吳麗瓊 林瓊英 莊偉洪 蔡榮欽

（廣東心寶藥業(yè)科技有限公司， 廣東 廣州510535）

心寶丸是由洋金花、人參、肉桂、附子、鹿茸、冰片、人工麝香、三七、蟾酥9 味藥材組成的中藥制劑，臨床上廣泛用于病態(tài)竇房結(jié)綜合征、慢性心功能不全、心肌缺血、心率失常等心臟疾病的治療，效果顯著，不良反應(yīng)少，深受醫(yī)師和患者認(rèn)可［1］，近年來研究發(fā)現(xiàn)，該制劑聯(lián)合西藥治療慢性心力衰竭合并心動過緩時具有理想療效［2?8］，并且臨床上輔以綜合護(hù)理［9］或聯(lián)用功能相近的中成藥時也能提高藥物臨床療效［10?11］，在社會老齡化趨勢下其市場潛力和應(yīng)用前景突出。然而，現(xiàn)階段心寶丸執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)僅設(shè)置【性狀】、【鑒別】、【檢查】 等質(zhì)量控制項(xiàng)目，缺少含量測定項(xiàng)，而且隨著2020 年版《中國藥典》對相關(guān)藥材質(zhì)控要求的提高，上述標(biāo)準(zhǔn)部分鑒別項(xiàng)相對滯后，專屬性差，無法對該制劑質(zhì)量進(jìn)行有效控制［12?14］，亟待提高。

國家食品藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫信息顯示，心寶丸共有2 個國藥準(zhǔn)字，即Z44021843（廣東心寶藥業(yè)科技有限公司）、Z44022728（廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司），故本實(shí)驗(yàn)以上述2 家公司產(chǎn)品為研究對象，通過TLC、GC、HPLC 法進(jìn)行定性鑒別和含量測定，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。

1 材料

GC?2014 氣相色譜儀（配置氫火焰離子檢測器）、LC?20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置Agilent Open LAB 色譜工作站（版本號2.1.0）（美國Agilent 公司）；AL204、MS105DU、ME303電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；HNY?350 L 超聲波清洗器（華南超聲設(shè)備有限公司）。聚乙二醇（PEG?20M）Rtx??Wax 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；中普紅RD?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent EC?C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）。預(yù)制硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司、德國Macherey?Nagel 公司）；硅膠G 薄層板（自制）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

硫酸阿托品（批號100040?200510）、氫溴酸東莨菪堿（批號100049?201009）、龍腦（批號110881?201508）、麝香酮（批號110719?201215）、桂皮醛（批號110710?201720）、人參皂苷Rg1（批號110703?201731）、人參皂苷Re（批號110754?201626）、人參皂苷Rb1（批號110704?201726）對照品及洋金花對照藥材（批號121058?200503）（中國食品藥品檢定研究院）。洋金花、冰片、肉桂、人工麝香陰性樣品（批號20191217）及人參、三七陰性樣品（批號20171217）（廣東心寶藥業(yè)科技有限公司）。心寶丸（批號20180301、20180501、20190702、20190901、20190902、20190903、20190904、20190905、20190907、20190908，用于TLC 定性鑒別；批號20171004、20180301、20180501、20190701、20190702、20190901、20190902、20190903、20190904、20190907，用于GC 定性鑒別；批號20160101、20160803、20160909、20161009、20170405、20170810、20171004、20171005、20171006、20180301，用于HPLC 含量測定，均由廣東心寶藥業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。批號C20170105、C20170712、C20171104、C20180104、C20180501、C20180901、C20181202、C20190101、C20190607、C20191216，用于TLC、GC 定性鑒別；批號C20180203、C20180602、C20181108、C20190204、C20190602、C20190801、C20191008、C2002003、C2005052、C2005053，用于HPLC 含量測定，均由廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 TLC 法（洋金花）

2.1.1.1 供試品溶液制備 取本品2 g，研細(xì)，加乙酸乙酯?無水乙醇?氨水（100∶5∶1）25 mL，超聲（400 W、40 kHz）處理30 min，濾過，濾液蒸干，加1 mL 甲醇溶解，即得。

