毛騰霄 黃曉婧黃敏陳紅?汪洋

（1.成都市藥品檢驗研究院， 四川 成都610045； 2.四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都610101）

大黃是廖科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］，含有多種化學(xué)成分，以蒽醌類衍生物為主。現(xiàn)代藥理學(xué)及臨床應(yīng)用表明，該藥材具有抗菌消炎的作用［2?3］。

中藥材一般有一定的微生物負載，故降低菌量是藥材在生產(chǎn)、加工過程中的重要目標之一。60Co?γ 滅菌法是近年流行起來的新型消毒滅菌方法，它在常溫下消毒滅菌而不破壞藥材中易揮發(fā)成分及熱敏性物質(zhì)，具有穿透力強、消毒均勻、快速等特點，目前已廣泛用于中藥材及其制品的滅菌［4?5］。目前，輻照滅菌所用劑量一般參照1997 年版《60Co 輻照中藥滅菌劑量標準》和2015 年版《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》要求執(zhí)行，前者規(guī)定中藥原粉能接受的輻照劑量不得過6 kGy，后者規(guī)定中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy。課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在實際操作時同一次輻照可能包括幾種不同的物品［6］，為了保證輻照后衛(wèi)生學(xué)指標都合格，一般選擇大劑量（10～15 kGy），個別品種甚至達到30 kGy，而且目前已有關(guān)于輻照引起中藥化學(xué)成分變化的報道［7?8］。本實驗?zāi)M企業(yè)常用輻照劑量，采用HPLC 法比較輻照前后大黃總蒽醌、5種游離蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）含量的變化，再以管碟法檢測輻照前后對金黃色葡萄球菌的抑制作用，旨在為今后研究其他中藥輻照工藝提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 唐古特大黃、掌葉大黃均購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都市藥品檢驗研究院中藥材市場質(zhì)量監(jiān)測研究重點實驗室鑒定為正品。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素（批號110795?201710）、大黃酸（批號110757?201607）、大黃素（批號110756?201913）、大黃酚（批號110796?201922）、大黃素甲醚（批號110758?201817）對照品及金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］均由中國食品藥品檢定研究院提供?？股貦z定用培養(yǎng)基Ⅰ（含胨5 g、牛肉浸出粉3 g、磷酸氫二鉀3 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，pH 7.9）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號200224?21）均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。0.9% 無菌氯化鈉溶液為自制，滅菌后備用。

1.3 儀器 Waters 2695 液相色譜儀（美國Waters 公司）；AEG 220 電子天平（日本島津公司）；ZY?300Ⅳ多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）。

2 方法

2.160Co?γ 輻照 唐古特大黃、掌葉大黃粉碎后過4 號篩，分裝于無菌袋中，在四川省輻照中心進行60Co?γ 輻照，劑量設(shè)置為0、5、10、20、30 kGy（其中0 kGy 是未輻照處理），分別平行處理2 次。輻照完成后，立即進行各項指標檢測。

2.2 總蒽醌、游離蒽醌含量測定 參照2020 年版《中國藥典》“大黃”項下［9］方法處理藥材，經(jīng)熱回流提取后過濾備用。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量至250 mL 量瓶中，適量甲醇溶解，定容，制成分別含五者18.3、22.9、20.0、20.0、11.2 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2.1 總蒽醌 取藥材粉末約0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL至燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 游離蒽醌 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Waters Bridge 十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇?0.1%磷酸（85∶15）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.3 抗菌活性研究

2.3.1 水提物制備 取藥材50 g 至三角瓶中，加500 mL水，精密稱定質(zhì)量，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后用文火再煮40 min，放冷，稱定質(zhì)量，加 水補足減失的質(zhì)量，3 000 r／min離心5 min，收集上清液并記錄其體積，旋轉(zhuǎn)濃縮至1 g／mL，即得。

2.3.2 試驗菌液制備 取金黃色葡萄球菌標準菌株適量，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，在33 ℃下培養(yǎng)20 h，0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1×104cfu／mL，即得。

2.3.3 測定方法 參照2020 年版《中國藥典》中的“抗生素微生物檢定法”制備雙碟，采用管碟法測定。取未輻照水提物，無菌水梯度稀釋成不同質(zhì)量濃度，各質(zhì)量濃度之間的劑距為0.8。測定1 批藥材時，取雙碟6只，各碟內(nèi)間隔的3 只牛津杯中滴滿未輻照的水提物，另3 只牛津杯中滴滿同一劑量輻照后的水提物，在36 ℃下培養(yǎng)16 h，取出，游標卡尺測定抑菌圈直徑，取平均值，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），抑菌圈直徑為縱坐標（Y）進行回歸，擬合量效關(guān)系方程。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，組間比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HPLC 指紋圖譜 將總蒽醌、游離蒽醌含量的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 年版）》，工作狀態(tài)選“分析檢驗”，以未輻照（0 kGy）藥材色譜圖為參照，設(shè)定多點校正、時間寬為0.1 進行全譜峰匹配，結(jié)果見圖1～2，相似度見表1。由此可知，4 個輻照劑量處理后與未輻照時2 種蒽醌HPLC 指紋圖譜的相似度均大于0.995，兩者峰高和峰形也無明顯差異。

