張博汝，魏 柏，石曉雅，謝夢麗

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430077)

結腸癌是全球癌癥高發(fā)病率和高病死率的主要原因之一，是男性人群的第三大最常見癌癥，女性人群的第二大常見癌癥，2018年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，結腸癌新發(fā)病例超過180萬例[1]。目前，結腸癌常規(guī)治療包括手術治療和化學治療，然而，手術治療不適合晚期已經(jīng)發(fā)生全身轉移的患者，而化學治療在殺傷腫瘤細胞的同時可能對患者產(chǎn)生多種毒副作用，因此，探索新的治療靶點對提高患者的生存率至關重要。生物鐘基因Bmal1 在不同腫瘤的發(fā)生、轉移及預后中的作用不同，其具有促癌作用或者抑癌作用。研究表明，生物鐘紊亂可增加結直腸癌患病的風險[2]，但Bmal1基因?qū)Y腸癌MC38細胞的增殖能力的影響及機制目前研究報道較少?；诖?，本研究通過體外細胞生物學和分子生物學實驗，觀察生物鐘基因Bmal1對結腸癌細胞增殖能力的影響及其相關的分子作用機制，以期為臨床結腸癌的診治提供可能的生物標志物和靶點，從而改善患者預后。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器結腸癌MC38細胞由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心饋贈。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列BI公司，胰酶和青霉素-鏈霉素溶液購自陜西白鯊生物科技有限公司，Bmal1小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)和陰性對照(negative control，NC)siRNA由武漢奇景生物科技有限公司合成，HiPerFect轉染試劑購自美國QIAGEN公司，細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自賽文創(chuàng)新生物科技有限公司，RNA 提取試劑TRIzol購自天根生化科技有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Bmal1、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒購自南京諾唯贊公司，放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation，RIPA)蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，兔GAPDH多克隆抗體、兔HIF-1α多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗購自武漢塞維爾生物科技有限公司，兔Bmal1多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔VEGF 多克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，CO2細胞培養(yǎng)和生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染將小鼠結腸癌MC38細胞接種于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基；選擇處于對數(shù)生長期的MC38細胞隨機分為對照組和Bmal1基因沉默組，并接種于6孔板內(nèi)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，按照HiPerFect轉染試劑說明書進行轉染，Bmal1基因沉默組細胞轉染Bmal1 siRNA，對照組細胞轉染NC siRNA。

1.2.2 CCK-8實驗檢測MC38細胞增殖能力取2組轉染后的MC38細胞，吸去6孔板中培養(yǎng)基，收集細胞懸液轉至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，使用1 mL完全培養(yǎng)液重懸，反復輕輕吹打細胞，取 10 μL 細胞懸液進行細胞計數(shù)，按每孔2×103個細胞接種于96孔板，每組設4個復孔，一共鋪3塊板，標記為板1、2、3，以細胞貼壁為0 h，取出板1，每孔加10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀在450 nm處測定每孔細胞吸光度值；并依次在培養(yǎng)24、48 h測板2、3每孔吸光度值，用吸光度值表示細胞增殖能力。實驗重復3次，取均值。

1.2.3 RT-qPCR法檢測MC38細胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF mRNA相對表達量取2組轉染后48 h 生長狀態(tài)良好的MC38細胞，采用TRIzol法提取細胞中總RNA，并使用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，使用RT-qPCR試劑盒檢測2組細胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF mRNA相對表達量，按照說明書進行PCR。GAPDH上游引物序列為5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物序列為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；Bmal1上游引物序列為5′-TGCCACCAATCCATACACAG-3′，下游引物序列為5′-TTCCCTCGGTCACATCCTAC-3′；HIF-1α上游引物序列為5′-AATGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游引物序列為5′-GTTCACAAATCAGCACCAAGC-3′；VEGF上游引物序列為5′-ACAACAAATGTGAATGCAGACCA-3′，下游引物序列為5′-GAGGCTCCAGGGCATTAGAC-3′。反應體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL；引物1.0 μL；50×ROX Reference DyeⅡ0.2 μL；cDNA 1.0 μL；dd H2O 2.8 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；融解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環(huán)10次。擴增結束后得到2組細胞Ct值，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算細胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.4 Western blot法檢測MC38細胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達量取2組轉染后48 h生長狀態(tài)良好的MC38細胞，加入細胞裂解液，提取細胞中總蛋白；采用 BCA 法測定蛋白濃度，分別取10 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠后轉膜至聚偏氟乙烯樹脂膜上，于質(zhì)量分數(shù)5% 脫脂奶粉中封閉 1 h。用Tris-HC1緩沖鹽溶液洗膜3次，每次10 min，分別加入兔抗小鼠Bmal1、HIF-1α、VEGF一抗(滴度均為11 000)，4 ℃過夜孵育;加入山羊抗兔二抗(滴度13 000)，室溫孵育1 h。使用電化學發(fā)光試劑顯影，應用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各個蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 2組細胞增殖能力比較結果見表1。細胞轉染后0 h，Bmal1基因沉默組與對照組細胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；細胞轉染后24、48 h，Bmal1基因沉默組細胞增殖能力顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 2組細胞增殖能力比較

2.2 2組細胞中Bmal1 mRNA和蛋白相對表達量比較結果見表2和圖1。細胞轉染后48 h，Bmal1基因沉默組細胞中Bmal1 mRNA和蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 2組細胞中Bmal1 mRNA和蛋白相對表達量比較