2.1.1.2 對照藥材溶液制備 取洋金花對照藥材1 g，加乙酸乙酯?無水乙醇?氨 水（100∶5∶1）25 mL，超 聲（400 W、40 kHz）處理30 min，濾過，濾液蒸干，加1 mL甲醇溶解，即得。

2.1.1.3 對照品溶液制備 取硫酸阿托品、氫溴酸東莨菪堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含兩者各4 mg 的溶液，即得。

2.1.1.4 陰性樣品溶液制備 取缺洋金花的陰性樣品2 g，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.1.5 結(jié)果分析 吸取對照藥材溶液5 μL，對照品溶液各1 μL，供試品、陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯?甲醇?氨水（17∶2∶1）為展開劑，展開后取出，晾干，于日光下檢視，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液在對照藥材、對照品溶液相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 2 家公司洋金花TLC 色譜圖

2.1.2 GC 法（冰片、人工麝香、肉桂）

2.1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性考察 聚乙二醇（PEG?20M）Rtx? ?Wax 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫（初始80 ℃，保持5 min，以5 ℃／min 升至180 ℃，保持10 min）；進(jìn)樣口溫度210 ℃；檢測器溫度250 ℃；分流比10∶1；載氣體積流量1.59 mL／min。理論塔板數(shù)按龍腦峰計(jì)，應(yīng)不低于10 000。

2.1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取龍腦、麝香酮、桂皮醛對照品適量，加乙酸乙酯制成每1 mL 分別含三者0.1、0.02、0.1 mg 的溶液，即得。

2.1.2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研磨后取細(xì)粉約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（400 W、40 kHz）處理10 min，取出，放冷，乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.1.2.4 陰性樣品溶液制備 取缺冰片、肉桂、人工麝香的陰性樣品，按“2.1.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.2.5 結(jié)果分析 精密量取對照品、供試品溶液各1 μL，在“2.1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。由此可知，供試品溶液呈現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分GC 色譜圖

2.2 HPLC 含量測定（人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1）

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；檢測波長203 nm。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1計(jì)，應(yīng)不低于6 000。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含三者0.6、0.15、0.7 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)后取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，50% 甲醇稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取缺人參、三七的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解并制成每1 mL 分別含人參皂苷Rg1190.4、380.8、565.3、775.9、992.1 μg，人參皂苷 Re 51.1、99.8、149.8、199.7、234.9 μg，人參皂苷Rb1370.6、605.8、785.4、975.1、1 179.5 μg 的溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。由此可知，各人參皂苷在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 各人參皂苷線性關(guān)系

2.2.5.2 專屬性試驗(yàn) 吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖3 各人參皂苷HPLC 色譜圖

2.2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得人參皂苷Rg1、人 參皂苷Re、人參皂 苷Rb1峰面積RSD 分別為0.5%、0.6%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號20170905）6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量RSD 分別為0.5%、0、0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號20170905）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、8、16、24、36、48 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參皂苷Rg1、人 參皂苷Re、人參皂 苷Rb1峰面積RSD 分別為0.4%、0.5%、1.3%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批本品（批號20170405，含人參皂苷Rg10.761 mg／丸、人參皂苷Re 0.172 mg／丸、人參皂苷Rb10.777 mg／丸）9份，置于具塞錐形瓶中，每3 份1組，分別精密加入50%水平（含人參皂苷Rg10.059 mg／mL、人參皂苷Re 0.013 mg／mL、人參皂苷Rb10.061 mg／mL）、100%水平（含人參皂苷Rg10.120 mg／mL、人參皂苷Re 0.027 mg／mL、人參皂苷Rb10.121 mg／mL）、150%水平（含人參皂苷Rg10.189 mg／mL、人參皂苷Re 0.040 mg／mL、人參皂苷Rb10.182 mg／mL）對照品溶液（溶劑為水飽和正丁醇）各50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，50% 甲醇稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各人參皂苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.2.5.7 色譜柱考察 取本品（批號20180301）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別采用Phenomenex Gemini C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、中普紅RD?C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent EC?C18（150 mm ×4.6 mm，4 μm）色譜柱，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1分離度良好，三者含量RSD 分別為0.5%、4.4%、4.5%，表明不同色譜柱對測定無明顯影響。