圖1 輻照前后總蒽醌HPLC 指紋圖譜

圖2 輻照前后游離蒽醌HPLC 指紋圖譜

表1 相似度測定結(jié)果

3.2 總蒽醌、游離蒽醌含量 由表2 可知，輻照前后總蒽醌、游離蒽醌含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 輻照前后總蒽醌、游離蒽醌含量及抑菌圈直徑測定結(jié)果

3.3 相關(guān)成分峰面積 在總蒽醌HPLC 指紋圖譜中，唐古特大黃可標定出9 個共有峰，分別是T1～T9，而掌葉大黃可標定出9 個共有峰，分別是Z1～Z9；游離蒽醌HPLC 指紋圖譜中，唐古特大黃可標定出6 個共有峰，分別是Ta～Tf，而掌葉大黃可標定出5 個共有峰，分別是Za?Ze。將總蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關(guān)成分峰面積進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后采用配對樣本t檢驗，結(jié)果見表3。由此可知，當輻照劑量達到30 kGy時，唐古特大黃T6 峰與0、5、10、20 kGy 劑量時比較具有顯著差異（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 劑量之間無顯著差異（P＞0.05）；掌葉大黃Z2 峰與0、5、10、20 kGy 劑量時比較具有顯著差異（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 劑量之間無顯著差異（P＞0.05）。同法處理游離蒽醌HPLC 指紋圖譜，相關(guān)成分峰面積見表4，可知各輻照劑量處理后其峰面積無顯著差異（P＞0.05）。

表3 總蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關(guān)成分峰面積測定結(jié)果

表4 游離蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關(guān)成分峰面積測定結(jié)果

3.4 抗菌活性 輻照前唐古特大黃、掌葉大黃水提物的抑菌圈直徑見圖3，量效關(guān)系方程分別為Y＝0.447X＋16.45（R2＝0.985）、Y＝0.507X＋15.69（R2＝0.996），均在0.08～0.25 g／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在上述量效關(guān)系方程中選擇質(zhì)量濃度為0.16 g／mL，測定輻照前后抑菌圈直徑，結(jié)果見表2，可知均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 水提物抑菌圈直徑

4 討論與結(jié)論

輻照是一種有效的滅菌方法，雖然國家規(guī)定了中藥材的輻照劑量，但近年來發(fā)現(xiàn)實際運用中并未嚴格遵守。已有關(guān)于藥物經(jīng)較高劑量輻照后產(chǎn)生降解產(chǎn)物的報道［10?11］。由于藥材輻照劑量隨意擴大具有普遍性，故本實驗考察了在當前常用劑量下對大黃有效成分、相關(guān)成分以及抗菌活性的影響。以期為輻照應(yīng)用研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

大黃輻照前后總蒽醌和游離蒽醌HPLC 指紋圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析表明，主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量未發(fā)生變化（P＞0.05）。但當輻照劑量達到30 kGy時，總蒽醌含量指紋圖譜上唐古特大黃和掌葉大黃分別有一處有關(guān)成分峰響應(yīng)極顯著增大（P＜0.01），說明輻照劑量增加會引起相關(guān)成分發(fā)生變化，值得進一步研究。

金黃色葡萄球菌是引起人類組織器官感染的重要致病菌［12?14］，據(jù)文獻報道，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚均對其有抑制作用［15?16］。本研究在前期藥敏試驗時發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對大黃水提物最敏感，這與前人報道一致［17?18］，故選為抗菌活性試驗菌株。根據(jù)2020 年版《中國藥典》“中藥生物活性測定指導(dǎo)原則”，本研究采用劑量梯度試驗，找到了藥物濃度與抑菌活性量效關(guān)系的線性關(guān)系范圍，從而確定了可作為比較輻照前后活性變化的濃度點。測定結(jié)果表明，在所選輻照劑量下，大黃抗金黃色葡萄球菌活性未發(fā)生變化。

由于輻照滅菌應(yīng)用于中藥的歷史短，基礎(chǔ)研究尚需不斷完善，本研究僅考察了輻照前后大黃主要化學(xué)成分含量、相關(guān)成分和抗菌活性的變化，今后還應(yīng)進一步對輻照敏感的成分進行鑒定分析，在穩(wěn)定性等方面展開研究以保證用藥安全。