申昌梅 廖振蓉余瑛

（江西省贛州市腫瘤醫(yī)院， 江西 贛州341000）

宮頸癌是危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高［1］，主要危險因素包括高危人類乳頭瘤病毒（hrHPV）感染、年齡、吸煙、分娩、使用口服避孕藥和飲食，其中hrHPV 持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)展的主要因素，在早期階段，hrHPV 相關(guān)的宮頸癌并無癥狀［2］。盡管在過去的幾十年中，宮頸癌的預防和治療策略得到了迅速發(fā)展，但是晚期和復發(fā)性宮頸癌患者的預后生存率仍然很低，其1年生存率僅為10%～20%［3］?；瘜W療法已被廣泛應用于宮頸癌的臨床治療［4］，順鉑是最常見的化學治療藥物，大多數(shù)宮頸癌患者在早期可以通過順鉑化療獲得良好的療效，但在治療過程中會逐漸產(chǎn)生耐藥性，是宮頸癌長期治療的主要限制［5］。

槲皮素是石斛中的一種主要類黃酮，具有治療癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的潛力［6］。Bishayee 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以促進宮頸癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。Che 等［8］研究表明，抑制PI3K／Akt 信號通路的活性可以抑制子宮頸癌細胞的增殖和上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），而激活PI3K／Akt 信號通路可以促進宮頸癌細胞的生長并抑制其凋亡［9］。本實驗將探究槲皮素對人宮頸癌順鉑耐藥細胞株HeLa／DDP 順鉑耐藥的影響，以及PI3K／Akt 信號通路在其中起到的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與藥物 槲皮素（純度≥98%，貨號B20527?20 mg，上海源葉生物科技有限公司）；順鉑（純度98.0～102.0%，貨號MZ3502?100 mg，上海集奇生物科技有限公司）。二甲基亞砜（DMSO，山東伊維化工科技有限公司）；CCK?8 試劑盒、PI3K 抗體、p?PI3K 抗體、Akt 抗體、p?Akt抗體、Survivin 抗體、MMP?2 抗體、二抗山羊抗兔IgG（英國Abcam 公司）；TRIzol（貨號15596026，美國Invitrogen公司）；轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047A，日本TaKaRa 公司）；Transwell 染色試劑盒（貨號BL710A，北京白鯊易科技有限公司）。

1.2 細胞株 人宮頸癌順鉑耐藥細胞株HeLa／DDP（貨號CL0677），購自湖南豐暉生物科技有限公司，培養(yǎng)于含20%牛血清（FBS）和10%DMSO 的培養(yǎng)基中，胰酶常規(guī)消化、傳代。

1.3 細胞分組及給藥 取對數(shù)生長期的HeLa／DDP 細胞，調(diào)整細胞密度，接種于96 孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將細胞分為對照組（PBS）、順鉑組（10 μmol／L）和槲皮素低、中、高劑量（20、40、80 μmol／L）＋順鉑（10 μmol／L）組，給予相應劑量藥物干預處理。

1.4 CCK?8 法檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期HeLa／DDP 細胞，調(diào)整密度為1×105／mL，并以每孔100 μL 體積接種到96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，按“1.3”項下分組處理，分別在24、48、72 h 時加入10 μL CCK?8 檢測液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，通過酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，以吸光度值表示細胞活力。

1.5 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期HeLa／DDP 細胞，制備成單細胞懸液并計數(shù)，每皿中接種1 000 個細胞，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d 換液1次，14 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗3次，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，于顯微鏡下計數(shù)大于50 個細胞的集落數(shù)。

1.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移能力 對數(shù)生長期HeLa／DDP 細胞饑餓24 h，次日消化細胞，離心后重懸，調(diào)整細胞密度為3×105／mL，取0.2 mL 懸液加入Transwell 上室，下室加入700 μL 含10%FBS 的預冷DMEM 細胞培養(yǎng)液，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后濕棉簽拭去上室及基底膜上的細胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，流水沖洗，倒置，自然晾干，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 RT?qPCR 法檢測細胞PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 表達 收集各組細胞，TRIzol 法提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，20 μL 體系，反應條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒配置上樣體系，通過實時熒光定量PCR 儀進行RT?qPCR 反應，反應體系為SYBR Mix 9 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、RNase Free dH2O 8 μL。記錄各孔CT值，以β?actin為內(nèi)參，采 用2－ΔΔCT法計算PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 相對表達量。

1.8 Western blot 法檢測細胞PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、Survivin、MMP?2 蛋白表達 收集各組細胞，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，提取得到的總蛋白采用BCA 定量試劑盒進行定量，加入上樣緩沖液于95 ℃煮沸10 min 進行變性。蛋白樣本SDS?PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉液封閉60 min，加入PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、Survivin、MMP?2 抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG H＆L（HRP），室溫下雜交2 h，TBST 洗膜3次，ECL 試劑盒進行發(fā)光反應，曝光拍照，并進行圖像分析，實驗重復3 次。

1.9 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，服從正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素聯(lián)合順鉑對HeLa／DDP 細胞增殖能力的影響與對照組比較，48、72 h 各藥物處理組細胞增殖能力降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，槲皮素聯(lián)合順鉑處理組細胞增殖能力降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞增殖情況（，n＝3）

