黃松殿 俞建妹 何樂祖 劉芳 沈遐 韋麗

小葉紅葉藤種子與種胚組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)

黃松殿 俞建妹 何樂祖 劉芳 沈遐 韋麗

（廣西壯族自治區(qū)南寧樹木園 廣西南寧 530031）

為探索野生小葉紅葉藤的馴化快繁技術(shù)，以野生小葉紅葉藤優(yōu)良單株種子為試驗材料，開展種胚外植體消毒、始芽誘導(dǎo)、擴繁、生根及移栽研究。結(jié)果表明：75%酒精處理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒10 min，外植體無菌率100%；增殖培養(yǎng)基以MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.30 mg/L，增殖率可達18倍；生根培養(yǎng)基1/3 MS+NAA 1.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L，生根率達97.59%；移栽基質(zhì)泥炭土與黃心土體積比為1∶5，組培生根瓶苗移栽成活率為95%。本研究為小葉紅葉藤組織培養(yǎng)和彩化種苗供應(yīng)提供參考依據(jù)。

小葉紅葉藤；組織培養(yǎng)；快繁技術(shù)

小葉紅葉藤[(Hook.et Arn) Planch)]，牛栓藤科紅葉藤屬植物，攀援灌木，多分枝，高1～4 m，產(chǎn)于福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)，生長于海拔100～600 m的山坡或疏林中[1]。小葉紅葉藤具有觀賞價值，其鮮紅色的嫩葉和果實具有非常好的景觀效果[2]，可用于營建彩籬、孤植木、園景點綴等景觀[3]；此外，小葉紅葉藤也是一種民間藥，其莖葉可用于清熱解毒、消腫解痛、止血，主治跌打腫痛，外傷出血等[4]；另外，該植物具有特殊的芳香氣味，在廣西壯族地區(qū)常用作清熱解毒、美容養(yǎng)顏、延年益壽的天然保健茶飲品[5]。小葉紅葉藤主要以野生為主，少有人工種植，為了更好地利用和開發(fā)此品種，快速大量地進行人工栽培，采用組織培養(yǎng)的方式進行馴化、繁殖，并推廣種植，利于園林景觀中彩化品種選擇及藥材的采集。植物組織培養(yǎng)育苗繁殖周期短、效率高，不受季節(jié)和氣候限制，可保持親本的優(yōu)良性狀，且生長整齊標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。針對小葉紅葉藤組織培養(yǎng)，呂華麗等[9]對小葉紅葉藤進行組培誘導(dǎo)研究,目前未見小葉紅葉藤芽苗組織培養(yǎng)及再生植株移栽的相關(guān)研究報道。本研究以野生小葉紅葉藤種子為外植體，通過種胚消毒滅菌及無菌苗培養(yǎng)、芽增殖、壯苗、生根和再生植株移栽，建立小葉紅葉藤的種胚組培快繁育苗體系，為其苗木的規(guī)?；a(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子來源于廣西南寧市南寧樹木園連山管理區(qū)闊葉林中的野生小葉紅葉藤。

1.2 方法

1.2.1 種子及種胚消毒滅菌方法 采摘6～8成熟的野生小葉紅葉藤種子，將其分成兩部分（種子+種胚）分別進行外植體消毒滅菌；把帶種皮與去掉種皮及假種皮后的種胚分別放入不同消毒劑中消毒（表1），隨后接種。每處理接種20瓶，每瓶接1粒種子或種胚，培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計污染情況。

