劉夢麗，賀玉花，2，戶克云，孔維虎，2，張 健，2，徐永陽，2，趙光偉，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院三亞國家南繁研究院 海南三亞 572000）

甜瓜（Cucumis meloL.）是一種重要的經(jīng)濟作物，在生產(chǎn)中病害時有發(fā)生，病菌保存是開展病害研究的前提。然而，甜瓜的白粉病、霜霉病等病原菌屬專性寄生菌，必須進行活體寄生保存[1-2]。當前，對甜瓜白粉病、霜霉病病原菌的保存多采用幼苗不間斷接種保存，費時費工，接種成功率低。離體接種保存不僅操作方便、環(huán)境可控，能夠保證接種效率和成功率，還便于開展大規(guī)?？剐澡b定[3-4]。通過培養(yǎng)離體葉片來保存活性寄生菌是一種行之有效的方法[5-6]。離體葉片的生理活性是決定病菌保存時間的關鍵。因此，篩選離體葉片的持綠培養(yǎng)基，保持其生理活性，延長其持綠時間對于種質資源的抗性鑒定和病原菌保存都具有重要意義[7]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，含有苯并咪唑的培養(yǎng)基保存小麥離體葉段能夠使葉片較長時間保持綠色[5]。6-芐氨基嘌呤（6-BA）也有延緩小麥、蠶豆和牡丹等作物葉片衰老的作用[8-10]。激動素（KT）不僅可用于青菜的保鮮，還能夠延緩紅掌葉片的衰老[11-12]。在離體保存過程中，葉片的生理活性指標也會發(fā)生變化[13]。隨著時間的增加，植物離體葉片細胞活性下降，葉片變黃，葉綠素和蛋白質含量降低[14-15]。當植物的葉片施用細胞分裂素后，可增強其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，減少葉片中H2O2的積累，延緩衰老葉片中葉綠素的降解，顯著提高可溶性蛋白含量[10,16]。

筆者以B391 為試驗材料，從不同濃度苯并咪唑與6-BA 和KT 配比的培養(yǎng)基中，篩選出了25 ℃條件下甜瓜離體葉片最適的持綠培養(yǎng)基，以期為后續(xù)開展甜瓜抗病性研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021 年4－12月在中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所智能溫室和人工氣候箱內(nèi)進行，由中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所甜瓜遺傳育種課題組提供的高代自交系厚皮材料B391 為試驗材料。

挑選籽粒飽滿勻稱的種子浸種催芽，待種子發(fā)芽后播種于裝有基質的營養(yǎng)缽內(nèi)進行育苗，苗期進行一致的水肥管理及病蟲害防治。待幼苗長至4～5葉期時，取長勢一致、無病蟲害及損傷的第3 片真葉，帶回實驗室，用流動的水沖洗2 h，待用。

1.2 試驗設計與材料處理

參照前人研究[5，11，16]試驗共設4 個苯并咪唑質量濃度水平：100、75、50、25 mg·L-1；3 個6-BA 質量濃度水平：75、50、25 mg·L-1；3 個KT 質量濃度水平：30、20、10 mg·L-1。將苯并咪唑分別與6-BA 和KT 進行配比，如表1 所示，共設置24 個處理，以無菌水為對照（CK）。各處理溶液pH 值7.0 左右，滅菌（121 ℃，20 min）后備用。

表1 試驗設計的處理組合

在超凈工作臺上，吸取溶液4 mL 加入底部墊有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，做好標記，待用。將1.1中沖洗過的葉片，放入盛有酒精（50%）的燒杯中浸泡10 s 消毒，再用無菌水清洗兩遍后（注意動作輕緩，不要對葉片造成損傷），放置在無菌紙上擦干葉片表面的水分。用已滅菌的剪刀，在葉柄基部2～3 cm 處斜剪，再用無菌脫脂棉包裹，放入上述培養(yǎng)皿中，最后用封口膜封口，隨后置于人工氣候箱（溫度25 ℃，光照/黑暗為16 h/8 h，濕度80%）中進行培養(yǎng)。

