顧英琳 張勝波 李正國(guó)

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 山東 濟(jì)寧272067； 2.濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 山東 濟(jì)寧272073）

決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］，具有清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效［3?5］。決明子配方顆粒是由具有GMP 資質(zhì)的制藥公司生產(chǎn)的中藥湯劑改良產(chǎn)品，其優(yōu)點(diǎn)在于攜帶和使用方便［6］，在臨床治療上常用于治療羞明多淚、目暗不明、目赤澀痛、頭痛眩暈、大便秘結(jié)等癥狀［7］，但大多數(shù)配方顆粒缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和一致性評(píng)價(jià)［8?10］。配方顆粒與中藥材標(biāo)準(zhǔn)水煎劑的等效性尚不清楚。研究顯示，決明子中的有效成分主要為蒽醌類化合物［11?14］，目前有關(guān)決明子中有效成分含量測(cè)定的研究多針對(duì)橙黃決明素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素等，其中以對(duì)橙黃決明素和大黃酚的研究為主［15?18］。本研究擬采用HPLC 法對(duì)決明子與其配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚成分進(jìn)行目標(biāo)導(dǎo)向分離。與2020年版《中國(guó)藥典》中描述的提取工藝相比，本方法操作簡(jiǎn)單、專屬性高，穩(wěn)定性好，更有利于企業(yè)對(duì)配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，同時(shí)降低對(duì)決明子及其配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚含量檢測(cè)的成本。

1 材料

1.1 儀器 Nexera LC?20ADXR 高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），配置SPD?20A 紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、LC?20AD多溶劑輸送系統(tǒng)、CTO?20AC 柱溫箱、LabSolutions 數(shù)據(jù)處理工作站；BT25S 型十萬(wàn)分之一電子天平、CP224S 型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ?500VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 大黃酚（批號(hào)110796?201922，純度99.4%）、橙黃決明素（批號(hào)111900?202006，純度99.0%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。決明子（批號(hào)181201，產(chǎn)地河南洛陽(yáng)，亳州市圣海中藥飲片有限公司），經(jīng)專家鑒定為正品。炒決明子配方顆粒（批號(hào)9115612，2.0 g／袋，相當(dāng)于原藥材10 g，廣東一方制藥有限公司）。0.45 μm 醋酸纖維素膜過(guò)濾器（大連精研分析儀器有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；異丙醇為色譜純，無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、磷酸等均為分析純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為超純水（1815 元素型摩爾超純水系統(tǒng)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品各10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇混勻、定容，超聲處理10 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得（質(zhì)量濃度為200 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 決明子粉碎后過(guò)120 目篩，精密稱取粉末和配方顆粒各1 g，分別置于250 mL 圓底燒瓶中，各加入80 mL 甲醇水浴加熱，回流時(shí)間為100 min，趁熱過(guò)濾，用甲醇洗滌殘?jiān)?次，合并濾液，再水浴加熱，回收甲醇，殘?jiān)屑尤?0 mL 蒸餾水進(jìn)行溶解，超聲處理10 min，加入20 mL 無(wú)水乙醇?乙酸乙酯（1∶1）混合液萃取，萃取層用水浴鍋進(jìn)行加熱，回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，? 次移至25 mL 量瓶中，加入甲醇混勻、定容，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 色譜條件 Waters Atlantic T3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相90% 乙腈與10% 異丙醇混合液?0.1%磷酸（70∶30）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.01、0.03、0.10、0.40、2.00、5.00 mL，分別置于6個(gè)10 mL 量瓶中，甲醇稀釋搖勻，定容，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，制得質(zhì)量濃度 為0.2、0.6、2.0、8.0、40、100 μg／mL的對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為橙黃決明素Y＝8.41×103X＋13.26（r＝0.999 9）、大黃酚Y＝9.22×103X＋4.92（r＝0.999 8），分別在0.60～100.00 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，同一天在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得橙黃決明素峰面積RSD 分別為0.67%、1.02%、1.93%，大黃酚峰面積 RSD 分別為1.32%、0.85%、1.76%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

2.3.3 日間精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，連續(xù)3 d，測(cè)得橙黃決明素峰面積RSD 分別為0.98%、1.61%、2.60%；大黃酚峰面積RSD 分別為1.46%、1.05%、2.23%，表明該方法日間精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液及“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、1、2、8、12、24 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)照品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積RSD 分別為0.12%、0.21%，決明子供試品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積RSD 分別為0.34%、0.25%，決明子配方顆粒供試品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積RSD 分別為0.27%、0.24%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批決明子和決明子配方顆粒各6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備決明子和決明子配方顆粒供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得決明子中橙黃決明素含量RSD 為1.26%，大黃酚含量RSD 為0.9%；決明子配方顆粒中橙黃決明素含量RSD 為0.82%，大黃酚含量RSD 為0.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的同一批決明子和決明子配方顆粒各6份，每份0.1 g，分別精密加入10 mL 對(duì)照品溶液（含橙黃決明素、大黃酚各10.00 μg／mL），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，決明子中橙黃決明素、大黃酚的平均加樣回收率（RSD）分別為94.20%（1.59%）、98.71%（1.01%），決明子配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚的平均加樣回收率（RSD）分別為96.42%（1.50%）、102.15%（1.03%）。

2.4 含量測(cè)定 取決明子（批號(hào)181201）及其配方顆粒（批號(hào)9115612）各3份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）

3 討論

研究表明，決明子藥材與配方顆粒在臨床上常用于治療羞明多淚、目暗不明、目赤澀痛、頭痛眩暈、大便秘結(jié)等癥狀［2?4］。隨著中藥在全世界范圍的推廣，定量準(zhǔn)確已經(jīng)不能滿足于對(duì)中藥質(zhì)量的控制要求，而建立多指標(biāo)成分同步分析的模式已經(jīng)成為關(guān)注的重點(diǎn)。決明子主要是通過(guò)水解蒽醌苷進(jìn)行質(zhì)量控制，包括其水解產(chǎn)物大黃酚及橙黃決明素。本研究建立測(cè)定決明子藥材與配方顆粒的HPLC 特征圖譜，對(duì)兩者中橙黃決明素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，鑒別市場(chǎng)上決明子藥材與配方顆粒的正偽與優(yōu)劣。

本研究通過(guò)對(duì)提取方式（超聲提取法、熱回流提取法、連續(xù)回流提取法）的考察發(fā)現(xiàn)，熱回流提取法對(duì)橙黃決明素和大黃酚同時(shí)提取的效果相對(duì)較好；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察甲醇、70% 甲醇、50% 甲醇對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果表明甲醇提取物色譜圖雜質(zhì)干擾較少，且提取率較高，故選擇甲醇熱回流提取法；對(duì)提取時(shí)間（30、60、100、150 min）進(jìn)行考察，確定提取時(shí)間為100 min時(shí)，有效成分已提取完全。此外，本研究考察不同流動(dòng)相的分離效果，與傳統(tǒng)的乙腈?水、甲醇?水、乙腈?0.1%磷酸這3 個(gè)不同流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果相比較，乙腈與異丙醇（90∶10）混合液?0.1%磷酸等度洗脫對(duì)所測(cè)有效成分達(dá)到基線分離，效果較好。

相較于以往研究方法，本方法操作簡(jiǎn)單，采用等度洗脫，專屬性高，穩(wěn)定性好，降低檢驗(yàn)成本，通過(guò)對(duì)決明子與配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚的含量測(cè)定，對(duì)質(zhì)量進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，鑒別市場(chǎng)上決明子與配方顆粒的正偽與優(yōu)劣，為保證藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。