董萍萍 張加余王紅孫志強王笑代龍?王少平?

（1.濱州醫(yī)學院， 山東 濱州264003； 2.山東中醫(yī)藥大學， 山東 濟南250300； 3.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術研究院有限公司， 山東 德州251200）

近年來國家對于經(jīng)典名方發(fā)布了開發(fā)利用的具體政策，2019 年3 月出臺的《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質(zhì)基準的申報資料要求公開征求意見》，要求所開發(fā)的經(jīng)典名方與傳統(tǒng)湯劑的物質(zhì)基礎需保持基本一致［1］。物質(zhì)基準的研究對于經(jīng)典名方的開發(fā)和利用至關重要。五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒》，具有清熱解毒、消散疔瘡的功效，主治各種疔毒、癰瘡腫毒等，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等中藥組成，均具有清熱解毒的功效［2?7］。目前，關于五味消毒飲中單味藥的化學成分報道較多，但對于整方以及物質(zhì)基準的化學成分報道較少，其發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎尚不明確，制約了該經(jīng)典名方的進一步開發(fā)。

高分辨率質(zhì)譜（HRMS）可為化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供豐富的信息，極大地提升了化學成分鑒定效率，成為中藥化學成分鑒定的常用方法［8?12］。其中，UHPLC?Q?Exactive Orbitrap 可進行高分辨率和高質(zhì)量精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，保證篩查結(jié)果的可靠和準確性。本研究采用UHPLC?Q?Exactive Orbitrap MS 技術，對五味消毒飲煎液的化學物質(zhì)進行系統(tǒng)分析，進一步為該方的藥效物質(zhì)基礎、藥效物質(zhì)傳遞、質(zhì)量控制等奠定基礎。

1 材料

UHPLC?Q?Exactive Orbitrap 高分辨質(zhì)譜（配有電噴霧離子源）、XCalibur 2.1 質(zhì)譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波清洗機（上海比朗儀器制造有限公司）；Waters HSS T3 UPLC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

蒙花苷（批號111737?201910）、秦皮乙素（批號110741?201908）、綠原酸（批號110753?201916）、阿魏酸（批號110773?201914）、芹菜素（批號110861?201912）、α?細辛醚（批號111638?201906）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A（批號Y24N8Y49009）、異綠原酸B（批號P25J6F1793）、異綠原酸C（批號P25J6F1794）對照品購自上海源葉生物有限公司；山柰酚（批號K110308）、甘草素（批號MUST?19101611）、咖啡酸（批號MUST?14100803）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，以上對照品純度均≥98%。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

金銀花（批號190615，產(chǎn)地山東），購自山東平邑種植地；紫花地?。ㄅ?90428，產(chǎn)地山西），購自河北安國藥材市場；野菊花（批號190721，產(chǎn)地江蘇）、蒲公英（批號200104，產(chǎn)地江蘇）、天葵子（批號190529，產(chǎn)地安徽）購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)濟南市藥檢所宋希貴主任鑒定均為正品。

2 方法

2.1 五味消毒飲供試品溶液制備 稱取金銀花15 g、野菊花6 g、蒲公英6 g、紫花地丁6 g、紫背天葵子6 g，加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2次，每次30 min，濾液合并濃縮至500 mL，得五味消毒飲煎液。將該煎液進行冷凍干燥，得凍干粉。精密稱取凍干粉0.5 g 于錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，搖勻濾過，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備各單味藥材樣品。

2.2 對照品溶液制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解，作為混合對照品溶液。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件 Waters HSS T3 UPLC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～35 min，5%～95% B；35～40 min，95%～5%B）；體積流量0.25 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量3 μL。檢測模式正負離子；氮氣（純度≥99.99%）分別作為鞘氣和輔助氣體；毛細管溫度320 ℃；蒸發(fā)器溫度320 ℃；噴涂電壓3 500／3 200 V（＋／－）；分辨率70 000；高分辨掃描范圍為m／z80～1 200；碰撞能30 eV；dd?MS2分辨率17 500。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Thermo Xcalibur 2.1 工作站進行數(shù)據(jù)采集和處理。為了盡可能多地獲得ESI?MS／MS 碎片離子，選擇強度不低于40 000 的正離子模式和10 000 的負離子模式下的信號峰進行鑒定。根據(jù)精確分子質(zhì)量、元素組成和可能發(fā)生的反應，對所有的母離子和碎片離子的分子式進行預測設置。參數(shù)設置如下，C ［1?30］，H ［5?60］，O［1?20］，S ［0?2］，N ［0?5］ 和環(huán)不飽和雙鍵數(shù)（RDB）［3?20］，質(zhì)量精度誤差在1×10－5以內(nèi)。