1.3 測定指標與方法

篩選甜瓜離體葉片最適持綠培養(yǎng)基甜瓜離體葉片時，在處理后的0、5、10、15、20 d，每個處理分別取6 個甜瓜離體葉片，采用SPAD-502 葉綠素含量測定儀分別測定甜瓜葉片5 個點的SPAD 值（圖1），取其平均值。使用最適的持綠培養(yǎng)基培養(yǎng)甜瓜離體葉片，以無菌水為對照，處理后0、3、6、9、12、15、18 d，處理和對照分別取9 個甜瓜離體葉片測量葉片SPAD 值，取其平均值。3 個葉片混合后進行以下各個指標的測定，3 次重復，取其平均值。采用考馬斯亮藍G-250 法測定葉片蛋白質含量，采用95%乙醇浸泡比色法測定總葉綠素含量、葉綠素a含量、葉綠素b 含量，采用氮藍四唑方法測定SOD活性[17]。使用Abbkine 公司生產(chǎn)的Chekine 試劑盒測定葉片的POD、CAT 活性和H2O2含量，使用酶標免疫分析儀（SpectraMax i3x）進行讀數(shù)。

圖1 葉片SPAD 值的測量位置

1.4 數(shù)據(jù)處理

收集數(shù)據(jù)后，使用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)處理并作圖，使用GraphPad Prism 9.0.0 進行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 持綠培養(yǎng)基的篩選

結合葉片表型的觀察以及各時期SPAD 值的比較，由圖2 和表2 可知，甜瓜離體葉片在苯并咪唑與KT 培養(yǎng)基培養(yǎng)第20 天，處理13～24 的葉片都出現(xiàn)明顯發(fā)黃現(xiàn)象，且其SPAD 值都低于CK，表明苯并咪唑與KT 配比培養(yǎng)基不能使葉片持綠。在苯并咪唑和6-BA 培養(yǎng)基培養(yǎng)第20 天，處理1 和10的葉片SPAD 值低于CK，處理1 葉片發(fā)黃嚴重并伴隨著多處黃色斑塊，處理10 葉片出現(xiàn)多處黃色點狀斑塊，處理5 葉片整體黃化且葉脈明顯變黃，其余處理SPAD 值高于CK，表明苯并咪唑和6-BA配比培養(yǎng)基對葉片保持持綠有促進作用。其中處理6 的SPAD 值（24.55）最高，高于其他處理和對照，比CK 高36.16%，除了葉脈基部變黃，大部分葉片仍能保持綠色。最終，篩選出處理6 的培養(yǎng)基為甜瓜離體葉片最適的持綠培養(yǎng)基。

圖2 不同處理各時期的離體葉片表型

表2 不同處理各時期的離體葉片SPAD 值統(tǒng)計

2.2 持綠培養(yǎng)基對甜瓜離體葉片葉綠素含量、SPAD值和蛋白質含量的影響

由圖3 可以看出，隨著處理后時間的增加，甜瓜離體葉片的SPAD 值及總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、蛋白質含量都逐漸降低。甜瓜離體葉片在經(jīng)過最適持綠培養(yǎng)基處理后，在各個時期的所有測定值均高于或等于CK。在各個時期，處理組葉片的SPAD 值均顯著或極顯著高于CK。在第18 天時，對照葉片的SPAD 值降低了90.85%，處理葉片的SPAD 值降低了74.26%。在處理后第6 天，處理組葉片蛋白質含量比CK 高65.37%，兩者存在極顯著差異。由此可知，最適持綠培養(yǎng)基能夠延緩甜瓜離體葉片中葉綠素和蛋白質的降解，從而使甜瓜離體葉片能夠較長時間地保持活性，達到持綠的效果。

圖3 持綠培養(yǎng)基處理的離體葉片葉綠素含量（A、B 和C）、SPAD 值（D）和蛋白質含量（E）

2.3 持綠培養(yǎng)基對甜瓜離體葉片抗氧化酶活性和H2O2含量的影響

由圖4 可以看出，隨著處理時間的增加，甜瓜離體葉片的H2O2含量和POD 活性逐漸增加；SOD和CAT 活性均呈先升高后降低的趨勢，并在處理后第3 天達到最大值。與CK 相比，處理組葉片在各個時期的POD、SOD、CAT 活性均高于對照組，H2O2含量均低于CK。其中，在處理后的各個時期，處理組甜瓜離體葉片SOD 和POD 活性均顯著或極顯著高于CK。以上結果表明，最適持綠培養(yǎng)基能夠有效增強甜瓜離體葉片防御酶的活性，從而增強了甜瓜葉片清除H2O2的能力，達到葉片持綠的效果。

