朱正望 付雙楠薛寧 馬瑞雪 郭桓博 苗明三 朱平生

（河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南 鄭州450046）

肝臟是人體重要的解毒和代謝器官，多種因素如病毒感染、藥物濫用、有毒化學(xué)物質(zhì)、過(guò)度飲酒等都會(huì)引起肝功能異常導(dǎo)致肝損傷，是肝硬化、肝癌等眾多肝臟疾病的重要始動(dòng)因素，重者可進(jìn)一步發(fā)展為急性肝衰竭［1?2］。針對(duì)肝損傷的早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)對(duì)避免其進(jìn)展為重型肝病和保障大眾健康具有十分重要的意義。臨床上對(duì)于肝損傷的治療多采用維生素類、核苷類似物、保肝降酶藥等對(duì)癥治療，對(duì)改善患者的癥狀雖有一定的療效，但也會(huì)加重肝臟的負(fù)擔(dān)［3?4］。因此，探索更安全高效、早期干預(yù)的藥物對(duì)于臨床肝病的防治具有重要意義。

中醫(yī)藥對(duì)于肝病的防治療效顯著，近年來(lái)在肝病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究方面已成為主要的熱點(diǎn)［5?6］。蒲公英是一種應(yīng)用十分廣泛的藥食同源中藥，性寒，味苦、甘，歸肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消腫的作用［7］。黃酮類是蒲公英的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、保肝利膽、增強(qiáng)免疫力等多種藥理活性，應(yīng)用價(jià)值大［8?9］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分在抗肝損傷方面效果顯著，具有廣闊的開發(fā)前景和研究空間［10?11］。前期研究發(fā)現(xiàn)，Arg1、α?GST、PNP、GLDH 作為CCl4致大鼠肝損傷早期生物標(biāo)志物，較傳統(tǒng)肝功能檢測(cè)指標(biāo)具有較好的靈敏性［12］。本研究在此基礎(chǔ)上檢測(cè)CCl4肝損傷大鼠傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)、脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)、早期生物標(biāo)志物，觀察蒲公英總黃酮對(duì)CCl4肝損傷早期的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 儀器 Multiskan Fc 型酶標(biāo)儀、YZB5065?2011 型洗板機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；KDC?160HR 型高速冷凍離心機(jī)（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；UV?2000 型紫外可見分光光度計(jì)［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；BX63 型電動(dòng)顯微鏡（日本Olympus 公司）；ABI7500 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 試劑與藥物 蒲公英總黃酮（含量＞50%，批號(hào)20160505，西安澳瑞特生物科技有限公司）。聯(lián)苯雙酯（批號(hào)A020141206，臺(tái)州萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)股份有限公司）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號(hào)20160809、20160808、20160812、20160730、20160810、20160810、20160810，南京建成生物工程研究所）；精氨酸酶?1（Arg?1）、α?谷胱甘肽?S?轉(zhuǎn)移酶（α?GST）、嘌呤核苷酸磷酸化酶（PNP）、谷氨酸脫氫酶（GLDH）ELISA 試劑盒（批號(hào)均為20160810，蘇州卡爾文生物科技有限公司）；TRIzol 總RNA 提取試劑盒［批號(hào)DP405?02，天根生化科技（北京）有限公司］；CCl4（批號(hào)20160302，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.3 動(dòng)物 Wistar 大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2014?0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（豫）2015?0005。研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL16010005）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 144 只大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，聯(lián)苯雙酯組（3.75 mg／kg），蒲公英總黃酮低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組24只，給藥組分別按相應(yīng)劑量灌胃給予聯(lián)苯雙酯或蒲公英總黃酮混懸液，空白組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，給藥容量10 mL／kg，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，空白組大鼠腹腔注射橄欖油溶液10 mL／kg，其余各組大鼠腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液10 mL／kg 進(jìn)行造模［13］。

2.2 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè) 于造模后3、6、12、24 h 取各組大鼠6只，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL／kg）進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r／min 離心10 min，分離血清，取肝右葉加預(yù)冷生理鹽水制成10%組織勻漿，3 500 r／min離心10 min，取上清液；取肝左葉于4%甲醛溶液中固定，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。采用微板法檢測(cè)血清ALT、AST、ALP、TBIL 水平及肝組織SOD 活性、GSH水平，比色法檢測(cè)肝組織MDA 水平，ELISA 法檢測(cè)血清Arg?1、α?GST、PNP、GLDH 水平，RT?qPCR 法檢測(cè)血清及肝組織中miR?122 mRNA 表達(dá)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALT、AST 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清ALT 水平在3、12、24 h，蒲公英總黃酮低、中劑量組在3、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01），蒲公英總黃酮高劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠血清AST 水平在3、6、12 h 降低（P＜0.05，P＜0.01），蒲公英總黃酮中、高劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALT、AST 水平的影響（，n＝6）

表1 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALT、AST 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALP、TBIL 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠血清ALP 水平在3、6、12、24 h，蒲公英總黃酮中劑量組在6、12、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組在12、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮低、中劑量組大鼠血清TBIL 水平在12 h 降低（P＜0.05），蒲公英總黃酮高劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響（，n＝6）

表2 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織MDA 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01），SOD 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），GSH 水平在6、12、24 h 均降低（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠肝組織SOD活性在24 h 升高（P＜0.05），蒲公英總黃酮各劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠肝組織GSH 水平在6、12、24 h，蒲公英總黃酮中劑量組在6、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組在24 h 升高（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮低、中劑量組大鼠肝組織MDA 水平在3、6、12、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組 在6、12、24 h降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH 水平的影響（，n＝6）

