高彥琳 陳厚良趙勝 孫志勇 李天宇王嬋成威?

（1.安徽省第二人民醫(yī)院心內(nèi)科， 安徽 合肥230000； 2.合肥市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科， 安徽 合肥230000）

心力衰竭為臨床常見的心血管疾病，心室重構(gòu)和舒張功能障礙為心力衰竭的標志，心力衰竭可導(dǎo)致心肌細胞肥大、凋亡以及增加心肌細胞炎癥的表達和內(nèi)皮功能障礙等［1?2］。盡管治療心力衰竭口服藥物已取得顯著進展，但其副作用仍無法忽視，因此，尋找天然藥物治療心力衰竭，減少副作用，以及對疾病更深一步的機制探討，具有重要意義［3］。

白藜蘆醇是一種來源于虎杖的多酚成分，具有廣泛的生理功能，包括保護心臟、抗血小板聚集和抗炎等特性［4?5］。已有多項研究證實，白藜蘆醇在心肌缺血再灌注損傷、心肌梗塞、心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的動物模型中具有保護作用［6?9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可減少心力衰竭的心室重構(gòu)和心功能功能惡化［1］，但是其對心力衰竭心臟保護作用的具體機制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過各種數(shù)據(jù)庫搜集數(shù)據(jù)進行分析，并利用計算機模擬構(gòu)建一個多級網(wǎng)絡(luò)，進一步分析藥物、疾病和靶點之間的聯(lián)系［10?11］。因此，本實驗利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證研究白藜蘆醇治療心力衰竭的作用靶點，分析其相關(guān)靶點生物學(xué)途徑，有利于更深一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇和心力衰竭靶點的獲取 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺［12］（TCMSP）（http：／／tcmspw.com／）、phrammapper［13］（http：／／www.lilab?ecust.cn／pharmmapper／）和SwissTarget［14］數(shù)據(jù)庫，以“resveratrol”為關(guān)鍵詞檢索白藜蘆醇中的作用靶點，靶點通過UniProt校對。通 過CTD［15］（http：／／ctdbase.org ）、GeneCards［16］（https：／／www.genecards.org／）和DisGeNET［17］數(shù)據(jù)庫，以“heart failure”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因。

1.2 白藜蘆醇和心力衰竭交集靶點蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將白藜蘆醇和心力衰竭篩選靶點上傳韋恩圖網(wǎng)站（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／），獲取交集靶點，進 一步通過STRING 數(shù)據(jù)庫［18］（https：／／string?db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，分析獲取關(guān)鍵靶點。

1.3 交集靶點的富集分析 通過R 語言對交集基因進行GO 和KEGG 分析，進一步了解白藜蘆醇治療心力衰竭的生物過程、分子功能、細胞組成以及關(guān)鍵通路。

1.4 白藜蘆醇與關(guān)鍵靶點的分子對接 從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)蛋白分子結(jié)構(gòu)，PubChem 得到白藜蘆醇的詳細分子結(jié)構(gòu)，將蛋白和白藜蘆醇結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol 2.4.0 和Auto Dock 軟件［19?20］，進行分子對接，利用Pymol 獲取相關(guān)詳情信息。

1.5 試劑與藥物 白藜蘆醇（純度≥99%，美國Sigma 公司）。p?AKT、Akt、Bad、Bcl?2、caspase?3 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、β?actin 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；TRIzol、cDNA 試劑盒、RT?qPCR 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）；CCK8 試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司）。

1.6 分組、給藥與造模 將大鼠心肌細胞H9c2（貨號CL?0089，武漢普諾賽生命科技有限公司）均勻接種于96 孔板，每孔約1×104個細胞，分別給予0、12.5、25、50、75、100、150、200 μmol／L 白藜蘆醇干預(yù)4 h，CCK?8 實驗篩選得到藥物最佳濃度。細胞分為正常組、白藜蘆醇組、心力衰竭組和心力衰竭＋白藜蘆醇組，將細胞培養(yǎng)48 h后，使用無血清DMEM 換液，進行同步化處理12 h，各藥物干預(yù)組更換為提前配置好的白藜蘆醇（無血清配置），干預(yù)4 h后進行心力衰竭細胞造模［21?23］，PBS 沖洗殘留的白藜蘆醇，心力衰竭組和心力衰竭＋白藜蘆醇組加入等體積無血清含0.1%戊巴比妥鈉培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱1 h，若H9c2 細胞變細，部分呈圓形，少量漂浮，則表明模型建立成功。

