付 姿 郭羽 伍蓉霜王金達(dá)沈磊?

［1.大理大學(xué)藥物研究所， 云南 大理671000； 2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）， 云南 大理671000； 3.大理大學(xué)藥學(xué)院， 云南 大理671000］

血栓是高致死性缺血性心血管病的元兇，而目前用于防止血栓性疾病的藥物均有增加出血風(fēng)險、作用靶點(diǎn)單一導(dǎo)致耐受性等缺點(diǎn)［1］，尋找出血副作用少的多靶點(diǎn)抗血栓藥物仍有必要。理氣活血的中藥被廣泛應(yīng)用于血栓性疾?。囱鲎C）的治療，具有高效低毒和多靶點(diǎn)抗血栓的優(yōu)點(diǎn)［2］。中藥黃芪以補(bǔ)氣虛為主，有治療血瘀證的理論基礎(chǔ)，并在多個研究中顯示出一定的抗血栓活性，如抑制膠原蛋白?腎上腺素誘導(dǎo)的體內(nèi)血栓和體外血栓形成［3］，減少靜脈血栓形成［4］，抑制血小板聚集［5］等。同時，黃芪也是抗血小板組方中的重要成分之一［6］。

正品黃芪包括膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.和蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao，主要生長于東北、華北和西北的高緯度地區(qū)。云南無正品黃芪分布，但是由于環(huán)境的多樣性，有很多黃芪屬植物分布。絕大部分云南黃芪屬植物生長于滇西北的高海拔地區(qū)，屬于特殊生態(tài)環(huán)境植物，具有普通生態(tài)環(huán)境植物所不具備的特點(diǎn)和利用價值。課題組前期對云南黃芪屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行了廣泛研究［7?9］，并初步探討了某些植物的抗血小板活性。研究發(fā)現(xiàn)，與正品黃芪成分高度類似的梭果黃芪Astragalus ernestiiComber 和與正品黃芪成分區(qū)別很大的云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch 均能抑制血小板聚集，但作用途徑差別較大［10］。由于血小板活化在血栓形成中扮演主要角色［11］，本研究計劃進(jìn)一步研究這2 種云南屬植物的抗血栓活性，并評價其出血風(fēng)險，為初步了解云南黃芪屬植物在心血管疾病中的應(yīng)用價值提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g；SPF 級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～24 g，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019?0004。

1.2 試劑與藥物 正品黃芪購自大理下關(guān)萬花路健之佳藥店，產(chǎn)地甘肅，批號20 180102；云南黃芪、梭果黃芪均采自香格里拉，經(jīng)大理大學(xué)張德全教授鑒定為云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch、梭果黃芪Astragalus ernestiiComber。水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號Q／12HB4218?2017）；阿司匹林（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號H172201）；注射用尿激酶（南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號20200801）；血栓素B2（TXB2）試劑盒、6?酮?前列腺素F1α（6?K?PGF1α）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20210108）；含129 mmol／L 枸櫞酸鈉采血管、不含抗凝劑采血管（成都瑞琦醫(yī)療科技有限責(zé)任公司，批號20201024、20201508）。

1.3 儀器 0408?2 型臺式低速離心機(jī) ［上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司］；恒溫水浴鍋（金壇市環(huán)保儀器廠）；Varioskan LUX 型功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 將正品黃芪、云南黃芪、梭果黃芪的干燥根分別粉碎成粗粉，依次用75%乙醇提取1 h，95%乙醇提取2 h，95%乙醇再提取2 h，提取液減壓濃縮后得到浸膏，經(jīng)冷凍干燥后得到凍干粉，實(shí)驗(yàn)時用生理鹽水稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。在體內(nèi)、體外血栓形成實(shí)驗(yàn)和出血實(shí)驗(yàn)中，上述3 種提取物的劑量均根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

2.2 體外血栓形成實(shí)驗(yàn) 大鼠隨機(jī)分為陰性對照組，正品黃芪7.5、15、30 mg／mL組，云南黃芪7.5、15、30 mg／mL組，梭果黃芪7.5、15、30 mg／mL組，陽性對照組（250 U／mL尿激酶），腹主動脈插管取血至采血管中，在37 ℃下放置5 h 使血液凝固，取出血凝塊，放入生理鹽水中清洗至無明顯血水后，切成質(zhì)量約為100 mg 的小段，置于含不同質(zhì)量濃度相應(yīng)藥物的1.5 mL EP 管中，在37 ℃下孵育24 h，陰性對照組放入生理鹽水孵育，最后取出并稱定剩余血凝塊質(zhì)量，計算血栓溶解率，公式為血栓溶解率＝［（給藥前血栓濕質(zhì)量－給藥后血栓濕質(zhì)量）／給藥前血栓濕質(zhì)量］ ×100%。

