻的核心屬為Henriciella、拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、海桿菌屬(Marinobacter)、大洋柄菌屬(Oceanicaulis)、UC Hyphomonadaceae 、 紅桿菌科未分類屬(UC Rhodobacteraceae)、UC Nannocystaceae, 自由生與顆粒附著生的核心細(xì)菌群落很相似, 但與沉底貼壁樣 本有明顯差異。