表1 各組細胞增殖情況（，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05；與槲皮素低劑量＋順鉑組比較，＄P＜0.05；與槲皮素中劑量＋順鉑組比較，＆P＜0.05。

2.2 槲皮素聯(lián)合順鉑對HeLa／DDP 細胞克隆形成能力的影響 與對照組比較，各藥物處理組細胞克隆形成能力降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，槲皮素聯(lián)合順鉑處理組細胞克隆形成能力降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 各組細胞克隆形成能力

表2 各組細胞菌落形成率比較（，n＝3）

表2 各組細胞菌落形成率比較（，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05；與槲皮素低劑量＋順鉑組比較，＄P＜0.05；與槲皮素中劑量＋順鉑組比較，＆P＜0.05。

2.3 槲皮素聯(lián)合順鉑對HeLa／DDP 細胞遷移能力的影響與對照組比較，各藥物處理組細胞遷移能力降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，槲皮素聯(lián)合順鉑處理組細胞遷移能力降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 各組細胞遷移能力（×200）

表3 各組細胞遷移率比較（，n＝3）

表3 各組細胞遷移率比較（，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05；與槲皮素低劑量＋順鉑組比較，＄P＜0.05；與槲皮素中劑量＋順鉑組比較，＆P＜0.05。

2.4 槲皮素聯(lián)合順鉑對HeLa／DDP 細胞PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 表達的影響 與對照組比較，各藥物處理組細胞PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 表達降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，槲皮素聯(lián)合順鉑處理組細胞PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 表達降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細胞PI3K、 Akt、 Survivin、 MMP?2 mRNA 表達比較（，n＝3）

2.5 槲皮素聯(lián)合順鉑對HeLa／DDP 細胞PI3K／Akt 信號通路活性的影響 與對照組比較，各藥物處理組細胞PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、Survivin、MMP?2 蛋白表達降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，槲皮素聯(lián)合順鉑處理組細胞PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、Survivin、MMP?2 蛋白表達降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖4。提示，槲皮素聯(lián)合順鉑可以降低PI3K／Akt 信號通路活性。

圖4 各組細胞PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、Survivin、MMP?2 蛋白表達比較（，n＝3）

3 討論

宮頸癌的死亡率位居全球癌癥死亡率第4，全球新發(fā)病例數(shù)為52.8 萬［10］，我國宮頸癌的發(fā)生率與死亡率呈現(xiàn)上升趨勢［11］。順鉑是最常用的化學治療藥物，已被證明是治療晚期或復發(fā)性宮頸癌的最有效藥物之一［12］，然而順鉑耐藥性仍是長期療效的最大挑戰(zhàn)，宮頸癌中對順鉑耐藥的機制尚不清楚。

槲皮素是植物界分布廣泛，具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，已被證明有抗氧化、抗炎和抗增殖作用，具有潛在的抗癌特性［13］。有大量研究表明，槲皮素在腫瘤治療方面有一定的效果。在前列腺癌中，槲皮素可以下調(diào)hnRNPA1、AR?V7 表達，拮抗雄激素受體信號傳導，并使enzalutamide 治療小鼠異種移植重新敏感［14］；在宮頸癌中，槲皮素通過依賴p53 的機制，調(diào)控核形態(tài)，磷脂酰絲氨酸外化，線粒體膜去極化，調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控蛋白，NF?過依家族成員和促凋亡的Bcl?2 家族蛋白，誘導G2／M 期細胞周期停滯和線粒體凋亡，以劑量依賴的方式抑制了宮頸癌細胞的活力［15］。槲皮素能夠減少細胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，維持了線粒體膜電位和DNA 的完整性［16］，并以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)各種染色質(zhì)修飾劑的表達，并降低DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT），組蛋白脫乙?；福℉DAC），組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）的活性，從而抑制腫瘤的進一步發(fā)生［17］。

PI3K／Akt 通路在調(diào)控各種細胞功能（包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成）方面發(fā)揮重要作用，在腫瘤調(diào)控中同樣扮演著重要角色。在前列腺癌中，PI3K／Akt 通路被激活，可促進腫瘤形成、疾病進展和治療耐藥性［18］，PI3K／Akt／mTOR 通路在宮頸癌中經(jīng)常失調(diào)，表明它可能是治療這種惡性腫瘤的潛在靶標［19］。人乳頭瘤病毒（HPV）誘發(fā)的宮頸癌中，PI3K／Akt／mTOR 在常氧和低氧HPV 陽性癌細胞中對病毒／宿主細胞串擾起關(guān)鍵作用［20］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素聯(lián)合順鉑處理能降低增殖能力、克隆形成能力、遷移能力及PI3K、Akt、Survivin、MMP?2 mRNA 和蛋白表達，并呈劑量依賴性。提示，槲皮素可能通過調(diào)控PI3K／Akt 信號通路增強順鉑對人宮頸癌順鉑耐藥細胞株HeLa／DDP 的抗癌作用，為宮頸癌順鉑耐藥的研究提供了新的思路。