表1 種子及種胚不同消毒滅菌的方法

1.2.2 激素對芽增殖的影響 將小葉紅葉藤種子和種胚消毒后分別接種于添加6-BA 0.1 mg/L、NAA 0.02 mg/L及無外源激素的MS始芽培養(yǎng)基中，觀察芽苗不定芽分化及生長情況。胚芽抽長生長快，在各種培養(yǎng)基中接種后5 d內(nèi)可抽長至3 cm，在添加外源激素的情況下，其子葉均帶腋芽，但腋芽抽長生長較慢；在不添加外源激素的情況下，胚芽在長至10 cm后會停止抽長且難以分化出不定芽。為了能誘導(dǎo)出不定芽，將抽芽剪至2～3 cm的單芽，分別接種于添加6-BA(0.1～ 1.0 mg/L)、NAA(0.02～0.60 mg/L)的MS增殖培養(yǎng)基中，每處理接種30瓶，每瓶接單芽5個，3個重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察統(tǒng)計芽增殖情況。

1.2.3 不同添加物對壯苗的影響 芽苗在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)黃化、落葉、芽苗枯死現(xiàn)象。為了解決這一問題，在培養(yǎng)基中添加酸水解酪蛋白（Casein hydrolysate）（簡稱CH）（20～100 mg/L）、防落素（學(xué)名4-氯苯氧乙酸，英文名4-Chlorophen-oxyaceticacid，齊云生物技術(shù)）（5～15 mg/L）、VC（10～20 mg/L）及核黃素（10～20 mg/L），分別進行不同濃度的試驗。每處理接種30瓶，每瓶接叢芽4個，3個重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察芽苗生長情況。

1.2.4 不同生根培養(yǎng)基對芽苗生根的影響 挑選頂芽葉片舒展、葉色翠綠、生長健壯、高3～4 cm的1～3個單芽或叢芽接種于生根培養(yǎng)基中。優(yōu)化生根培養(yǎng)基以1/3 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）及IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L），采用正交設(shè)計9（34）進行試驗。每種處理20瓶，每瓶9株（叢），3次重復(fù)，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計生根情況。

1.2.5 不同移栽方式對組培生根瓶苗移栽成活率的影響移栽場地為綠籬東邊區(qū)域，選用泥炭土與黃心土，按1∶5（∶）的比例攪拌均勻，分別起奎或裝進16 cm×16 cm的育苗杯中進行備用。組培生根瓶苗移栽2個月后統(tǒng)計成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法 試驗采用Excel 2017及SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式下種子及種胚脫毒情況

果皮易沾染真菌、細菌，且存在部分菌類侵入種皮，因此難以通過常規(guī)的消毒劑進行完全消毒。酒精消毒具有一定的穿透性，材料經(jīng)75%酒精處理后再用消毒劑處理，效果較好。小葉紅葉藤種皮表面附著物較多，種子經(jīng)消毒劑處理后無菌率最高為25%（處理4），見圖1。由于種子成熟度處于6～8成，種皮處于完全閉合狀態(tài)，種胚外還存在一層包裹嚴(yán)密的假種皮，種胚受菌類感染的可能性較小，在進行消毒處理時較容易清除附著在種皮及假種皮上的部分菌類，種胚無菌率較高可達100%（處理7，75%酒精處理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒8 min；處理9，75%酒精處理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒10 min）。未經(jīng)消毒劑處理的種胚，接種于始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第7天開始抽芽，而經(jīng)消毒劑處理的種胚在第13天開始抽芽（圖2-A），種子催芽失敗。由此可知，消毒劑對胚芽具有一定的損傷作用，導(dǎo)致其萌動時間有所延長；由于種子處于未完全成熟階段，且培養(yǎng)瓶中氧氣有限，一定程度限制了種子發(fā)芽。