圖1 2組細胞中Bmal1蛋白表達

2.3 2組細胞中HIF-1α、VEGF mRNA相對表達量比較結果見表3。細胞轉染后48 h，Bmal1基因沉默組細胞中HIF-1α和VEGF的mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 2組細胞中HIF-1α和VEGF mRNA相對表達量比較

2.4 2組細胞中HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量比較結果見圖2和表4。細胞轉染后48 h，Bmal1基因沉默組細胞中HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 2組細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表達

表4 2組細胞中HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量比較

3 討論

在哺乳動物中，位于下丘腦視交叉上核的主時鐘和周圍組織的外周時鐘同步調(diào)控晝夜節(jié)律[3]。Bmal1基因作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白-PAS結構域轉錄因子成員之一，控制其他核心晝夜節(jié)律基因，維持機體正常的晝夜節(jié)律性，除調(diào)節(jié)生物節(jié)律性的作用外，還與細胞周期進展、增殖和凋亡有關[4]。然而，具體的調(diào)節(jié)作用機制尚未完全明確，有研究提出，Bmal1 基因在病理狀態(tài)下可以調(diào)控腫瘤壞死因子，進而調(diào)節(jié)p21表達并激活氨基末端激酶反應途徑，從而促進腸上皮細胞再生來取代受損的上皮細胞[5]。MOMMA等[6]研究報道，結腸癌腫瘤組織中Bmal1表達水平顯著低于癌旁組織，推測其低表達導致腸上皮細胞再生減少，從而促進結腸癌進展。程玉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bmal1基因表達可抑制SHH信號通路進而促進胃癌細胞的增殖，提示Bmal1基因在胃癌中是抑癌因素。本研究結果顯示，Bmal1基因沉默組細胞中Bmal1 mRNA和蛋白相對表達量顯著低于對照組，說明細胞Bmal1基因沉默成功；CCK-8實驗結果顯示，培養(yǎng)0、24、48 h Bmal1基因沉默組細胞增殖能力顯著低于對照組，這提示Bmal1基因在結腸癌MC38細胞系中具有促癌作用，沉默 Bmal1 基因后可以抑制結腸癌細胞的增殖能力。

研究表明，腫瘤細胞內(nèi)低氧狀態(tài)可以增強血管生成、促進糖酵解、增加細胞侵襲及細胞存活、有利于免疫逃避，最終導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移[8-10]。細胞通過缺氧誘導因子來感知和適應組織低氧環(huán)境，惡性腫瘤由于其快速增殖的特點，使腫瘤細胞長期處于低氧狀態(tài)，進而導致缺氧誘導因子表達水平增加。研究報道，缺氧區(qū)域的存在是影響腫瘤預后的獨立因素之一，如肺癌、胰腺癌、結腸癌等惡性腫瘤中 HIF-1α表達量增加，HIF-1α表達的變化和隨后的代謝組學變化對腫瘤細胞和生理功能產(chǎn)生影響，最終影響患者的預后[11-12]。血管生成使腫瘤在氧氣和營養(yǎng)供應不足的情況下繼續(xù)生長，HIF-α表達水平?jīng)Q定了血管生成的強弱程度，不同于正常組織中新形成的血管，新生血管在腫瘤微環(huán)境中是雜亂無序，這使腫瘤內(nèi)的缺氧程度更加明顯，使腫瘤易于轉移及擴散，同時也阻礙了免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用[13-14]。VEGF是血管生成的關鍵作用因子，HIF-lα可通過缺氧激活的磷脂酰肌醇-3-激酶/蘇氨酸蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信號通路來調(diào)節(jié)VEGF蛋白的合成[15]。研究顯示，體內(nèi)的缺氧反應是由生物鐘控制的[16]，缺氧微環(huán)境和晝夜節(jié)律基因表達紊亂密切相關，而HIF-1α是連接缺氧信號和生物鐘通路的關鍵調(diào)控點[17]。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)顯示，缺氧信號與晝夜節(jié)律之間相互干擾，這意味著HIF-lα可以調(diào)節(jié)生物鐘基因的表達，而晝夜節(jié)律基因也可以影響 HIF-lα。有研究顯示，在小鼠髓核細胞中發(fā)現(xiàn)Bmal1基因控制著HIF-lα的轉錄活性，一旦Bmal1被敲除，就會導致髓核細胞生長受限[18]。SOLECKI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達水平與Bmal1的表達水平呈正相關，且Bmal1通過E-boxes調(diào)節(jié)VEGF的轉錄。孫憲春等[20]研究發(fā)現(xiàn)，激活HIF-1α/VEGF信號通路可促進胰腺癌細胞的增殖和遷移能力；WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1可能通過 HIF-1α通路調(diào)節(jié)VEGE的表達從而參與人膠質(zhì)瘤細胞的血管生成，但是在結腸癌細胞中Bmal1和HIF-1α/VEGF通路之間的關系尚未見報道。本研究結果顯示，Bmal1基因沉默組細胞中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組，這提示結腸癌細胞Bmal1基因沉默將降低HIF-1α和VEGF的表達，并通過抑制HIF-1α/VEGF，信號通路來抑制結腸癌細胞的增殖能力，在結腸癌細胞中可能存在Bmal1基因與HIF-1α/VEGF信號通路調(diào)控的相關性。

綜上所述，結腸癌細胞中生物鐘基因 Bmal1可通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號通路影響結腸癌細胞的增殖能力，這為結腸癌的治療奠定一定的理論基礎；但是，有關調(diào)控結腸癌細胞增殖能力的其他分子機制尚有待進一步研究。