劉雄盛 尹國平 肖玉菲 王仁杰 黃榮林 王勇

楓香基因的克隆及生物信息學(xué)分析

劉雄盛 尹國平 肖玉菲 王仁杰 黃榮林 王勇

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實驗室 廣西南寧 530002）

肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate 4- hydroxylase,C4H）是花色素苷合成過程第二步中的重要酶。以變色期楓香葉片為試驗材料，根據(jù)前期研究獲得的楓香葉片RNA-Seq數(shù)據(jù)庫中篩選的基因序列設(shè)計一對引物，利用RT-PCR技術(shù)克隆核苷酸序列，命名為；將基因上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得楓香基因的登錄號（OL871170），并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：楓香基因長度為1 551 bp，包含一個1 518 bp的完整開放閱讀框，編碼505個氨基酸；保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，基因編碼的蛋白包含一個p450家族蛋白的結(jié)構(gòu)域，分子量為58.00 kDa，理論等電點(diǎn)為9.13，為親水性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，存在多個磷酸化位點(diǎn)，無信號肽，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為-螺旋和無規(guī)則卷曲，基因在氨基酸水平與蓮?fù)葱宰罡撸?4.5%）；進(jìn)化分析結(jié)果表明，與青脆枝親緣關(guān)系相對較近。本研究成功克隆了楓香基因，并分析了的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能，對下一步利用基因工程技術(shù)進(jìn)行楓香葉色調(diào)控及新品種培育具有重要意義。

楓香；肉桂酸-4-羥基化酶；基因克隆；生物信息學(xué)分析

楓香(Hance)為落葉喬木，屬于金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香樹屬（）[1]。楓香木材紋理美觀，耐腐耐蟲，落葉量大，可兼用于食用菌產(chǎn)業(yè)，經(jīng)濟(jì)價值高，應(yīng)用前景廣闊，是我國優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹種；耐火力和適應(yīng)性強(qiáng)，天然條件下易更新，有荒山先鋒樹種之稱；樹干高大通直，枝葉繁茂，入秋后，其葉片顏色會由綠色變成紅色、紫色等，極具觀賞價值[2]，已成為優(yōu)良的城市景觀彩葉樹種。目前，國內(nèi)外對楓香葉色方面的研究多集中在葉色變化與葉片組織結(jié)構(gòu)[3]、花色素苷含量等生理基礎(chǔ)[4]及季節(jié)變化之間的關(guān)系[5-6]，而對于楓香葉片變色的分子機(jī)理及其關(guān)鍵基因的研究鮮有報道。

楓香葉色變化過程中起決定性作用的主要是花色素苷[7]，花色素苷合成需要很多酶參與。肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate 4- hydroxylase,）亦稱反式肉桂酸-4-單氧化酶（trans-cinnamate 4-monooxygenase）[8]，是花色素苷合成過程第二步中的重要酶。歸為亞家族，是細(xì)胞色素P450氧化酶家族成員之一[9]，因在植物次生代謝中具有重要作用，基因研究已獲得國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[10]。迄今，有關(guān)學(xué)者已從斑地錦（）[11]、膜莢黃芪（）[12]、滇水金鳳（I）[13]、白梨（）[14]、山葡萄（）[15]、芍藥（）[16]、青稞（）[17]、桂花（）[18]等50多種植物中克隆出基因，但有關(guān)楓香基因克隆及其相關(guān)特性的研究尚未見報道。

本研究以楓香無性系葉片為試驗材料，利用RT-PCR分離克隆其基因，并借助多種生物信息學(xué)軟件分析其序列，獲得其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性、系統(tǒng)發(fā)育等特點(diǎn)，為楓香花色素合成途徑中關(guān)鍵酶基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，對下一步應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行楓香的葉色改良及新品種的培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料采自廣西林科院森林經(jīng)營研究所苗圃，該圃地處南寧市郊，屬濕潤的亞熱帶季風(fēng)氣候。選用長勢優(yōu)良、變色效果良好的楓香優(yōu)良無性系葉片作為供試材料，用超純水將樣品洗凈后置于液氮中處理，然后儲存于–80℃超低溫冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa杭州公司）；質(zhì)粒提取和DNA凝膠回收試劑盒（美國Axygen公司）；瓊脂糖（美國海晉生物）；克隆載體pEASY?-T5 Zero、大腸桿菌trans1-T1（Transgen中國公司）；引物合成及測序委托上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1基因特異引物設(shè)計 根據(jù)楓香轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列，采用Blast分析其基因保守區(qū)，利用primer3 plus（http://www.primer3p lus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi），根據(jù)expasyTr- anslate tool（https://web.expasy.org/tran slate/）譯出的最長編碼區(qū)，在編碼區(qū)兩端設(shè)計引物：F（ATGGATCTTCTCCTCTTGGAGAAAA）/R（TCAAAAGGATCTCGGCTTTGCAACA）。

