陳二華 朱慧芳 譚東明 張建華丁旭殷紫?

（1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與中藥學(xué)院， 江蘇 淮安223005； 2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院護(hù)理與助產(chǎn)學(xué)院， 江蘇淮安223005）

神經(jīng)炎癥是眾多神經(jīng)退行性疾病的共同致病機(jī)制，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中原發(fā)與繼發(fā)性的傷害會(huì)導(dǎo)致多重的無(wú)菌損傷，并誘發(fā)細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能障礙等［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中先天免疫的第一道防線，在介導(dǎo)中樞神經(jīng)炎癥的激活與繼發(fā)性損傷中起到關(guān)鍵作用，不僅可以釋放炎癥因子加重中樞神經(jīng)的損傷，另一方面也可釋放營(yíng)養(yǎng)因子從而減少炎癥對(duì)神經(jīng)的損傷［2?3］。在中樞神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的眾多疾病中，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，減少細(xì)胞凋亡等是減輕神經(jīng)炎癥的一大重要策略。

白藜蘆醇作為目前臨床應(yīng)用前景較好的多酚類(lèi)化合物，在抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞代謝、衰老、自噬等方面有重要作用［4?5］，但確切機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了脂多糖刺激小鼠小膠質(zhì)BV2 細(xì)胞系的炎癥模型，深入探討該成分發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，以期為后續(xù)臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 細(xì)胞系（批號(hào)CL?0493），購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至融合度70%～80%時(shí)，傳代進(jìn)行保種，或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 白藜蘆醇（純度≥99%，批號(hào)R5010?100MG）、脂多糖（批號(hào)L4516）、細(xì)胞熒光染色Hoechst（批號(hào)B2261，1∶3 000）均購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich 公司；DMSO（批號(hào)KGT5131）、DMEM（批號(hào)KGM12800?500）、RIPA 裂解液（批號(hào)KGP704）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)KGP903）均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)10100147）；3?甲基腺嘌呤（3?MA）（美國(guó)Selleck 公司，批號(hào)S2767）；磷酸酶抑制劑（美國(guó)Thermo Fisher 公司，批號(hào)78426）；兔抗Bax（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)50599?2?Ig）；兔抗Bcl?2（南京巴傲得生物科技有限公司，批號(hào)BS1511）；鼠抗GAPDH（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)sc?32233）；兔抗LC3B（批號(hào)2775）、兔抗SQSTM1（批號(hào)5114s）、兔抗TLR4（批號(hào)14358s）、兔抗FOXO3（批號(hào)2497s）、兔抗P?FOXO3（批號(hào)9466s）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠lgG（H＋L）（批號(hào)bs?40296G?HRP）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔lgG（H＋L）（批號(hào)bs?40295G?HRP）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Lyso Tracker Red（批號(hào)1583088，1∶2 000）、mRNA提取Trizol（批號(hào)15596026）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；HiScript ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（批號(hào)R233?01）、ChamQ qPCR SYBR Green MasterMix（批號(hào)Q121?02）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）；LAS 顯影儀（日本富士公司）；尼康共聚焦顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 給藥與分組 細(xì)胞按“1.1”項(xiàng)下方法培養(yǎng)后，先加入白藜蘆醇（結(jié)合前期研究與實(shí)驗(yàn)結(jié)果［6］，設(shè)定能有效抑制炎癥反應(yīng)的濃度為30 μmol／L）預(yù)處理30 min，再給予100 ng／mL 脂多糖刺激6 h，3?甲基腺嘌呤在脂多糖刺激5 h時(shí)給予處理1 h，現(xiàn)配現(xiàn)用，終濃度為5 mmol／L。再隨機(jī)分為對(duì)照組（不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理）、脂多糖組（100 ng／mL）、白藜蘆醇組（30 μmol／L）、脂多糖＋白藜蘆醇組（100 ng／mL＋30 μmol／L）、脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組（100 ng／mL＋30 μmol／L＋5 mmol／L）。