1.7 CCK?8 檢測細胞活性 H9c2 細胞按“1.6”項下方法分組、給藥與造模，嚴格按照CCK?8 說明書操作，檢測各孔在450 nm 波長處的吸光度值，計算細胞存活率。

1.8 Western blot 法檢測Akt1、Bad、Bcl?2、caspase?3 蛋白表達 將H9c2 細胞于25 cm2培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)（傳代細胞數(shù)約2.5×105個），按“1.6”項下方法分組培養(yǎng)后，收集各組細胞，提取總蛋白，95 ℃變性后10%SDS?PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉2 h，其中磷酸化蛋白使用5%BSA 封閉，一抗（1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h，TBST 洗膜3 次后化學(xué)發(fā)光法顯影，分析各條帶灰度值。

1.9 RT?qRCR 法檢測Akt、Bad、Bcl?2、caspase?3 mRNA 表達 取“1.8”項下收集的各組細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作，使用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，依次加樣進行RT?qPCR 反應(yīng)。采用2－ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇靶點、心力衰竭靶點和交集靶點的獲取 將獲得白藜蘆醇和心力衰竭靶點剔除得分較低靶點以及去重，分別獲得422、821 個相關(guān)靶點，取交集得到白藜蘆醇治療心力衰竭相關(guān)靶點有144個，包括Akt1、CASP3、MAPK8和TP53 等。交集靶點韋恩圖見圖1。

圖1 白藜蘆醇與心力衰竭韋恩圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)及白藜蘆醇治療心力衰竭的關(guān)鍵靶點 PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2 所示，共有144 個節(jié)點，3 280 條邊，依據(jù)Degree 值得到排名靠前的治療心力衰竭關(guān)鍵靶點有TNF、MAPK3、CASP3、Akt1、JUN、VEGFA、IL6、TP53、MAPK8 和EGFR，詳見表2。

表2 白藜蘆醇治療心力衰竭的關(guān)鍵靶點信息

圖2 核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析顯示生物過程（BP）主要集中在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)以及各種磷脂酰肌醇3?激酶信號通路的調(diào)控等；細胞組成（CC）和分子功能（MF）主要集中在膜筏和轉(zhuǎn)錄因子活性等（圖3）。KEGG 分析顯示，PI3K?Akt 信號通路、MAPK 信號通路與脂質(zhì)動脈粥樣硬化通路為白藜蘆醇治療心力衰竭的重要通路（圖4）。GO 生物過程與KEGG 通路得到相似的結(jié)果，即各種磷脂酰肌醇3?激酶信號通路的調(diào)控起到重要作用，因此，PI3K?Akt 通路可能為白藜蘆醇治療心力衰竭的重要通路（圖5，綠色區(qū)域為信號下調(diào)靶點）。

圖3 GO 功能分析

圖4 KEGG 通路富集分析

圖5 白藜蘆醇治療心力衰竭的信號通路靶點

2.4 分子對接分析 將白藜蘆醇與Akt1、TP53、VEGFA、CASP3 和IL6 進行分子對接，親和力＜?5 kcal／mol 表明結(jié)合較好，如表3 所示，白藜蘆醇與上述靶點有較強的結(jié)合力，對接模式見圖6。

表3 分子對接結(jié)果

2.5 不同濃度白藜蘆醇對H9c2 細胞存活率的影響 與正常組比較，100、125、150、200 μmol／L 白藜蘆醇可降低細胞活性（P＜0.05，P＜0.01），因此，選擇75 μmol／L為白藜蘆醇干預(yù)濃度，見圖7。

圖7 不同濃度白藜蘆醇對H9c2 細胞的影響（，n＝3）

2.6 白藜蘆醇對心力衰竭細胞存活率的影響 與正常組比較，心力衰竭組細胞存活率降低（P＜0.01）；與心力衰竭組比較，心力衰竭＋白藜蘆醇組細胞存活率升高（P＜0.01），見圖8。

圖8 各組心肌細胞存活率比較（，n＝6）

2.7 白藜蘆醇對心力衰竭細胞Akt、Bad、Bcl?2、caspase3蛋白表達的影響 如圖9 所示，與正常組比較，心力衰竭組細胞Akt、Bad、caspase?3 蛋白表達升高（P＜0.01），Bcl?2 蛋白表達降低（P＜0.01）；與心力衰竭組比較，心力衰竭＋白藜蘆醇組細胞Akt、Bad、caspase?3 蛋白表達降低（P＜0.01），Bcl?2 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖9 各組細胞p?Akt、Akt、Bad、Bcl?2、caspase?3 蛋白表達比較（，n＝3）