2.3 體內(nèi)血栓形成實(shí)驗(yàn) 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，正品黃芪150、300 mg／kg組，云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg組，陽性對照組（阿司匹林100 mg／kg），給藥組灌胃給予不同劑量相應(yīng)藥物，陰性對照組和模型組均灌胃給予生理鹽水10 mL／kg，每天1次，連續(xù)7 d。采用FeCl3誘導(dǎo)頸總動脈血栓形成法造模，末次給藥30 min后，腹腔注射4 mL／kg 10%水合氯醛麻醉大鼠，分離左側(cè)頸總動脈置于封口膠條（3 cm×1.5 cm）上，20%FeCl3溶液浸透的濾紙條（1 cm×1 cm）環(huán)敷頸總動脈，濾紙接口處用血管夾輕夾確保濾紙緊貼，假手術(shù)組用生理鹽水代替FeCl3進(jìn)行環(huán)敷，20 min 后取掉濾紙，生理鹽水沖洗3次，40 min 后腹主動脈取血，置于含129 mmol／L 枸椽酸鈉的采血管中，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，分離血漿，用于檢測血漿血栓素B2（TXB2）、6?酮?前列腺素F1α（6?K?PGF1α）水平。取血后，精確剪下1 cm 被濾紙條包裹過的頸總動脈血栓部位血管段，置于濾紙上吸干浮血，稱定含血栓的血管濕質(zhì)量，取出血栓后再稱定質(zhì)量，兩者相減，即得血管段內(nèi)血栓的濕質(zhì)量。

2.4 出血實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為陰性對照組，正品黃芪300、600 mg／kg組，云南黃芪300、600 mg／kg組，梭果黃芪300、600 mg／kg 組、陽性對照組（阿司匹林200 mg／kg），灌胃給予不同劑量相應(yīng)藥物（陰性對照組灌胃給予20 mL／kg 生理鹽水），每天1次，連續(xù)4 d。采用切尾法測定尾出血時間，末次給藥1 h 后固定小鼠，距尾尖3 mm 處剪斷鼠尾，立即浸入37 ℃生理鹽水中，記錄從剪去尾尖到血流停止的時間，即為尾出血時間。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響 與陰性對照組比較，尿激酶組，正品黃芪15 mg／mL組，云南黃芪15、30 mg／mL組，梭果黃芪15、30 mg／mL 組均能增加血栓溶解率（P＜0.05，P＜0.01），其中劑量為30 mg／mL 時溶解血栓的能力依次為云南黃芪＞梭果黃芪＞正品黃芪，15 mg／mL時依次為梭果黃芪＞云南黃芪＞正品黃芪，7.5 mg／mL時均不能增加血栓溶解率（P＞0.05），但各劑量下的作用均弱于尿激酶，見表1。

表1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響（，n＝6）

表1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響（，n＝6）

注：與陰性對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與正品黃芪組（30 mg／mL）比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 各品種黃芪對體內(nèi)血栓形成的影響 與模型組比較，阿司匹林組，正品黃芪300 mg／kg組，云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg 組均能減少血栓濕質(zhì)量（P＜0.05，P＜0.01），其中劑量為300 mg／kg 時溶解體內(nèi)血栓的能力依次為梭果黃芪＞正品黃芪＞云南黃芪，150 mg／kg時依次為梭果黃芪＞云南黃芪＞正品黃芪，并且梭果黃芪上述作用與阿司匹林相當(dāng)。與模型組比較，阿司匹林組，正品黃芪150、300 mg／kg組，云南黃芪150 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg 組均能降低TXB2水平（P＜0.05，P＜0.01），而云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150 mg／kg 組均能升高6?K?PGF1α 水平（P＜0.05，P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，模型組TXB2／6?K?PGF1α 升高，而各品種黃芪均能降低該比值（P＜0.05，P＜0.01），作用能力依次為云南黃芪＞梭果黃芪＞正品黃芪，見表2。

表2 各品種黃芪對體內(nèi)血栓形成的影響（，n＝8）

表2 各品種黃芪對體內(nèi)血栓形成的影響（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與正品黃芪組（300 mg／kg）比較，＃P＜0.05。

3.3 各品種黃芪對尾出血時間的影響 與陰性對照組比較，阿司匹林組，正品黃芪300 mg／kg組，梭果黃芪300、600 mg／kg 組均能延長尾出血時間（P＜0.01），而正品黃芪600 mg／kg 組、云南黃芪600 mg／kg 組均對其無明顯影響（P＞0.05），各品種黃芪出血風(fēng)險依次為梭果黃芪＞正品黃芪＞云南黃芪，并且均低于阿司匹林，見表3。