2.2 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用含有磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解BV2 細(xì)胞，置于冰上裂解15 min 后刮取蛋白，16 000×g離心15 min，吸取上清后進(jìn)行蛋白定量，加入5×Loading Buffer，在95 ℃下煮沸5 min，即得蛋白樣本。電泳儀分離蛋白分子，電轉(zhuǎn)移將蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，隔天棄去一抗，TBST 洗膜3次，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜后顯影曝光。

2.3 RT?qPCR 法檢測(cè)炎癥因子mRNA 表達(dá) PBS 漂洗12孔板中的BV2 細(xì)胞，吸棄廢液后加入TRIzol，置于冰上裂解5 min，將TRIzol 溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，加入三氯甲烷，4 ℃、12 000×g離心15 min，將上層液體轉(zhuǎn)移至全新無(wú)酶RNA EP 管中，加入異丙醇于－20 ℃下靜置1 h，4 ℃、12 000×g離心15 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，揮干乙醇后加入DEPC 水溶解RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，程序?yàn)?2 ℃2 min，50 ℃15 min，80 ℃5 s，所得cDNA 樣品進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為cDNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，雙蒸水3 μL，ChamQ qPCR SYBR Green MasterMix 5 μL，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.4 細(xì)胞溶酶體Lyso tracker Red 染色 將接種于24 孔板中細(xì)胞爬片上BV2 細(xì)胞用Lyso tracker Red（DMEM，1∶2 000）染色30 min 后（37 ℃、5% CO2），將混有染料的DMEM 溶液吸棄，用4% 多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，PBS 輕輕洗滌細(xì)胞爬片，Hoechst 染核10 min，PBS 輕輕洗滌細(xì)胞爬片后倒扣在載玻片上，用防熒光猝滅劑封片，在顯微鏡下拍攝。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組BV2 細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bcl?2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），表明白藜蘆醇能改善由脂多糖引起的BV2 細(xì)胞凋亡反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）

3.2 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞狀態(tài)的影響 對(duì)照組、白藜蘆醇組BV2 細(xì)胞形態(tài)呈圓形，細(xì)胞有較少的分支突起；脂多糖組BV2 細(xì)胞圓形結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞有明顯觸角，為激活樣狀態(tài)；脂多糖＋白藜蘆醇組能緩解BV2 細(xì)胞的激活，表現(xiàn)為炎癥因子的釋放而介導(dǎo)神經(jīng)炎性作用，表明白藜蘆醇可緩解脂多糖引起的BV2 細(xì)胞激活，見(jiàn)圖2。

圖2 各組BV2 細(xì)胞的狀態(tài)

3.3 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，脂多糖組BV2 細(xì)胞中IL?6、IL?1、TNF?αmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組BV2 細(xì)胞中IL?6、IL?1、TNF?αmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響（，n＝6）

3.4 白藜蘆醇對(duì)BV2 自噬阻滯的影響 細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可能因其細(xì)胞自噬受阻而導(dǎo)致［7］。與對(duì)照組比較，脂多糖組BV2 細(xì)胞中SQSTM1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值降低（P＜0.05），提示脂多糖可引發(fā)細(xì)胞自噬的阻滯；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組細(xì)胞中SQSTM1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值升高（P＜0.05），提示白藜蘆醇能緩解脂多糖引起的自噬阻滯；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組BV2 細(xì)胞中SQSTM1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值降低（P＜0.05），表明自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤可消除白藜蘆醇的促自噬作用，見(jiàn)圖4。

圖4 白藜蘆醇對(duì)BV2 自噬阻滯現(xiàn)象的影響（，n＝3）

3.5 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞自噬?溶酶體損傷阻滯的影響與對(duì)照組比較，脂多糖組能引起自噬?溶酶體通路中溶酶體細(xì)胞器的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞器熒光信號(hào)的減弱，而白藜蘆醇組可有效降低脂多糖對(duì)BV2 的損傷；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組則有效提高了溶酶體細(xì)胞器的熒光強(qiáng)度，降低損傷；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組可消除白藜蘆醇的作用，增加溶酶體的損傷阻滯，見(jiàn)圖5。

