一、主要研究背景

周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致疼痛敏化現(xiàn)象。受損的初級(jí)傳入神經(jīng)釋放趨化因子、信號(hào)分子和蛋白酶激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)脊髓傷害性感受通路的興奮性。小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一系列與細(xì)胞表面受體結(jié)合的生物活性物質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)過(guò)程來(lái)增加神經(jīng)元活動(dòng)。這些物質(zhì)如何在不影響其他感覺(jué)形式的情況下特異性地敏化疼痛信號(hào)通路目前尚不清楚。既往對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞影響脊髓神經(jīng)元功能的研究主要集中在細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制。中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 細(xì)胞外基質(zhì)成分為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)支持，調(diào)控神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性，但其在調(diào)節(jié)脊髓傷害性感受通路中的作用尚不明確。神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)是CNS 中最重要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，由硫酸軟骨素糖鏈修飾的蛋白聚糖核心蛋白組成。在新皮質(zhì)中，PNNs選擇性地包裹快放電的小清蛋白陽(yáng)性的抑制性中間神經(jīng)元的胞體和近端樹突，通過(guò)調(diào)節(jié)突觸輸入和內(nèi)在興奮性來(lái)調(diào)節(jié)它們的神經(jīng)可塑性。該研究探討了PNNs 在脊髓的分布以及在調(diào)節(jié)傷害性信息的脊髓神經(jīng)元活動(dòng)中的作用。

二、主要研究結(jié)果

1. 脊髓I 層中的PNNs 圍繞投射神經(jīng)元

紫藤凝集素 (WFA) 可特異性結(jié)合PNN 糖蛋白的糖胺聚糖 (GAG) 側(cè)糖鏈，因此WFA 染色可以識(shí)別PNNs。此外，PNNs 也可以通過(guò)標(biāo)記其核心蛋白成分聚集蛋白聚糖來(lái)顯示。對(duì)脊髓切片的聚集蛋白聚糖進(jìn)行免疫染色顯示，PNNs 圍繞背角I 層大直徑神經(jīng)元的胞體，呈現(xiàn)出內(nèi)-外側(cè)方向。高分辨率共聚焦Airyscan 成像顯示，抑制性突觸前末端結(jié)構(gòu)位于PNNs 孔內(nèi)。將熒光金 (FG) 注入臂旁外側(cè)核 (LPb)的逆行追蹤顯示，脊髓I 層中的PNNs 選擇性地存在于脊髓-臂旁核投射神經(jīng)元附近，而在其他細(xì)胞類型周圍未發(fā)現(xiàn)。脊髓I 層中PNN 陽(yáng)性 (PNN+) 投射神經(jīng)元的胞體明顯大于PNN 陰性 (PNN) 投射神經(jīng)元或其他神經(jīng)元細(xì)胞類型。PNNs 稀疏分布在脊髓III 層，幾乎不存在于脊髓II 層中。在脊髓IV 和V層中，在抑制性 (Pax2+) 和興奮性 (Pax2', NeuN+) 神經(jīng)元周圍都發(fā)現(xiàn)了PNNs。將小鼠后爪暴露于機(jī)械（25 g 活頁(yè)夾夾30 秒）或熱（55℃水浴30 秒）傷害性刺激下，可誘導(dǎo)Fos 在脊髓I 層PNN+投射神經(jīng)元中的表達(dá)，表明這類神經(jīng)元參與編碼疼痛相關(guān)的信息。

2.周圍神經(jīng)損傷后PNNs 的變化

為了研究脊髓中的PNNs 是否在周圍神經(jīng)損傷后發(fā)生改變，研究團(tuán)隊(duì)利用小鼠構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷模型 (SNI) ，該模型的特征是在神經(jīng)損傷2～3 天后，小鼠的疼痛行為最為明顯。SNI 造模后第3 天，WFA 標(biāo)記PNNs 上的GAGs 在脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的豐度顯著降低（降低76.3%），在損傷后1周和2 周仍維持低水平；而聚集蛋白聚糖的豐度未受影響。在脊髓深層的PNNs 未顯示出明顯的WFA染色變化。