1.2.2 楓香葉片RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 以楓香葉片作為試驗材料，使用相應(yīng)試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，用合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，獲得cDNA樣品。

1.2.3 楓香基因PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板，對cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：模板2.0 μL+-F 1.0 μL+-R 1.0 μL+2×Taq PCR Master Mix 25 μL+ddH2O 21.0 μL。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸120 s，35個循環(huán)；72℃再延伸120 s。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行純化回收。

1.2.4 載體構(gòu)建 在16℃條件下，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans1-T1。挑取陽性克隆，用引物進(jìn)行PCR驗證并測序。

1.2.5 測序序列分析 分析預(yù)測開放閱讀框：NCBI ORFFinder；分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域：NCBI CD-Search；序列的相似性及同源性查找：NCBI Protein BLAST；預(yù)測理化特性：ExPASy ProtParam tool；預(yù)測編碼蛋白的疏水性：ProtScale；亞細(xì)胞定位：Euk-mPLoc 2.0；蛋白質(zhì)的N-磷酸化預(yù)測：NetPho 3.1；預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)：PSIPRED和SOPMA；同源三級結(jié)構(gòu)建模分析：SWISS- MODEL；跨膜結(jié)構(gòu)域分析：TMHMM Server 2.0；預(yù)測氨基酸信號肽：SignalP 4.1；序列同源性比較：DNAMAN軟件的Multiple Alignment；通過MEGA （version 7.0.26）軟件，采用相鄰連接法（neighbor- joining NJ，執(zhí)行參數(shù)為Bootstrap method 1000, Pairwise deletion）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 楓香LfC4Hb基因克隆

以楓香葉片材料中RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)前期研究轉(zhuǎn)錄組測序得到的（GenBank:OL871171）序列設(shè)計的特異引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后獲得了1條1 500 bp左右的條帶，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見明顯條帶（圖1-A），與預(yù)期大小一致。將PCR產(chǎn)物回收純化，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Trans1-T1），挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1-B所示。將陽性菌液進(jìn)行測序，所得基因和氨基酸序列見圖2。將基因測序結(jié)果與序列進(jìn)行核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)二者之間存在7個堿基差異（圖3），擴(kuò)增核苷酸序列與序列基本一致，序列相似度達(dá)到97.29%；7個堿基的變化僅引起了1個氨基酸的變化（圖4），氨基酸序列一致性達(dá)到99.8%，表明克隆得到的序列為楓香基因序列，將其命名為（GenBank: OL871170）。的cDNA序列全長為1 551 bp，其中5￠非翻譯區(qū)長15 bp，3￠非翻譯區(qū)長18 bp。

2.2 LfC4Hb保守結(jié)構(gòu)域分析

對基因編碼區(qū)進(jìn)行翻譯，發(fā)現(xiàn)其包含一個以ATG為起始密碼子、TAG為終止密碼子的完整開放閱讀框，長度為1 518 bp，共編碼505個氨基酸。對氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果（圖5）顯示，基因編碼的蛋白為多結(jié)構(gòu)域蛋白，序列中包含p450家族蛋白的結(jié)構(gòu)域。

A. 目的基因克?。?為目的基因）；B. 菌落PCR驗證陽性克?。?～8為陽性克?。?。

A. 目的基因cDNA序列；B. 目的氨基酸序列。

圖3 目的基因與LfC4Ha基因序列比對

圖4 目的基因與LfC4Ha氨基酸序列比對

圖5 LfC4Hb編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3 LfC4Hb蛋白理化性質(zhì)分析與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

