李小紅，趙 雯，周鵬澤，周雪榮，馬雪靜，楊雯雯，田飛燕，王曉敏，3，4，5

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021； 2.澳大利亞聯(lián)邦科工組織 澳大利亞堪培拉 2600 3.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心 銀川 750021； 4.寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750021；5.寧夏設(shè)施園藝（寧夏大學(xué)）技術(shù)創(chuàng)新中心 銀川 750021）

番茄白粉病（Tomoto powdery mildew）是番茄生產(chǎn)中一種危害非常嚴(yán)重的世界性真菌病害，已成為制約番茄綠色生產(chǎn)的主要障礙[1]。該病害在我國(guó)最早發(fā)生于臺(tái)灣省，近年來(lái)我國(guó)遼寧、新疆、河南、臺(tái)灣等地相繼報(bào)道了該病害的發(fā)生[2-4]。隨著寧夏地區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)規(guī)模化效益顯著、種植面積的不斷擴(kuò)大，在露地和設(shè)施栽培中，番茄白粉病危害越來(lái)越嚴(yán)重[5]。白粉病主要發(fā)生在番茄生長(zhǎng)的中、后期，病原菌會(huì)通過(guò)侵染葉片，導(dǎo)致葉片布滿白色病斑，甚至枯萎，使番茄光合作用受到嚴(yán)重影響，對(duì)番茄果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量有很大影響，可造成番茄產(chǎn)量下降30%～50%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)[6-10]。

我國(guó)已經(jīng)報(bào)道能夠引起番茄白粉病的病原菌主要有蓼白粉菌（Erysiphe polygoniDC）、韃靼內(nèi)絲白粉菌（Leveillula taurica）和新番茄粉孢菌（Oidium neolycopersiciL.Kiss），屬于子囊菌亞門真菌，專性寄生菌，用培養(yǎng)基無(wú)法培養(yǎng)保存[11-13]。保存番茄白粉病病原菌主要有活體保存、葉片生根保存和離體葉片保存等方法，活體保存法保存時(shí)間最長(zhǎng)為80 d，需要注意隔離保存[14]。已報(bào)道對(duì)黃瓜白粉菌保存方法[15]最好的是二甲基亞砜保存，保存90 d 后病情指數(shù)為32.8%，且該方法能純化保存病原菌。因此，借鑒黃瓜白粉菌的保存方法對(duì)番茄白粉菌的保存方法進(jìn)行研究，旨在為番茄白粉菌的保存提供最佳的保存條件。

可靠的抗病性鑒定方法是抗病育種的基礎(chǔ)。鄭坤[14]系統(tǒng)地研究了番茄白粉病苗期抗病性鑒定的苗齡、孢子懸浮液濃度、接種方法，卻沒(méi)有考慮接種后保濕時(shí)間這一因素，且保濕時(shí)間是孢子萌發(fā)的重要因素，所以上述方法不是番茄白粉病抗病性鑒定的最佳方法。筆者擬通過(guò)對(duì)番茄白粉菌不同保存方法的研究，篩選出最佳的保存方法。采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，通過(guò)該方法對(duì)30份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行室內(nèi)苗期白粉病抗性評(píng)價(jià)，為有效開(kāi)展番茄白粉病防治與白粉病抗病育種提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 番茄白粉菌材料：選取寧夏銀川地區(qū)新番茄粉孢菌，配制成約1×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液，用刷葉法接種到健康的感病品種Moneymaker（MM）上擴(kuò)繁，并隔離保存。番茄品種：感病品種MM 用于抗病性鑒定方法研究。番茄種質(zhì)資源：由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜課題組與寧夏巨豐種苗有限責(zé)任公司共同收集的30 份番茄種質(zhì)資源，用于種質(zhì)資源抗病性評(píng)價(jià)。種質(zhì)資源信息詳見(jiàn)表1。

表1 30 份番茄種質(zhì)資源信息

1.1.2 儀器 奧林巴斯SC180 光學(xué)顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、5 mL 離心管、150 mL 噴壺、培養(yǎng)皿、載玻片。

1.2 方法

1.2.1 白粉菌保存條件篩選 于2021 年9 月在寧夏大學(xué)科技樓705 室采用低溫保存法、甘油保存法和二甲基亞砜保存法對(duì)番茄白粉病菌進(jìn)行保存，分別于不同時(shí)期（30、60、90 d）測(cè)定孢子的萌發(fā)率及病情指數(shù)，從而篩選出最佳的菌種保存條件。