2.2.5.8 儀器考察 取本品（批號20170905）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）上分別采用LC?20AT、Agilent 1260 高效液相色譜儀，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1分離度良好，三者含量RSD 分別為0、2.2%、1.9%，表明不同儀器對測定無明顯影響。

2.2.6 樣品含量測定 取20 批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總含量，結(jié)果見表4。

表4 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 總含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 顯微鑒別 本實(shí)驗(yàn)對心寶丸原標(biāo)準(zhǔn)中的顯微鑒別項(xiàng)進(jìn)行藥材歸屬，發(fā)現(xiàn)三七為樹脂道碎片含黃色油滴狀或塊狀分泌物；鹿茸為不規(guī)則碎塊灰黃色，稍具光澤，充塞灰黑色微細(xì)顆粒。

3.2 GC 定性鑒別 心寶丸原標(biāo)準(zhǔn)中的部分鑒別項(xiàng)存在一定缺陷，如升華法鑒別冰片時因溫度難以控制，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差；TLC 法鑒別人工麝香、鹿茸時，由于2020 年版《中國藥典》中指標(biāo)成分更新，存在陰性干擾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)建立的GC 法專屬性強(qiáng)，可對冰片、人工麝香進(jìn)行定性鑒別。

3.3 檢測波長選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測器對對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長為203 nm時，各人參皂苷色譜圖基線平穩(wěn)，具有良好的紫外吸收，峰形穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾小，分離度較好。

3.4 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（水飽和正丁醇、70%甲醇、50%甲醇）、提取方法（回流、超聲）、提取時間（15、30、45、60、90、120 min）、取樣量（1.0、3.0 g）對各人參皂苷提取率的影響，最終確定為“2.2.3”項(xiàng)下方法，此時提取效果最好。

3.5 含量限度制定 研究表明，人參皂苷具有抗氧化、改善血流動力學(xué)、調(diào)節(jié)血管功能、抗血栓形成、保護(hù)心肌缺血再灌注等藥理活性，對多種心血管疾病都有著顯著的治療作用［15?16］，而三七、人參作為心寶丸主要藥味，富含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等活性成分［17?19］，其中人參是貴重藥材，不同廠家在制備過程中其投料差異在很大程度上影響到產(chǎn)品質(zhì)量，故有必要制定該類成分含量限度，以保證產(chǎn)品有效性。本實(shí)驗(yàn)測定2 個廠家各10 批心寶丸中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總含量，以其平均值的70%為下限來制訂限度，最終確定每丸含人參、三七以三者總含量計(jì)，不得少于1.0 mg。

4 結(jié)論

心血管疾病作為全球發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康。心寶丸作為治療多種心血管疾病的名優(yōu)產(chǎn)品，是在補(bǔ)腎壯陽藥基礎(chǔ)上加益氣、活血、通絡(luò)等藥物形成特色組方，不僅表現(xiàn)出高效低毒的優(yōu)勢特征，而且聯(lián)合其他中西藥物使用能增強(qiáng)療效，在社會老齡化趨勢下具有廣闊的應(yīng)用前景，但該制劑組方藥材多，也在一定程度上增加了其質(zhì)量控制的難度?，F(xiàn)行心寶丸標(biāo)準(zhǔn)大多采用傳統(tǒng)手段，存在陰性干擾、重復(fù)性差等問題，而且缺少含量測定項(xiàng)，不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)基于2020 年版《中國藥典》對心寶丸藥材指標(biāo)成分的更新，建立TLC法定性鑒別洋金花，GC 法定性鑒別冰片、人工麝香、肉桂，HPLC 測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總含量，大大提高了該制劑質(zhì)量的安全性和可控性，從而為建立其更全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有力保證。