2.8 白藜蘆醇對心力衰竭細胞Akt、Bad、Bcl?2、caspase?3 mRNA 表達的影響 如圖10 所示，與正常組比較，心力衰竭組細胞Akt、Bad、caspase?3 mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl?2 mRNA 表達降低（P＜0.01）；與心力衰竭組比較，心力衰竭＋白藜蘆醇組細胞Akt、Bad、caspase?3 mRNA 表達降低（P＜0.01），Bcl?2 mRNA 表達升高（P＜0.01）。

圖10 各組細胞Akt、 Bad、 Bcl?2、 caspase?3 mRNA 表達比較（，n＝3）

3 討論

本研究共獲得144 個白藜蘆醇治療心力衰竭的靶點，根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)Akt1、TP53、VEGFA、CASP3 和IL?6 為治療的核心靶點。最新臨床實驗研究證明，攝入白藜蘆醇可通過降低心力衰竭心肌炎癥因子表達進一步改善心室重構(gòu)和心功能指標［24］，本研究在心力衰竭細胞模型上發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇調(diào)節(jié)PI3K／Akt1／Bad／Bcl?2 通路抗心力衰竭凋亡。

GO 分析結(jié)果提示，白藜蘆醇治療心力衰竭生物過程主要集中在各種磷脂酰肌醇3?激酶信號通路的調(diào)控等，而KEGG 富集分析同樣發(fā)現(xiàn)PI3K?Akt 信號通路為白藜蘆醇治療心力衰竭的重要通路。多項研究證明，白藜蘆醇在心力衰竭中具有抗凋亡、降低炎癥因子表達和抗增殖等保護作用［1，9，24］。PI3K?Akt 號通路具有調(diào)控細胞凋亡和增殖等功能［25］，在心力衰竭中，降低PI3K／Akt 的表達能進一步提高心肌細胞抗凋亡能力，從而緩解心室重構(gòu)［26］。因此，通過進一步篩查PI3K?Akt 關(guān)鍵通路中的下調(diào)靶點，發(fā)現(xiàn)Akt1／Bad／Bcl?2 在白藜蘆醇治療心力衰竭中可能起到關(guān)鍵抗凋亡作用。

多項研究表明，減少心力衰竭中Akt1 表達能明顯減緩心肌細胞的自噬和凋亡［27?28］。Yan 等［29］發(fā)現(xiàn)，miR?31a?5p在心力衰竭中通過靶向Tp53 介導(dǎo)了腎素?血管緊張素?醛固酮系統(tǒng)觸發(fā)的心肌細胞凋亡。VEGFA 具有促進增殖、遷移并抑制細胞凋亡的功能，敲除VEGFA 的小鼠更易出現(xiàn)心力衰竭［30］；而在心力衰竭大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)心臟中毛細血管VEGFA 表達，能進一步促進新生血管生成達到抗心力衰竭作用［31］。caspase?3 主要在凋亡早期和晚期中發(fā)揮作用，在心力衰竭中凋亡蛋白表達明顯增多，減少caspase?3表達能明顯改善心功能［32］。IL?6 為促炎細胞因子，與心力衰竭心功能進一步惡化密切相關(guān)［33］，馬偉利等［34］臨床研究表明，藥物聯(lián)合治療后可明顯降低心力衰竭患者IL?6 表達，進一步改善患者心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，75 μmol／L 白藜蘆醇能增加心力衰竭細胞活性，降低核心靶點Akt1、caspase?3 以及關(guān)鍵通路凋亡因子Bad 蛋白和mRNA 表達，同時升高抗凋亡蛋白Bcl?2 蛋白和mRNA 表達。分子對接提示，白藜蘆醇與核心靶點具有較好的結(jié)合作用。以上結(jié)果表明，白藜蘆醇可能通過調(diào)控Akt1／Bad／Bcl?2 通路減少心力衰竭凋亡蛋白caspase?3 的表達。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定了白藜蘆醇治療心力衰竭的關(guān)鍵成分、核心靶點和途徑。通過心力衰竭心肌細胞模型驗證了白藜蘆醇對心力衰竭保護作用的可能機制，表明白藜蘆醇可能通過Akt1／Bad／Bcl?2 通路，進一步減少心力衰竭凋亡蛋白的表達，從而起到治療作用。