圖4 持綠培養(yǎng)基處理的離體葉片抗氧化酶活性（A、B 和C）和H2O2 含量（D）

3 討論與結論

葉片在離體情況下，會快速發(fā)生黃化，伴隨著體內(nèi)一系列生理生化變化[13]。研究表明，當培養(yǎng)基中含有一定濃度的苯并咪唑時，離體葉片能較長時間保持綠色[5]。外源施用6-BA 和KT，同樣有延緩葉片衰老的作用[18-19]。筆者從24 個不同濃度苯并咪唑與6-BA、KT 配比的培養(yǎng)基中，篩選出最適的持綠培養(yǎng)離體葉片的培養(yǎng)基為75 mg·L-1苯并咪唑＋25 mg·L-16-BA。與對照（無菌水）對比，最適的持綠培養(yǎng)基能夠有效增加葉片持綠時間，與前人研究結果一致。

葉片在黃化過程中，葉片內(nèi)積累大量的活性氧，對細胞膜造成破壞，細胞結構發(fā)生變化，通常伴隨著葉綠素和蛋白質降解，從而使葉片光合速率降低[14]。葉片內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)（POD、SOD、CAT）會及時清除體內(nèi)多余的自由基，能有效阻止體內(nèi)超氧陰離子自由基、H2O2、羥基自由基等的累積，防止膜脂的過氧化作用，延緩植物衰老，使植物維持正常的生長和發(fā)育[20]。葉綠素含量的多少能夠直接影響植物的光合效率，較高的光合速率能夠使葉片保持較高的活性[21]。在葉片黃化過程中，葉片內(nèi)蛋白質迅速降解，核酸合成減弱，進而加速葉片黃化，蛋白質含量也是評價葉片活性的重要指標[15]。噴施6-BA 能顯著延緩植物葉片的葉綠素含量下降，顯著提高葉片的可溶性蛋白含量，提高其SOD、POD和CAT 活性，減慢H2O2的上升速率，延緩葉片的衰老[10，22]。在筆者的試驗中，甜瓜葉片在黃化進程中，葉片SPAD 值和總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b 及蛋白質含量都逐漸降低，與前人研究結果一致。在甜瓜葉片黃化進程中，葉片SOD、CAT 活性先升高后降低，POD 活性逐漸升高，其變化與辣椒[13]葉片在衰老過程中的變化一致。

前人研究表明，用含有30 mg?L-1苯并咪唑的甘露醇培養(yǎng)基培養(yǎng)離體的甜瓜子葉，用來分離純化、保存甜瓜白粉病菌[23]。用含有50 mg?L-1苯并咪唑的0.5%瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)甜瓜離體葉片，用來接種白粉病菌，20 d 后葉片基本綠色，且葉片出現(xiàn)白粉病斑，用顯微鏡觀察，白粉病菌沒有受到污染，且孢子活性較強，適合接種[4]。由此看來，培養(yǎng)甜瓜離體葉片來保存病菌切實可行。

筆者從24 個處理中，篩選出處理75 mg·L-1苯并咪唑＋25 mg·L-16-BA 為甜離體葉片最適持綠培養(yǎng)基。與對照（無菌水）相比，該培養(yǎng)基能夠通過增強葉片保護酶（POD、SOD、CAT）活性，加強活性氧清除能力，減緩葉綠素和蛋白質的降解，使得甜瓜葉片在離體條件下能夠保持較長時間的活性，該處理能有效延緩葉片黃化，增加葉片在離體環(huán)境下的持綠時間，可用于提高病菌離體接種的準確性以及延長病菌的離體保存時間，這對探索甜瓜專性寄生菌理想的保存方法以及快速、準確、可重復地評價種質資源抗性具有重要意義，也可以為進一步的甜瓜抗性遺傳規(guī)律及基因定位的研究奠定基礎。