胡耀元，譚曉冬，李銳

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽 110004）

胰腺癌是最致命的腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。胰腺癌患者預(yù)后不良的主要原因是手術(shù)切除率低、對放化療敏感性差、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高。手術(shù)切除加圍術(shù)期化療是胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但療效不理想。由于胰腺癌組織中血液供應(yīng)不良和免疫抑制微環(huán)境，化療藥物難以在腫瘤內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度［2］。因此，開發(fā)有效的胰腺癌治療藥物刻不容緩。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）90抑制劑在體外具有抗胰腺癌活性。IPI-504是一種HSP90抑制劑，在水中高度溶解且耐受性良好，是一種有前途的癌癥治療藥物［3］。因此，探究IPI-504抑制胰腺癌進(jìn)展的機(jī)制對促進(jìn)其廣泛應(yīng)用十分必要。

本研究前期通過生物信息學(xué)分析篩選出IPI-504處理后上調(diào)且在胰腺癌組織中下調(diào)的LINC00312。研究［4-5］表明，LINC00312在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，但尚無研究報道其在胰腺癌中的作用。眾所周知，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）通過與mRNA競爭結(jié)合微RNA（microRNA，miRNA），調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因表達(dá)。本研究進(jìn)一步分析與LINC00312結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)let-7家族與LINC00312結(jié)合，且生物信息學(xué)分析顯示，let-7b-5p高表達(dá)的胰腺癌患者總生存率低。研究［6］表明，let-7b-5p在多種癌組織中表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。此外，let-7b-5p在胰腺癌患者血清中上調(diào)，可能作為胰腺癌診斷的依據(jù)［7］。LINC00312是否結(jié)合let-7b-5p并在腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用，目前尚無研究報道。此外，本研究前期還預(yù)測了let-7b-5p的下游靶基因，并篩選出在胰腺癌中下調(diào)且在IPI-504處理的胰腺癌細(xì)胞中下調(diào)的let-7b-5p下游靶基因，包括SVEP1、ADAMTS3、ADCY1和早期B細(xì)胞因子1（early B cell factor 1，EBF1）。EBF1是位于人類染色體5q34上的轉(zhuǎn)錄因子，研究［8］表明，其表達(dá)在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中下調(diào)，其敲低增加癌細(xì)胞活力和遷移，其在胰腺癌中的具體作用及機(jī)制有待進(jìn)一步分析。因此，本研究探究了IPI-504介導(dǎo)的LINC00312/let-7b-5p/EBF1軸對胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，并分析LINC00312、let-7b-5p和EBF1間的靶向關(guān)系，從而為探索胰腺癌診斷和治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。IPI-504購自美國MCE公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；總RNA提取、實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BCA試劑盒購自美國Thermo公司；EBF1抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標(biāo)儀購自上海中庸檢驗設(shè)備有限公司；qRT-PCR儀購自瑞士Roche公司；普通PCR儀購自美國ABI公司；全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過lncRNASNP2數(shù)據(jù)庫（https：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/）預(yù)測let-7b-5p與LINC00312的結(jié)合位點，通過ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測let-7b-5p與EBF1mRNA的結(jié)合位點。將PANC-1細(xì)胞分為LINC00312-WT+NC mimics 組、LINC00312-WT+let-7b-5p mimics組、LINC00312-MUT+NC mimics 組、LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics組、EBF1-WT+NC mimics組、EBF1-WT+let-7b-5p mimics組、EBF1-MUT+NC mimics 組和EBF1-MUT+let-7b-5p mimics組，按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LINC00312-WT+NC mimics 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含let-7b-5p與LINC00312潛在結(jié)合位點序列的野生型質(zhì)粒（LINC00312-WT）和NC mimics；LINC00312-WT+let-7b-5p mimics組轉(zhuǎn)染LINC00312-WT和let-7b-5p mimics；LINC00312-MUT+NC mimics 組轉(zhuǎn)染包含let-7b-5p與LINC00312潛在結(jié)合位點突變序列的突變型質(zhì)粒（LINC00312-MUT）和NC mimics；LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics組轉(zhuǎn)染LINC00312-MUT和let-7b-5p mimics；EBF1-WT+NC mimics 組轉(zhuǎn)染包含let-7b-5p與EBF1mRNA潛在結(jié)合位點序列的野生型質(zhì)粒（EBF1-WT）和NC mimics；EBF1-WT+let-7b-5p mimics組 轉(zhuǎn)染EBF1-WT和let-7b-5p mimics；EBF1-MUT+NC mimics 組轉(zhuǎn)染包含let-7b-5p與EBF1mRNA潛在結(jié)合位點突變序列的突變型質(zhì)粒（EBF1-MUT）和NC mimics；EBF1-MUT+let-7b-5p mimics組轉(zhuǎn)染EBF1-MUT和let-7b-5p mimics。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測相對熒光素酶活性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