圖5 各組BV2 細(xì)胞自噬?溶酶體損傷阻滯現(xiàn)象（×40）

3.6 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞凋亡與炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 TLR4 受體介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物FOXO3 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化上調(diào)是LPS 引發(fā)自噬的重要機(jī)制［8］。與對(duì)照組比較，脂多糖組TLR4 蛋白表達(dá)、FOXO3 磷酸化水平升高（P＜0.01）；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組TLR4 蛋白表達(dá)、FOXO3 磷酸化水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組TLR4蛋白表達(dá)、FOXO3 磷酸化水平升高（P＜0.05，P＜0.01），表明自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤消除了白藜蘆醇的作用，見(jiàn)圖6。

圖6 白藜蘆醇對(duì)BV2 細(xì)胞凋亡與炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）

4 討論

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病起始階段，炎癥反應(yīng)起到保護(hù)和修復(fù)組織的作用，而持續(xù)的炎癥反應(yīng)則會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡損傷、自噬功能缺陷［9?11］。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是神經(jīng)炎癥的主要特征，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可介導(dǎo)各種神經(jīng)毒性物質(zhì)以及促炎因子的釋放并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞主要負(fù)責(zé)免疫監(jiān)視與宿主的防御感染，但在神經(jīng)炎性條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活會(huì)釋放各種神經(jīng)毒性物質(zhì)如興奮性谷氨酸、奎寧酸、組胺等從而導(dǎo)致腦組織的損傷。雖然短期的小膠質(zhì)細(xì)胞活化是有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，但長(zhǎng)期的活化已被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病的潛在機(jī)制。因此，基于小膠質(zhì)細(xì)胞功能以獲得安全有效的神經(jīng)保護(hù)劑很重要。

白藜蘆醇來(lái)源于虎杖、葡萄等，研究表明其能降低心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率［12］，并且在脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中，可通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體?γ 共激活因子?1α 減輕炎癥損傷促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化［13］。白藜蘆醇能影響細(xì)胞自噬的關(guān)鍵通路，例如調(diào)控雷帕霉素靶蛋白的磷酸化程度，從而影響細(xì)胞的糖酵解過(guò)程［14］；通過(guò)抑制絲裂原誘導(dǎo)的核糖體p70S6K 激酶磷酸化影響大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞肥大［15］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，白藜蘆醇也可通過(guò)調(diào)控自噬過(guò)程來(lái)提高神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，免受氧化應(yīng)激的損傷［4，16］。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇有效減輕了脂多糖引起的自噬阻滯，并減少了溶酶體細(xì)胞器的損傷，從而減少了BV2 細(xì)胞的凋亡與炎癥因子IL?6、IL?1、TNF?αmRNA表達(dá)。

脂多糖是對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活最為有效的刺激物之一，脂多糖刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，通過(guò)膜上的TLR4 受體介導(dǎo)下游的免疫應(yīng)答［17］。FOXO3 是FOXO 家族的重要成員，因其廣泛參與調(diào)控泛素?蛋白酶體和自噬?溶酶體蛋白水解途徑，是蛋白分解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［18］。自噬?溶酶體途徑是維持細(xì)胞自身代謝以及蛋白質(zhì)更新的重要過(guò)程，自噬過(guò)程的順利進(jìn)行有利于細(xì)胞受損成分的清除與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，以便在饑餓以及壓力環(huán)境下提供能量。既往研究與本研究證實(shí)，白藜蘆醇能有效減輕脂多糖引起的自噬?溶酶體通路障礙［19］，通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過(guò)TLR4?FOXO3 通路有效減輕自噬的阻滯現(xiàn)象。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過(guò)TLR4?FOXO3 信號(hào)通路減弱脂多糖引發(fā)的自噬?溶酶體的通路障礙，并減少BV2 細(xì)胞的凋亡與炎癥因子的釋放。