3.小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)PNNs 的降解

CD68 的免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SNI 第3 天，大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞（有67.1%）的溶酶體中出現(xiàn)WFA標(biāo)記的PNNs。在損傷后第1 周和第2 周，吞噬PNNs 的小膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯減少。為了研究小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷后PNNs 降解中的作用，該研究團(tuán)隊(duì)使用在小膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性表達(dá)白喉毒素受體(DTR) 的Cre 誘導(dǎo)型小鼠 (iDTR; TMEM119CreERT2)耗竭小膠質(zhì)細(xì)胞。在這些小鼠，周圍神經(jīng)損傷未引起機(jī)械痛敏，且在SNI 造模后第3 天，脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 沒(méi)有出現(xiàn)明顯減少，說(shuō)明未引起PNNs 的降解。為了進(jìn)一步證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞在PNNs 降解中的作用，使用缺乏CX3CR1 的小鼠，該受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和吞噬活性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，周圍神經(jīng)損傷后，Cx3crr′～型小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞的增生與對(duì)照小鼠相似，但其小膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體數(shù)量顯著減少，提示小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性減弱。同時(shí)，該基因型小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出疼痛過(guò)敏反應(yīng)，這與既往的實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致。在神經(jīng)損傷后，Cx3crr′～型小鼠未出現(xiàn)脊髓背角I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 的大量降解，并且在SNI 造模后第3 天檢測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞中的WFA 表達(dá)顯著減少。這些結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)周圍神經(jīng)損傷后的PNNs降解。

4.投射神經(jīng)元周圍PNNs 的降解介導(dǎo)疼痛相關(guān)行為

為了研究去除投射神經(jīng)元周圍的PNNs 是否會(huì)引起疼痛，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將rAAV2-Cre 注射到Acan 小鼠的LPb 核中來(lái)敲除投射神經(jīng)元中的聚集蛋白聚糖。rAAV2-Cre 逆向投射到LPb 核的神經(jīng)元并表達(dá)Cre 重組酶，這些神經(jīng)元包括脊髓I 層的投射神經(jīng)元。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，注射rAAV2-Cre 的Acari 小鼠脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 被破壞。正常小鼠在熱板實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)舔爪、跳躍等反應(yīng)，而注射AAV2-Cre 的Acania小鼠在熱板實(shí)驗(yàn)中舔爪/跳躍的潛伏期顯著縮短，特異性敲除脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍PNNs 后引起了熱過(guò)敏反應(yīng)。同時(shí)，小鼠面部疼痛表情量表評(píng)估顯示，去除PNNs 引起自發(fā)性疼痛。由于周圍神經(jīng)損傷減少PNNs 上的GAG而不影響聚集蛋白聚糖，并且既往方法靶向所有投射到LPb 核的神經(jīng)元，研究團(tuán)隊(duì)利用表達(dá)硫酸軟骨素酶(chABC)的AAV 選擇性去除腰脊髓投射神經(jīng)元周圍的GAG。ChABC 特異性消化PNNs 上的GAG，已廣泛用于研究PNNs 在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。通過(guò)共同注射兩種病毒載體：rAAV2-Cre 注射到LPb 核，Cre 依賴性方式表達(dá)chABC 的AAV(AAV9-DIOchABC)注射到腰脊髓，以實(shí)現(xiàn)腰段脊髓投射神經(jīng)元表達(dá)chABC。這種方法導(dǎo)致脊髓I 層上的PNNs 中的GAGs 被去除而不影響聚集蛋白聚糖的表達(dá)，也不影響深層PNNs 的結(jié)構(gòu)亦或是小膠質(zhì)細(xì)胞激活。行為結(jié)果顯示，腰脊髓投射神經(jīng)元中去除GAG 的小鼠在熱板實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生熱過(guò)敏反應(yīng)，并誘發(fā)自發(fā)性疼痛。

5.去除GAG 抑制脊髓I 層投射神經(jīng)元

既往對(duì)皮質(zhì)和海馬的研究表明，PNNs 調(diào)節(jié)突觸傳遞并影響神經(jīng)元內(nèi)在興奮性。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PNNs 降解促進(jìn)疼痛行為，促使他們研究去除PNNs的GAG 是否會(huì)增加脊髓背角I 層投射神經(jīng)元的活動(dòng)。

首先，研究通過(guò)量化抑制性 (VGAT+) 和興奮性(VGLUT2+) 突觸前的puncta 來(lái)評(píng)估PNN+投射神經(jīng)元上的興奮性和抑制性突觸輸入的數(shù)量。在PNN+投射神經(jīng)元的胞體上，VGAT+顯著多于VGLUT2+（多60%）。通過(guò)將AAV-chABC 注射到腰椎脊髓來(lái)消除PNNs 中的GAG 并沒(méi)有改變PNN+投射神經(jīng)元上興奮性和抑制性突觸前末端的數(shù)量。SNI 造模后第3 天，興奮性和抑制性突觸前末端的數(shù)量也保持不變。