PANC-1細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對照組、IPI-504組、IPI-504+敲減對照組、IPI-504+敲減LINC00312組、IPI-504+NC mimics 組、IPI-504+let-7b-5p mimics組和IPI-504+敲減EBF1組。對照組細(xì)胞不做處理；IPI-504組細(xì)胞加入終濃度1 μmol/L IPI-504處理48 h；IPI-504+敲減對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染敲減對照質(zhì)粒；IPI-504+敲減LINC00312組轉(zhuǎn)染敲減LINC00312質(zhì)粒；IPI-504+NC mimics 組轉(zhuǎn)染NC mimics；IPI-504+let-7b-5p mimics組轉(zhuǎn)染let-7b-5p mimics；IPI-504+敲減EBF1組轉(zhuǎn)染敲減EBF1質(zhì)粒。IPI-504+敲減對照組、IPI-504+敲減LINC00312組、IPI-504+NC mimics 組、IPI-504+let-7b-5p mimics組和IPI-504+敲減EBF1組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后24 h加入終濃度1 μmol/L IPI-504。加入IPI-504后24 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 qRT-PCR

取轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴(yán)格按照SYBR qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s循環(huán)反應(yīng)，40個循環(huán)。以GAPDH或U6為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計算LINC00312和EBF1mRNA或let-7b-5p的相對表達(dá)量。引物序列：LINC00312，正向5’-AAGCGAACCAAGC CAATA-3’，反向5’-CAAATCCCTGAAACTCTG-3’；EBF1，正向5’-AGCTTCTCTACAGCAATGGGAT-3’，反向5’-TGAGCAAGACTCGGCACATT-3’；GAPDH，正向5’-TCATTTCCTGGTATGACAACGA-3’，反向5’-GTCTTACTCCTTGGAGGCC-3’；let-7b-5p，正向5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGTG-3’，反向5’-GTG CAGGGTCCGAGGT-3；U6，正向5’-GTGCTCGCTTCG GCAGCACATATAC-3’，反向 5’-AAAAATATGGAAC GCTCACGAATTTG-3’。

1.5 CCK-8法

將各組細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后取出板，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8檢測液，37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.6 Transwell實驗

將各組細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于Transwell小室上室，向上室中加入無血清培養(yǎng)基，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出上室，PBS洗滌后加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min，PBS洗滌3次，結(jié)晶紫染色1 h，蒸餾水漂洗，倒置顯微鏡下觀察和拍照。

1.7 Western blotting

收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，煮樣，上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間的比較采用單因素方差分析，并采用Tukey事后檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00312與let-7b-5p以及l(fā)et-7b-5p與EBF1的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，let-7b-5p與LINC00312（圖1A）以及l(fā)et-7b-5p與EBF1mRNA存在結(jié)合位點（圖1B）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（圖1C、1D）顯示，LINC00312-WT+let-7b-5p mimics組與LINC00312-WT+NC mimics 組比較，EBF1-WT+let-7b-5p mimics組與EBF1-WT+NC mimics 組比較，PANC-1細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜ 0.05）；LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics組與LINC00312-MUT+NC mimics組比較，EBF1-MUT+let-7b-5p mimics組與EBF1-MUT+NC mimics 組比較，PANC-1細(xì)胞相對熒光素酶活性無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）。

圖1 LINC00312、EBF1 mRNA與let-7b-5p結(jié)合Fig.1 LINC00312 and EBF1 mRNA combined with let-7b-5p

2.2 IPI-504通過LINC00312影響胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移

qRT-PCR結(jié)果（圖2A）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞LINC00312表達(dá)顯著升高，let-7b-5p表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減LINC00312組PANC-1細(xì)胞LINC00312表達(dá)顯著降低，let-7b-5p表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）。

CCK-8結(jié)果（圖2B）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減LINC00312組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜ 0.05）。

Transwell結(jié)果（圖2C）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減LINC00312組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜ 0.05）。