3 結(jié)果

首先建立了基于高分辨液質(zhì)聯(lián)用鑒定中藥化學成分的分析策略，進而開展五味消毒飲的化學成分定性研究。（1）根據(jù)中英文文獻及網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，檢索五味消毒飲及各單味藥材已報道的化學成分，建立該經(jīng)典名方的化學成分數(shù)據(jù)庫；（2）通過Orbitrap超高分辨率全掃描采集，在掃描質(zhì)量誤差小于5×10－6前提下，根據(jù)一級質(zhì)譜提供的精確相對分子質(zhì)量，運用Xcalibur 2.1 軟件精確推測色譜峰的元素組成和分子式；（3）將未知化合物的二級碎片離子與現(xiàn)有文獻和上述五味消毒飲成分庫對比，初步推測該色譜峰歸屬；對于具有相同元素組成和相似質(zhì)譜碎片的同分異構(gòu)體，考察其色譜保留時間，推測色譜峰可能的結(jié)構(gòu)；（4）歸納對照品和已確定的化學成分質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合天然產(chǎn)物質(zhì)譜學一般裂解規(guī)律、不飽和度、N 規(guī)律、同位素峰度規(guī)律等，推測未知化合物的類型和結(jié)構(gòu)。

基于以上研究策略，采用UHPLC?Q?Exactive Orbitrap MS 對供試品溶液和對照品溶液進行分析，得正負離子模式下的總離子流圖。通過分析準分子離子峰、碎片離子信息，結(jié)合對照品和文獻報道，共鑒別了61 個成分［13?40］，包括27 個黃酮類、23個酚酸類、2 個香豆素類、5 個含氮類及其他類化合物4 個。其中，12 個成分通過與對照品比對確認，見表1，其總離子流圖見圖1。

圖1 五味消毒飲總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Wuwei Xiaodu Decoction

3.1 黃酮及其苷類成分 主要包括黃酮及其苷類、二氫黃酮及其苷類、多甲氧基黃酮類等。黃酮苷類結(jié)構(gòu)上有糖基取代，黃酮苷元在A，B 環(huán)上常有羥基、甲基、甲氧基等取代基。因此，黃酮苷類化合物在裂解過程中，主要通過高能的碰撞失去糖基，形成豐度較高的黃酮苷元離子。而黃酮苷元則進一步裂解丟失側(cè)鏈取代基和羰基，黃酮母核C 環(huán)則發(fā)生逆狄爾斯?阿爾德（RDA）裂解生成一系列特征離子峰［36］。以芹菜素為例，在負離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m／z269.05，推測其結(jié)構(gòu)式為C15H9O5；其失去羰基形成m／z241.05 的特征碎片離子，繼續(xù)丟失一分子氧形成碎片離子m／z225.06。對于黃酮類結(jié)構(gòu)的識別最有意義的碎片離子離子是在1，3 位置由RDA 裂解生成的1，3A1（m／z151.00）和1，3B1（m／z117.03）離子，通過對比芹菜素對照品的保留時間和二級碎片離子確定為芹菜素，其裂解途徑及二級質(zhì)譜見圖2?；衔?7 在保留時間10.30 min 形成較強的色譜峰，在負離子模式下形成m／z445.08 的［M?H］－分子離子峰并進一步脫去1 分子葡萄糖醛酸殘基（m／z176）形成m／z269.04 的苷元成分，并碎裂成m／z117.03、m／z151.00 等碎片，推測其為芹菜素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

圖2 負離子模式下芹菜素質(zhì)譜裂解途徑（A）及其二級質(zhì)譜圖（B）Fig.2 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of apigenin in negative ion mode

二氫黃酮類化合物具有黃酮2、3 被氫化的基本母核，由于C 環(huán)為具有半椅式結(jié)構(gòu)的非平面型結(jié)構(gòu)，水溶性稍大，因此保留時間比一般的黃酮類化合物偏小。其質(zhì)譜裂解規(guī)律與黃酮相似，但在RDA 裂解過程中更加傾向于產(chǎn)生1，3A1的碎片離子作為基峰［40］。化合物38 在負離子模式下，產(chǎn)生準分子離子峰m／z287.055 05，推測其分子式為C15H11O6。碎片離子m／z135.04 與m／z119.03 分別為特征碎片1，3A1和1，3B1，結(jié)合其保留時間，化合物38 被推斷為圣草酚?；衔?4 在負離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m／z449.108 15，推測其分子式為C21H21O11，其中性丟失葡萄糖殘基（m／z162）產(chǎn)生苷元m／z287.05，苷元產(chǎn)生與圣草酚相同的碎片離子m／z135.04 與m／z119.03，結(jié)合保留時間推測化合物34 為圣草酚?7?O?葡萄糖苷。