為了研究GAG 去除對(duì)脊髓I 層投射神經(jīng)元的活動(dòng)的影響，使用全細(xì)胞膜片鉗記錄測(cè)量了離體脊髓片上這類神經(jīng)元的突觸輸入及其內(nèi)在興奮性。采用帶有LED 的傾斜紅外照明設(shè)備可識(shí)別并用膜片鉗記錄完整脊髓中被PNN 包圍的大直徑 (＞ 20 μm)且呈內(nèi)-外側(cè)方向的脊髓I 層神經(jīng)元。為了確認(rèn)這些神經(jīng)元周圍是否存在PNNs，將鉗到的細(xì)胞中注入染料Alexafluor488，然后進(jìn)行固定和蛋白聚糖免疫染色。用chABC 降解GAG 導(dǎo)致膜電位去極化(4.8±1) mV 和動(dòng)作電位放電頻率增加，而不會(huì)改變PNN+神經(jīng)元的膜電位和放電率，并且這種效應(yīng)是PNN+神經(jīng)元特有的。對(duì)自發(fā)微小突觸活動(dòng)的分析表明，chABC 降低了微小抑制性突觸后電流的頻率（mIPSC，減少48%），但不降低其幅度。此外，在存在突觸受體拮抗劑混合物（AP-5、DNQX、荷包牡丹堿和士的寧）以抑制興奮性和抑制性突觸活動(dòng)的情況下，PNNs 的降解對(duì)投射神經(jīng)元的被動(dòng)膜特性和內(nèi)在興奮性沒(méi)有影響。為了證實(shí)神經(jīng)損傷后PNNs 的破壞伴隨著抑制性輸入的減少，在SNI 造模后第3 天記錄了脊髓I 層PNN+投射神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)mIPSC 的頻率顯著降低。這種減少在小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭的小鼠中得到抑制，但可以通過(guò)用chABC 去除PNNs 來(lái)恢復(fù)。與這些結(jié)果一致的是，神經(jīng)損傷引起的自發(fā)性疼痛通過(guò)消除小膠質(zhì)細(xì)胞得到緩解，但能通過(guò)去除脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 來(lái)恢復(fù)。

三、討論

該研究表明在脊髓背角I 層存在一類投射到外側(cè)臂旁核的神經(jīng)元，可選擇性被PNNs 包裹。當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后，以小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性方式降解。PNNs 的降解足以通過(guò)減少抑制性突觸輸入來(lái)增強(qiáng)投射神經(jīng)元的活動(dòng)，并促進(jìn)疼痛行為。

在皮質(zhì)和海馬中，PNNs 主要存在于小清蛋白陽(yáng)性的抑制性中間神經(jīng)元周圍，而在脊髓背角中，PNNs 僅存在于脊髓I 層大直徑投射神經(jīng)元周圍，并在深層中圍繞各種神經(jīng)元類型。PNNs 在投射神經(jīng)元周圍的選擇性定位具有高度的特異性，使通過(guò)調(diào)節(jié)PNNs 來(lái)調(diào)節(jié)投射神經(jīng)元的活動(dòng)具有可操作性。由于投射神經(jīng)元是脊髓疼痛環(huán)路的主要輸出，因此通過(guò)降解周圍的PNNs 來(lái)激活投射神經(jīng)元是增加脊髓傷害感受環(huán)路輸出的一種特定且有效的機(jī)制。

突觸終末包埋于PNNs 中，因此PNNs 的組成和穩(wěn)定性對(duì)突觸活動(dòng)有重要影響。去除PNNs 中帶負(fù)電的硫酸鹽基團(tuán)可能導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定并降低突觸傳遞的有效性。小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)疼痛狀態(tài)。例如，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的KCC2 下調(diào)使胞內(nèi)氯增加并減少抑制性傳入，從而促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛。在神經(jīng)損傷后7 天，I 層和II 層多種細(xì)胞類型出現(xiàn)KCC2 的下調(diào)和氯的異常。在損傷后3天，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PNNs 降解選擇性地增強(qiáng)了一部分脊髓I 層投射神經(jīng)元的活動(dòng)。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞可能以不同的機(jī)制發(fā)揮作用，反映了神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制的復(fù)雜性和魯棒性，表明有效的治療應(yīng)該針對(duì)幾個(gè)過(guò)程來(lái)逆轉(zhuǎn)過(guò)敏反應(yīng)。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞參與介導(dǎo)慢性疼痛的性別差異已經(jīng)得到證實(shí)，但該研究發(fā)現(xiàn)PNNs 的小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性降解及其對(duì)突觸活動(dòng)和疼痛相關(guān)行為的影響在雌性和雄性中都存在。

綜上所述，該研究團(tuán)隊(duì)的工作揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后去抑制投射神經(jīng)元。這些發(fā)現(xiàn)提示靶向這個(gè)新機(jī)制可能是開發(fā)神經(jīng)病理性疼痛治療的新策略。