圖1 不同消毒方式下種子及種胚脫毒情況

2.2 激素對芽增殖的影響

從表2可知，當(dāng)6-BA含量低于0.8 mg/L時，單芽芽苗增殖系數(shù)小于或等于10，其不定芽疏散，葉片大；當(dāng)6-BA含量達到0.8 mg/L以上時，芽苗增殖系數(shù)達到18以上，但隨著6-BA含量的增加，芽苗纖細，節(jié)間長，長勢快，同時隨著NAA含量的增加，會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)的過程中，由于激素含量相對高，芽苗分化及芽抽長長勢快，生長15～20 d后易出現(xiàn)黃化、落葉、芽苗枯死現(xiàn)象。培養(yǎng)基難以在30～35 d內(nèi)持續(xù)提供足夠的營養(yǎng)來滿足不定芽的伸長生長及木質(zhì)化需求，難以達到一周期一擴繁的目的，轉(zhuǎn)接周期短，成本相對高。因此，從壯苗擴繁及降低成本方面考慮，處理7號為芽苗增殖的最佳培養(yǎng)基，芽苗增殖情況見圖2-B。

A.胚芽抽長；B.增殖；C.黃化枯死；D.壯苗；E.生根苗；F.移栽成活苗（2個月后）。

表2 激素對芽增殖的影響

注：不同小寫字母表示差異達到顯著水平(<0.05)，下同。

2.3 不同添加物對壯苗培養(yǎng)的影響

為了使芽苗在一個周期內(nèi)達到足夠木質(zhì)化，避免一定的黃化、落葉及不定芽局部枯死現(xiàn)象（圖2-C），進行分段、分叢芽擴繁，在最佳繼代培養(yǎng)基中添加改良的藥劑，見表3。觀察處理6可知，芽苗在添加有不同藥劑的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2～3周，不定芽局部枯死或黃化現(xiàn)象可完全被控制，未出現(xiàn)芽苗整株枯死現(xiàn)象，大量落葉現(xiàn)象改善為偶有落葉，其叢芽健壯，枝繁葉茂，達到壯芽的要求，可用于生根（圖2-D）。可能原因是，CH是多種氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，加快了芽苗體內(nèi)的新陳代謝；VC是植物組織內(nèi)廣泛存在的高豐度小分子物質(zhì),具有延緩植物細胞衰老的作用；核黃素是酶輔因子黃素單核苷酸FMN和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的直接前體，廣泛參與植物代謝中的氫、氧與電子傳遞反應(yīng)，發(fā)揮著不可或缺的作用。

表3 不同添加物對壯苗的影響

2.4 不同生根培養(yǎng)基對叢芽苗生根的影響

從表4中可知，叢芽生根率在外源生長素正交設(shè)計9（34）各處理中呈顯著性差異。生根率大小依次為：處理6>處理5>處理7>處理8>處理9>處理4>處理3>處理2>處理1；處理4、處理7在第8天開始生根，處理8在第9天開始生根，處理5、處理6在第10天開始生根。從叢芽生根持續(xù)時間來看，叢芽在處理5、處理6中生根持續(xù)時間約為10 d，生根率均在90%以上，出根整齊，單叢生根量為3～8條，適合移栽和批量生產(chǎn)，便于管理。在其他處理中，芽苗持續(xù)生根時間在15～25 d，部分單叢生根量低于2條，不適合移栽。綜合以上情況可知，最佳的生根培養(yǎng)基為處理6（叢芽生根情況見圖2-E）。

表4 不同生根培養(yǎng)基對叢芽生根的影響

2.5 不同移栽方式對組培生根瓶苗移栽成活率的影響

在起奎及育苗杯中分別移栽200叢生根叢芽，在擺放區(qū)域條件、管理條件一致的情況下培育2個月后統(tǒng)計成活率。直接移栽在奎中的苗木成活率為75%，育苗杯中的苗木成活率為95%（圖2-F）?？赡茉蚴牵瑓惭扛荡謮?，基質(zhì)中縫隙較大，生長空間良好，且保水效果好；在奎中的基質(zhì)因為無固定邊界，在淋水時易發(fā)生位移，與叢芽根系形成空隙，不保水，導(dǎo)致根系易因缺水而死亡；育苗杯中的基質(zhì)因有固定圍合邊界，在淋水時水易下沉，且易與根系緊密結(jié)合，便于根系吸收水分與生長，促進苗木成活。因此，組培生根瓶苗宜使用育苗杯移栽。