低溫保存法：將干燥的孢子取等量分別裝入無(wú)菌離心管中，放置到不同溫度（4、-20、-80 ℃）下進(jìn)行菌種保存。甘油保存法：將干燥的孢子裝入干燥且無(wú)菌的離心管中并加入甘油至孢子完全浸沒(méi)，將孢子混合液置于-20 ℃放置24 h，再放入-80 ℃低溫冰箱中保存。二甲基亞砜保存法：將干燥的孢子裝入干燥且無(wú)菌離心管中并加入10%蔗糖（φ，后同）+12%甘油+7%二甲基亞砜+8%脫脂牛乳的混合液至孢子完全浸沒(méi)，將孢子混合液置于不同溫度（-20 ℃、-20 ℃放置24 h 后轉(zhuǎn)至-80 ℃、-80 ℃）下進(jìn)行菌種保存。分別以室溫保存和新鮮番茄白粉菌分生孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)為參照（CK1、CK2），采用水瓊脂平板法[16]測(cè)定孢子的萌發(fā)率，接種后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)，從而篩選出最佳的菌種保存條件。萌發(fā)率/%=已萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子數(shù)×100，病情指數(shù)（DI）=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)査總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）×100[17]。

1.2.2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法正交試驗(yàn) 2021 年10 月在寧夏大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)育苗溫室將試驗(yàn)材料MM 播種到98 孔穴盤，待幼苗生長(zhǎng)至2 葉1 心，移至育苗缽（18 cm×15 cm×13 cm）繼續(xù)緩苗，待幼苗長(zhǎng)至3、4、5 葉期進(jìn)行人工接種。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)番茄苗齡（A）、孢子懸浮液濃度（B）、接種方法（C）及保濕時(shí)間（D）4 個(gè)因素，進(jìn)一步優(yōu)化番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)種3 株番茄，試驗(yàn)小區(qū)面積為6.2 m2，株距為18 cm，行距為38 cm。設(shè)計(jì)因素與水平詳見(jiàn)（表2、表3）。

表2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定試驗(yàn)因素與水平

表3 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)

接種后觀察發(fā)病情況，25 d 后病害充分發(fā)生并穩(wěn)定，調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)：發(fā)病率/%=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100，病情指數(shù)（DI）=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)査總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）×100[18]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照鄭坤[14]的報(bào)道，具體如下：0級(jí)，不發(fā)??；1 級(jí)，葉片有粉斑，莖稈、葉柄無(wú)病斑；2級(jí)，葉片有粉斑，葉柄病斑≤5%，莖稈上無(wú)病斑；3級(jí)，葉片有粉斑，5%＜葉柄病斑≤30%，莖稈上無(wú)病斑；4 級(jí)，葉片有粉斑，葉柄病斑大于30%，莖稈上有病斑。

1.2.3 番茄種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性評(píng)價(jià) 選用1.2.2 中最優(yōu)的抗病性鑒定方法，在2021年12 月對(duì)30 份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行了抗病性鑒定分析，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，25 d 后調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。

抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)如下[13]：免疫（I），病情指數(shù)為0；抗病（R），病情指數(shù)在20.00 以下；中抗（MR），病情指數(shù)在20.01～40.00；感病（S），病情指數(shù)在40.01～60.00；極感?。‥S），病情指數(shù)在60.00 以上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄白粉病病原菌保存方法研究

由表4 可見(jiàn)，處理1 在30 d 時(shí)的病情指數(shù)與處理2 無(wú)顯著差異，與其他處理的孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)均存在顯著差異。處理1 在60 d 時(shí)孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)與其他8 個(gè)處理均有顯著差異，處理1 在90 d 時(shí)與處理6 無(wú)顯著差異，與其他7 個(gè)處理均有顯著差異。處理1 低溫保存法，保存條件4 ℃，在30 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)分別為44.20%和22.50；60 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)為39.60%和22.00；90 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)為27.50%和16.30。處理1 在對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)均高于除CK2 外的其他7 個(gè)處理。表明低溫保存法保存溫度為4 ℃是番茄白粉菌的最佳保存條件。

表4 番茄白粉菌不同保存方法研究

2.2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法篩選

由表5 可以看出，在不同接種方法處理25 d 后對(duì)番茄白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查，處理5 僅與處理9 無(wú)顯著差異，與其他7 個(gè)處理均存在顯著差異。處理5 的發(fā)病率為76.45%，病情指數(shù)為46.06，均高于其他8 個(gè)處理。因此，處理5 為最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，即接種苗齡為4 葉期、接種濃度為106個(gè)·mL-1、刷葉法、保濕時(shí)間為24 h。

表5 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法研究結(jié)果

2.3 30 份番茄種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性評(píng)價(jià)

30 份種質(zhì)資源白粉病抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6，30 份材料中，62850-1 病情指數(shù)最低，為19.85，為抗病材料；62754-1 病情指數(shù)最高，為62.11，是極感病材料；中抗材料有15 份，為62767-1、D6220G-1、62579- 1、62756- 1、62755- 1、62613- 1、62612- 1、62890- 1、62828- 1、62569- 1、63187- 1、63102- 1、63191-1、63022-1、63014-1；感病材料有13 份，為62615- 1、62640- 1、62865- 1、62758- 1、62765- 1、62764- 1、62763- 1、62760- 1、61972- 7- 1- 3- 16、62736-1、62749-1、62752-1、63052-1。