圖2 IPI-504通過LINC00312影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.2 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through LINC00312

2.3 IPI-504通過let-7b-5p影響胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移

qRT-PCR結(jié)果（圖3A）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+NC mimics 組PANC-1細(xì)胞let-7b-5p表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+NC mimics組比較，IPI-504+let-7b-5p mimics組PANC-1細(xì)胞let-7b-5p表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）。

CCK-8結(jié)果（圖3B）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+NC mimics組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+NC mimics組比較，IPI-504+let-7b-5p mimics組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜ 0.05）。

Transwell結(jié)果（圖3C）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+NC mimics組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+NC mimics組比較，IPI-504+let-7b-5p mimics組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜ 0.05）。

圖3 IPI-504通過let-7b-5p影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.3 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through let-7b-5p

2.4 IPI-504通過EBF1影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移

Western blotting結(jié)果（圖4A）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞EBF1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減LINC00312組PANC-1細(xì)胞EBF1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）。

CCK-8結(jié)果（圖4B）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減EBF1組PANC-1細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜ 0.05）。

Transwell結(jié)果（圖4C）顯示，與對照組比較，IPI-504組和IPI-504+敲減對照組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜ 0.05）；與IPI-504組和IPI-504+敲減對照組比較，IPI-504+敲減EBF1組PANC-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜ 0.05）。

圖4 IPI-504通過EBF1影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.4 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through EBF1

3 討論

多種lncRNA參與胰腺癌進(jìn)展，如MACC1-AS1在胰腺癌組織中高表達(dá)且高表達(dá)患者生存率低，其沉默抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力［9］。LINC00976在胰腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，且與患者的不良生存率相關(guān)，其沉默在體內(nèi)和體外抑制胰腺癌的增殖、遷移潛力和侵襲性［10］。LINC00312是在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)的一個基因間lncRNA［11］。其過表達(dá)抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1并誘導(dǎo)G2～M細(xì)胞周期停滯，從而在肝細(xì)胞肝癌中發(fā)揮抑癌作用［12］。還有研究［13］發(fā)現(xiàn)，LINC00312在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)降低與腫瘤體積增加和晚期相關(guān)，LINC00312在體內(nèi)外均能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，LINC00312還能通過直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Y-Box結(jié)合蛋白1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)［14］。MIN等［15］發(fā)現(xiàn)，LINC00312在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，沉默LINC00312促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖。多項研究證實LINC00312在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，但目前尚無LINC00312在胰腺癌中作用的研究。本研究在體外驗證了IPI-504處理增加胰腺癌細(xì)胞LINC00312表達(dá)，且敲減LINC00312逆轉(zhuǎn)了IPI-504對胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明IPI-504通過上調(diào)LINC00312表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

眾所周知，lncRNA通過海綿化miRNA調(diào)節(jié)其靶基因表達(dá)。因此，本研究預(yù)測了與LINC00312結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)let-7b-5p與LINC00312結(jié)合。研究［6］表明，let-7b-5p在卵巢癌和前列腺癌中發(fā)揮促癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IPI-504處理降低胰腺癌細(xì)胞let-7b-5p表達(dá)，過表達(dá)let-7b-5p逆轉(zhuǎn)了IPI-504對胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明IPI-504誘導(dǎo)的LINC00312可能通過海綿化let-7b-5p抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移。進(jìn)一步分析let-7b-5p下游靶基因，發(fā)現(xiàn)EBF1mRNA與let-7b-5p存在潛在結(jié)合位點。本研究進(jìn)一步驗證LINC00312/let-7b-5p軸是否通過靶向調(diào)節(jié)EBF1表達(dá)發(fā)揮作用。EBF1是參與多種細(xì)胞譜系的分化和成熟的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，其基因缺失有助于B祖細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的耐藥性和復(fù)發(fā)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，IPI-504處理增加胰腺癌細(xì)胞EBF1蛋白表達(dá)，敲減LINC00312能夠降低IPI-504處理的胰腺癌細(xì)胞EBF1蛋白表達(dá)。此外，敲減EBF1逆轉(zhuǎn)了IPI-504對胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明IPI-504通過LINC00312/let-7b-5p/EBF1軸抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，IPI-504上調(diào)的LINC00312通過海綿化let-7b-5p上調(diào)EBF1表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，為IPI-504作為胰腺癌的潛在治療藥物提供了理論依據(jù)。