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中常使用外源激素促進芽苗增殖，但在組培過程中常伴有黃化、枯死、玻璃化等現(xiàn)象，易導(dǎo)致試驗材料的浪費及延緩試驗進度。已有文獻[10-11]指出，玻璃化現(xiàn)象可通過培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)環(huán)境的改變來預(yù)防、控制與復(fù)壯。關(guān)于植物組織培養(yǎng)中黃化、枯死等不良現(xiàn)象的文獻報道較少，而關(guān)于玻璃化現(xiàn)象的文獻較多，其中針對芽苗不良現(xiàn)象，復(fù)壯方法采取較多的是改變pH[12-13]、激素配比[14]等，均能取得較好的效果。

本試驗中野生小葉紅葉藤種子成熟度處于6～8成，種胚處于完全密閉的空間內(nèi)，不受外界菌類侵染，無菌率可高至100%；其胚芽已發(fā)育完全，在接種后第7—13天開始抽芽，生長良好。將剪下的芽苗接種在含外源激素6-BA 0.8 mg/L、NAA 0.3 mg/L的增殖培養(yǎng)基中，可分化出的不定芽多且健壯。芽苗因增殖率高，對培養(yǎng)基營養(yǎng)元素的消耗也多，易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，或因營養(yǎng)供應(yīng)不上而出現(xiàn)黃化、落葉等現(xiàn)象。為了維持不定芽的健壯生長，在培養(yǎng)基中添加CH 100 mg/L、防落素15 mg/L、VC 20 mg/L及核黃素20 mg/L，可有效地改善芽苗生長情況，使叢芽健壯、枝繁葉茂。

本試驗中小葉紅葉藤叢芽在添加NAA 1.0 mg/L、IAA 1.5 mg/L及IBA 1.0 mg/L的改良MS生根培養(yǎng)基中，生根率可達97.59%，根系健壯，適合在育苗杯中移栽，移栽成活率可達95%。小葉紅葉藤芽苗在生根試驗中表現(xiàn)出叢生芽易生根，而單芽則出現(xiàn)生根難的現(xiàn)象。芽苗誘導(dǎo)出的不定根主要表現(xiàn)為愈傷根和皮部根，皮部根的維管束一般是與莖的維管束連通的，而愈傷組織形成的愈傷根與莖的輸導(dǎo)組織不連通。輸導(dǎo)組織不通是試管苗根系質(zhì)量的主要問題，也是限制移植成活的主要因子[15]。本試驗中的苗木移栽成活率為75%～95%，其不定根的種類需經(jīng)進一步的解剖分析。

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Seed and Embryo Tissue Culture and Propagation Technology of(Hook.et Arn)Planch

HUANG Songdian YU Jianmei HE Lezu LIU Fang SHEN Xia WEI Li

(Nanning Arboretum of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning, Guangxi 530031, China)

Exploring the domestication and rapid propagation technology of wild(Hook.et Arn)Planch, the fine single seed of wild(Hook.et Arn) Planch was used as experimental material to study explant disinfection, bud induction, propagation, rooting and transplanting . The results showed that the explants were treated with 75% alcohol for 30 s+1 ‰ HgCl2solution for 10 min, and the sterility rate was 100%. The proliferation rate could reach 18 times when MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.30 mg/L was used as the proliferation medium.The rooting rate was 97.59% when the rooting medium was1/3 MS+NAA 1.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L.The survival rate of rooting bottle seedlings was 95% when the ratio of peat soil and yellow soil was 1:5. This study, provide theoretical and reference basis for tissue culture and colorful seedling supply.

(Hook.et Arn)Planch; tissue culture; rapid propagation technology

S687

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.009

2022-02-25；

2022-03-30

黃松殿（1966—），男，本科，高級工程師，研究方向為森林培育、植物栽培、植物分類，E-mail：461454946@qq.com。

（責(zé)任編輯 林海妹）