表6 30 份番茄種質(zhì)資源抗白粉病評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

番茄白粉菌屬于子囊亞門真菌，用培養(yǎng)基無(wú)法培養(yǎng)保存，不論是無(wú)性階段的分生孢子還是菌絲體，均無(wú)法在脫離活體寄主后長(zhǎng)期保持活力，而病原菌的長(zhǎng)期保存有利于對(duì)抗病、致病機(jī)制研究，加快抗病育種進(jìn)程[19-21]。筆者通過(guò)借鑒小麥白粉菌和黃瓜白粉菌的保存方法[15,22-24]，對(duì)比低溫保存法、甘油保存法和二甲基亞砜保存法與不同保存條件及2個(gè)對(duì)照共9 個(gè)處理后測(cè)定孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)，篩選番茄白粉菌最適宜的保存方法。筆者的研究結(jié)果明確了番茄白粉菌最適宜保存方法是低溫保存法（4 ℃），保存90 d 后檢測(cè)孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)，除低于對(duì)照新鮮孢子外，均高于其他保存方法。鄭坤[14]采用活體植株保存法、葉片生根保存法和離體葉片保存法3 種方法均可保存，其中活體植株保存法可保存時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)80 d，但受寄主植株生育期限制，需要隔離保存，較為麻煩。吳明藻等[22]和李中存等[23]對(duì)小麥白粉菌分別采用試管小苗培養(yǎng)保存、四圃純化白粉病保存，保存簡(jiǎn)單方便、時(shí)間長(zhǎng)、不易污染，缺點(diǎn)是保存菌量較少、不能為抗病育種提供足夠的病原菌?？灯贾サ萚15]研究黃瓜白粉病菌適宜的保存方法為10%蔗糖+12%甘油+7%二甲基亞砜+8%脫脂牛乳混合液保存法，在-20 ℃冰箱中保存效果較好，優(yōu)點(diǎn)在于脫離活體寄主進(jìn)行保存。但筆者的研究表明，該方法對(duì)番茄白粉菌的保存效果較差，沒(méi)有低溫保存法（4 ℃）效果好，這可能與白粉菌不同種屬、不同生理小種本身特性有關(guān)，需要對(duì)白粉菌的特性進(jìn)行進(jìn)一步研究。后續(xù)也可以在4 ℃保存的基礎(chǔ)上增加其他因素來(lái)研究白粉菌的保存時(shí)間是否更長(zhǎng)。

高效的抗病鑒定技術(shù)是篩選抗病種質(zhì)資源的重要手段?？共⌒澡b定方法與試驗(yàn)材料抗性、苗齡、接種方法、保濕時(shí)間等因素互相作用有關(guān)[24]。李成偉等[25]將孢子懸浮液濃度調(diào)至2×104個(gè)·mL-1，在番茄苗齡為4～5 片真葉時(shí)進(jìn)行噴霧接種。王聯(lián)德等[26]采用葉片摩擦法將孢子接種到4 葉期的感病番茄第一生長(zhǎng)葉片上，他們對(duì)接種方法沒(méi)有研究。鄭坤[14]以東農(nóng)714 為材料，通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)番茄白粉病苗期的抗病性鑒定方法進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明，接種方法為噴霧法、接種苗齡為4 葉期和接種孢子懸浮液濃度為106個(gè)·mL-1是最佳組合。筆者的研究結(jié)果表明，刷葉法和噴霧法均可作為番茄苗期室內(nèi)抗病性鑒定方法，其中刷葉法所需苗齡較小，孢子濃度低，可提前接種，噴霧法所需苗齡較刷葉法大，用菌量較大。與鄭坤[14]不同的主要原因有兩方面，一是用于抗病性鑒定的材料不同；二是增加了保濕時(shí)間這一因素，綜合考慮了苗齡、孢子濃度、接種方法及保濕時(shí)間4 個(gè)因素之間交互作用，更加系統(tǒng)全面地研究了番茄苗期白粉病抗病性鑒定方法。從30 份番茄種質(zhì)資源中篩選出1 份抗病材料和1 份易感材料，15 份中抗材料，13 份感病材料?？共〔牧虾透胁〔牧峡煞謩e用于番茄白粉病的抗病機(jī)制和致病機(jī)制研究，抗病材料也可用于抗病育種，但抗病材料太少。因此當(dāng)前最緊迫的工作是廣泛地從國(guó)內(nèi)外番茄種質(zhì)中心及野生種質(zhì)中收集抗源，為白粉病抗病品系選育提供材料。

筆者的研究結(jié)果明確了4 ℃是最佳的白粉菌保 存 條 件；4 葉 期，孢 子 濃 度 為1×106個(gè)·mL-1，采用刷葉法，保濕24 h 是最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定條件；最抗病番茄材料為62850-1。