表3 各品種黃芪對尾出血時間的影響（，n＝8）

表3 各品種黃芪對尾出血時間的影響（，n＝8）

注：與陰性對照組比較，??P＜0.01。

4 討論

特殊生態(tài)環(huán)境指的是環(huán)境條件和生物種類明顯不同于普通生態(tài)環(huán)境的生存環(huán)境，如高海拔、寒冷、沙漠等。生長于特殊生態(tài)環(huán)境中的植物（黃芪、天山雪蓮、藏紅花等）往往含有特殊使用價值的化學(xué)成分。本課題組已對云南黃芪屬植物的分布、生藥學(xué)和化學(xué)成分做了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)除了梭果黃芪和黑毛多枝黃芪含有與正品黃芪類似的成分外，其余云南黃芪屬植物所含成分均與正品黃芪存在很大的差異性，這可能會帶來云南黃芪屬植物與正品黃芪在功能上的差異。本研究表明，同等劑量下，云南黃芪和梭果黃芪溶解體外血栓能力強(qiáng)于正品黃芪；梭果黃芪抑制FeCl3誘導(dǎo)動脈血栓形成的能力最強(qiáng)，而云南黃芪降低TXB2／6?K?PGF1α 比值的能力最強(qiáng)。這些結(jié)果表明2 種云南特殊生態(tài)環(huán)境的黃芪治療血栓性疾病的潛力高于正品黃芪。

盡管2 種黃芪均有抗血栓的作用，但是具體作用途徑有差別。一定濃度的FeCl3能損傷血管內(nèi)皮，從而活化體內(nèi)血小板和凝血系統(tǒng)，形成局部動脈血栓［12］。血小板活化在動脈血栓形成中有及其重要的作用，血栓素A2（TXA2）和前列環(huán)素I2（PGI2）均由血小板產(chǎn)生，前者促進(jìn)血小板聚集和收縮血管，后者抑制血小板聚集和舒張血管，在生理狀態(tài)下，兩者保持動態(tài)平衡，而在血栓性疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬 化、冠心病、高脂血癥）中，TXA2／PGI2比值升高［13?14］。由于TXA2和PGI2在體內(nèi)的半衰期很短，可通過它們的代謝產(chǎn)物TXB2和6?K?PGF1α 的含量來代表它們在體內(nèi)的水平［15］。本研究通過比較2 種黃芪對TXB2和6?K?PGF1α 的作用發(fā)現(xiàn)，梭果黃芪降低血栓中過度升高血栓素的能力更強(qiáng)，而云南黃芪能更顯著升高血栓中被降低的前列環(huán)素水平，并具有較強(qiáng)的降低TXA2／PGI2比值的能力。因此，2 種黃芪抗血栓的作用均與抗血小板活性有關(guān)，有所區(qū)別的是，梭果黃芪主要抑制血栓素活性，而云南黃芪主要增加前列環(huán)素活性。同時，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了2種黃芪抗血小板聚集活性的差異，梭果黃芪抑制二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)血小板聚集的能力更強(qiáng)，而云南黃芪主要抑制花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)的血小板聚集［10］。這些結(jié)果均表明，梭果黃芪可能更多地影響激動劑（如血栓素和ADP）對血小板受體的激動作用來抗血栓，而云南黃芪可能主要影響血小板代謝途徑來抑制血栓形成。2 種黃芪抗血栓活性的差異可能與其所含化學(xué)成分含量的差別和種類差異有關(guān)。課題組研究發(fā)現(xiàn)，梭果黃芪含有與正品黃芪類似的環(huán)阿屯烷型三萜皂苷類化合物［8］，而云南黃芪的化學(xué)成分大多為甾體類成分，未見環(huán)阿屯烷型三萜皂苷［9］。因此，盡管均有抗血栓活性，2 種黃芪的作用機(jī)制可能存在差異。需要注意的是，雖然梭果黃芪具有較強(qiáng)的體外和體內(nèi)抗血栓活性，但是也有較強(qiáng)的出血風(fēng)險，可增加小鼠尾出血時間，不過與陽性藥阿司匹林比較，梭果黃芪的抗體內(nèi)血栓作用相當(dāng)，而出血風(fēng)險明顯降低。此外，云南黃芪對于體內(nèi)血栓作用的風(fēng)險／效益比較好，也具有開發(fā)潛力。

綜上所述，相較于正品黃芪，云南特殊生態(tài)環(huán)境中的黃芪屬植物更具有抗血栓藥物開發(fā)潛力，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。