對LfC4Hb蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LfC4Hb蛋白質(zhì)由505個氨基酸殘基組成，氨基酸序列的預(yù)測結(jié)果見表1。由表1可知，Leu、Lys、Val、Glu、Arg氨基酸的使用頻率相對較高，使用頻率依次為12.3%、7.1%、7.1%、7.1%、6.7%。LfC4Hb蛋白分子式為C2638H4173N715O724S16，原子總數(shù)為8 266，分子量為58.00 kDa，其中帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有70個，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有61個，理論等電點(diǎn)為9.13；LfC4Hb蛋白氨基酸殘基中以A17（3.156）疏水性最強(qiáng)，A196（–2.722）親水性最強(qiáng)，疏水性氨基酸的數(shù)量小于親水性氨基酸的數(shù)量，平均親水系數(shù)為-0.231（圖6），不穩(wěn)定指數(shù)為46.61，說明LfC4Hb蛋白為親水性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用Euk-mPLoc 2.0進(jìn)行在線亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，LfC4Hb蛋白為膜蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。LfC4Hb蛋白序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，LfC4Hb蛋白存在豐富的磷酸化位點(diǎn)，有潛在磷酸化位點(diǎn)35個（圖7）。

圖6 LfC4Hb蛋白氨基酸序列的親/疏水性分析

圖7 LfC4Hb蛋白氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，該蛋白具有20段-螺旋（Alpha helix）和9段-折疊（Beta turn）結(jié)構(gòu)（圖8），-螺旋占比為46.53%，無規(guī)則卷曲（Random coil）占比為34.46%，延伸鏈（Extended strand）占比為14.26%，-折疊占比為4.75%，說明該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為-螺旋和無規(guī)則卷曲。

運(yùn)用SWISS-MODEL對LfC4Hb進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模時發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)庫中匹配度最高的模板是6vby.1.A，建模區(qū)域32～502位氨基酸中序列一致性為76.91%，注釋為肉桂酸-4-羥基化酶即C4H蛋白。將LfC4Hb預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)（圖9）與6vby.1.A模板相比較，可見蛋白結(jié)構(gòu)組成、裝配形式基本一致，從蛋白三級結(jié)構(gòu)來推測，LfC4Hb可能具有與之類似的羥化酶活性，與預(yù)期相符。

2.4 LfC4Hb信號肽、跨膜區(qū)預(yù)測

蛋白質(zhì)的信號肽序列位于其N端，在蛋白質(zhì)后被切除，作用是指導(dǎo)分泌性蛋白合成，通常包含疏水核心區(qū)、信號肽N端和C端[19]。本研究分析了楓香LfC4Hb的信號肽序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列并不存在信號肽（圖10）。同時對的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，LfC4Hb蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖11）。

圖8 LfC4Hb編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

A. LfC4Hb編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)；B. 6vby.1.A模板。

圖10 LfC4Hb信號肽預(yù)測

圖11 LfC4Hb跨膜區(qū)預(yù)測

2.5 LfC4Hb蛋白的同源比對分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到其他植物基因的氨基酸序列，利用DNAman軟件進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明，楓香LfC4Hb蛋白與10個不同的植物均有較高的同源性。楓香基因在氨基酸水平與蓮（）同源性最高（94.5%），與青脆枝（）同源性為94.1%，與喜樹（）同源性為93.9%，與蒂羅花（）同源性為92.5%，與澳洲堅果（）同源性為91.7%，與紫竹（）同源性為91.3%，與蕓香唐松草（）同源性90.9%，與芍藥（）和雷公藤（）同源性均為90.7%，與大麻槿（）同源性為90.5%。分析還顯示，LfC4Hb蛋白含有P450超家族的特征序列：FGVGRRSCPG（血紅素結(jié)合域）和PPGPIPVG（富含脯氨酸的保守區(qū)域）（圖12），同時還具有CYP73A1的5個特征性底物結(jié)合位點(diǎn)（substrate recognition sites, SRS）：SRTRNVVFDTFTGKGQ MVFTVY（SRS1）、YNYGDFIPI（SRS2）、VENIN VAAIETTLWS（SRS3）、RMAIPLLVPHMNL（SRS4）以及KGGQFSLHI（SRS5）。

2.6 LfC4Hb蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選出與LfC4Hb氨基酸序列同源性較高的蛋白共9個，分別為芍藥（，AGG55322.1）、雷公藤（，XP_038693505.1）、蕓香唐松草（，KAF5177303.1）、青脆枝（，QNS29969.1）、蓮（，XP_010252045.1）、蒂羅花（，XP_043723676.1）、澳洲堅果（，XP_042501716.1）、紫竹（，XP_021297241.1）、大麻槿（，AGJ84133.1）。利用MEGA 7.0.26軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖13），發(fā)現(xiàn)楓香LfC4Hb蛋白與青脆枝親緣關(guān)系相對較近，與紫竹、大麻槿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