表3 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Arg?1、α?GST 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清Arg?1 水平在3 h，蒲公英總黃酮低、高劑量組在3、12 h，蒲公英總黃酮中劑量組在3、12、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮中、高劑量組大鼠血清α?GST 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），蒲公英總黃酮低劑量組α?GST 水平在3 h 降低（P＜0.01），見表4。

表4 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響（，n＝6）

表4 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清PNP、GLDH 水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清PNP、GLDH 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清PNP 水平在3、6、12 h，蒲公英總黃酮低劑量組在12 h，蒲公英總黃酮中劑量組在3、6 h，蒲公英總黃酮高劑量組在6 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組大鼠血清GLDH 水平在3 h，蒲公英總黃酮各劑量組在3、12 h 降低（P＜0.01），見表5。

表5 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清PNP、GLDH 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清miR?122 mRNA表達(dá)在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01），肝組織miR?122 mRNA 表達(dá)在6、24 h 升高（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮中劑量組大鼠血清miR?122 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），蒲公英總黃酮低、高劑量組在6、12 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮高劑量組大鼠肝組織miR?122 mRNA 表達(dá)在24 h 降低（P＜0.05），蒲公英總黃酮低、中劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05），見表6。

表6 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達(dá)的影響（，n＝3）

表6 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達(dá)的影響（，n＝3）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 蒲公英總黃酮對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列有序，肝細(xì)胞未見異常；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝索排列紊亂，多數(shù)肝細(xì)胞腫脹、壞死，可見大量的肝細(xì)胞脂肪變性，并有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，且隨造模時(shí)間的增加，損傷逐漸加重；聯(lián)苯雙酯組大鼠肝細(xì)胞偶見點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腫脹不明顯；蒲公英總黃酮各劑量組大鼠肝細(xì)胞病變程度較輕，肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性較少，肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕，部分胞漿內(nèi)可見小的脂滴形成，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

4 討論

CCl4作為典型的化學(xué)性肝毒性物質(zhì)，其誘導(dǎo)的大鼠肝損傷表現(xiàn)及進(jìn)程與人類肝損傷病理變化相似，因此被廣泛用于肝損傷大鼠模型的研究以及保肝藥物的篩選［14?15］。CCl4通過(guò)腹腔注射進(jìn)入肝臟，經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450 代謝酶系統(tǒng)，產(chǎn)生三氯甲基等毒性物質(zhì)，可結(jié)合細(xì)胞膜上的磷脂分子，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞肝組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜的通透性增加［16?17］。

肝組織受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)各種酶如ALT、AST 會(huì)大量釋放到血液中，因此，血清中轉(zhuǎn)氨酶升高是肝損傷的重要指標(biāo)，在一定程度上反映了肝細(xì)胞受損程度［18］。肝損傷導(dǎo)致體內(nèi)ALP、TBIL 排泄障礙而反流入血，從而引起血清ALP、TBIL 水平增高，其主要反映肝臟受損時(shí)黃疸和膽汁淤積的程度［19?20］。在脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中，機(jī)體產(chǎn)生大量的MDA，持續(xù)破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，加劇肝臟受損程度，使肝細(xì)胞發(fā)生變性甚至壞死，從而加重病變［21］。SOD、GSH 是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化酶，能有效清除體內(nèi)過(guò)量的自由基并增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整［22?23］。本研究顯示，蒲公英總黃酮預(yù)防性干預(yù)后，降低了大鼠血清中AST、ALT、TBIL、ALP 水平，減少肝組織中MDA 水平，提高SOD 活性和GSH 水平，各給藥組大鼠肝細(xì)胞病變程度減輕，肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性較少，說(shuō)明蒲公英總黃酮可以減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，穩(wěn)定肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)從而減輕肝臟損傷的程度。

PNP 主要位于肝細(xì)胞等的細(xì)胞質(zhì)中，正常情況下多數(shù)檢測(cè)不到，只有當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，才會(huì)在血液中被檢測(cè)到，其敏銳度高于傳統(tǒng)的肝損傷指標(biāo)，可以作為潛在的肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志物［24］；Arg?1 是肝臟中重要的水解酶，多分布于肝細(xì)胞核、微粒體，能夠催化精氨酸生成尿素和鳥氨酸，研究表明其在肝損傷中有較高的靈敏度［25］；GLDH 在肝臟中水平最高，肝損傷時(shí)線粒體膜受到破壞，血液中的GLDH 升高，其對(duì)于肝損傷的診斷具有較高的敏感性［26］；α?GST 多分布在肝小葉中心細(xì)胞，在肝損傷早期就會(huì)透過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入血液，是理想的早期肝損傷指標(biāo)［27］；miR?122 是在肝細(xì)胞中特異性高表達(dá)的miRNA，對(duì)于維持肝臟的正常代謝功能有重要的調(diào)控作用，在肝損傷早期血液中就可以檢測(cè)到其表達(dá)顯著升高，較傳統(tǒng)的肝功能檢測(cè)指標(biāo)更靈敏［28?29］。本研究顯示，蒲公英總黃酮各劑量組可以不同程度降低大鼠血清中PNP、Arg?1、GLDH、α?GST 水平和miR?122 表達(dá)，但對(duì)于相關(guān)指標(biāo)的改善作用量效關(guān)系不明顯，初步表明蒲公英總黃酮在CCl4致大鼠肝損傷早期即可起到一定的預(yù)防和保護(hù)作用，后期仍有待進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。