紅線方框. 富含脯氨酸和血紅素結(jié)合域的保守區(qū)域; 黑線方框. 底物結(jié)合位點(diǎn)（SRS1～SRS5）。

圖13 LfC4Hb系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝的重要途徑之一，對于植物的生長發(fā)育具有重要作用[20]。通常認(rèn)為，此途徑參與一系列生物反應(yīng)形成花色素苷，并由幾種酶共同參與完成催化[21]，而C4H是其中的關(guān)鍵酶之一，對基因的克隆與功能研究已有一些報道[14,22]。

本研究克隆得到的楓香基因cDNA全長序列，命名為；該基因編碼區(qū)存在一個長度為1 518 bp的完整開放閱讀框，共編碼505個氨基酸，與斑地錦[11]、龍血樹[23]一致?；蛳鄬Χ?，以小基因家族存在，是遺傳多樣性低、保守性較高的基因，杜仲（,Unigene9197）基因與川椒（ACF19421.1）、馬鈴薯（ABC69046.1）、紫草（, BAB71716.1）的C4H氨基酸序列相似性高達(dá)90%以上[24]，龍血樹與擬南芥的基因同源性亦達(dá)到92%以上[23]。本研究中基因在氨基酸水平與蓮、青脆枝、喜樹等的相似性也均高達(dá)90%以上，再次印證了植物中C4H蛋白具保守性這一結(jié)論。對LfC4Hb蛋白親水性分析發(fā)現(xiàn)，其為親水性的不穩(wěn)定蛋白，與榅桲C4H[25]蛋白一致。預(yù)測LfC4Hb蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其由無規(guī)卷曲、-螺旋、-折疊構(gòu)成，這與爬山虎、山葡萄等C4H蛋白二級結(jié)構(gòu)相同[15]，再次證明了為楓香的基因，且與已報道的基因的同源性極高。

本研究分離克隆了楓香的基因，豐富了基因資源，也為探討楓香苯丙烷類次生代謝途徑（包括黃酮類化合物生物合成途徑）奠定了一定的基礎(chǔ)，同時為楓香葉色新品種的培育提供了可操作基因。但楓香葉色的變化也受光照、溫度等條件的影響，這些因素是否影響基因的表達(dá)尚不明確。在開展下一步研究時，可在本研究基礎(chǔ)上探討楓香的轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因的作用以及表達(dá)特性，從而進(jìn)一步在分子層面揭示楓香葉片的呈色和變色機(jī)理，實現(xiàn)楓香的葉色調(diào)控。

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Cloning and Bioinformatics Analysis ofGene of

LIU Xiongsheng YIN Guoping XIAO Yufei WANG Renjie HUANG Ronglin WANG Yong

(Guangxi Forestry Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Superior Trees Resource Cultivation, Nanning, Guangxi 530002, China)

Cinnamate 4- hydroxylase() is the second important enzyme in anthocyanin synthesis. A pair of primers were designed based on thegene sequence screened from the RNA-Seq database ofleaves obtained in previous studies and then the nucleotide sequence ofwas cloned by RT-PCR and named. The gene was uploaded to GenBank database to obtain the gene login number (OL871170) of, and the bioinformatics analysis was conducted. The results showed that the length ofgene was 1 551 bp, which contained a complete open reading frame of 1 518 bp and encoded 505 amino acids. The conserved domain analysis showed that there was a p450 family protein domain. The molecular weight was 58.00 kDa and the theoretical isoelectric point was 9.13. The protein encoded bywas an unstable hydrophilic protein located in the endoplasmic reticulum. There were multiple phosphorylation sites,there was no signal peptide and no transmembrane domain. The secondary structure of the protein was mainly α -helix and random coil. The homology ofgene withwas the highest(94.5%).The phylogenetic analysis showed thatwas relatively close to.In this study,gene ofwas successfully cloned and the protein structure and function ofwere analyzed. It will be of great significance for further application of genetic engineering technology in leaf color regulation and breeding of new varieties of

; cinnamate 4- hydroxylase; gene cloning; bioinformatic analysis

S533

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.008

2022-02-24；

2022-03-21

廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實驗室自主課題（No.2019-A-03-02）；2021年自治區(qū)林業(yè)科技推廣示范項目（No.桂林科研[2021]26號）。

劉雄盛（1988—），男，碩士，副研究員，研究方向為森林培育，E-mail：517261654@qq.com。

王勇（1983—），男，碩士，副高級工程師，研究方向為森林培育，E-mail：742722538@qq.com。

（責(zé)任編輯 林海妹）