3.2 酚酸類成分 大部分酚酸類成分在正離子模式下響應很低，從五味消毒飲中發(fā)現(xiàn)了酚酸類成分19個，主要包括奎寧酸酯類成分和其他酚酸類成分。

3.2.1 奎寧酸酯類成分 奎寧酸是日常飲食的常見成分，能夠通過腸道菌群轉(zhuǎn)化成色氨酸和煙酰胺，為人類必不可少的代謝成分提供了生理源［40］?；衔?1 在負離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m／z191.054 76，推測其結(jié)構(gòu)式為C7H11O6，結(jié)合碎片離子m／z93.03（C6H5O－）和中性丟失CO2所得碎片m／z147.07（C6H11O4－），推斷其為奎寧酸。化合物1 在正離子模式下產(chǎn)生［M＋H］＋離子m／z123.054 84，其分子式為C6H7ON2，二級碎片離子m／z80.05 和m／z53.04 為［M＋H］＋離子依次丟失CNOH 和CNH 而得，結(jié)合文獻［41］ 報道，推斷化合物為煙酰胺?；衔? 在正離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m／z205.096 52，其分子式為C11H13O2N2。二級碎片離子m／z130.06 為準分子離子失去C2H5NO2所得，m／z118.07 為準分子離子失去C3H5NO2所得，結(jié)合文獻［18，40］ 報道推斷化合物8 為色氨酸。

奎寧酸常與咖啡酸形成咖啡酸?？鼘幩狨ヮ惓煞郑?7，42］，如綠原酸等廣泛存在于中藥材中。以綠原酸為例，在負離子模式下，產(chǎn)生準分子離子峰m／z353.087 25，推測其結(jié)構(gòu)式為C16H17O9，在二級圖譜中形成m／z191.05 的奎寧酸基峰碎片離子，并生成m／z161.02 和m／z135.04 的咖啡酸特征碎片離子，結(jié)合對照品保留時間與二級碎片圖譜，鑒定化合物14 為綠原酸，其負離子模式質(zhì)譜裂解規(guī)律和二級圖譜見圖3。

圖3 負離子模式下綠原酸質(zhì)譜裂解途徑（A）及其二級質(zhì)譜圖（B）Fig.3 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of chlorogenic acid in negative ion mode

化合物7、12 和17 在負離子模式下都產(chǎn)生理論質(zhì)荷比為m／z353.087 81 的準分子離子峰，且都產(chǎn)生了m／z191.05 的碎片離子，以及生成了m／z161.02 或m／z135.04 的碎片離子，與綠原酸裂解途徑相一致，結(jié)合保留時間以及文獻 ［17?18，42］ 報道，三者分別被鑒定為1、3、4?咖啡?？鼘幩?。

化合物41、42 和48 在負離子模式下產(chǎn)生［M?H］－離子m／z515.118 40（C25H23O12），同時產(chǎn)生了m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 等奎寧酸和咖啡酸特征碎片，故三者為奎寧酸酯類成分，結(jié)合對照品保留時間以及二級質(zhì)譜圖，三者分別被鑒定為異綠原酸A、B 和C。因此，碎片離子m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 可以作為診斷離子對奎寧酸酯類成分進行鑒別。

3.2.2 其他酚酸類成分 化合物6 在負離子模式下，檢測到m／z153.017 96 的準分子離子峰，分子式為C7H5O4，在二級質(zhì)譜裂解中通過丟失一個·COOH自由基產(chǎn)生m／z108.02 的碎片離子峰，化合物6 鑒定為原兒茶酸。化合物15 在負離子模式下產(chǎn)生m／z179.033 55 的分子離子峰，其分子式為C9H7O4，在其二級質(zhì)譜中，產(chǎn)生中性丟失CO2后的碎片離子m／z135.04 以及丟失C3H4O2后的碎片離子m／z108.02，結(jié)合對照品保留時間以及二級質(zhì)譜圖，其被鑒定為咖啡酸?；衔?8 在負離子模式下產(chǎn)生m／z193.049 47 的準分子離子峰，其結(jié)構(gòu)式為C10H9O4，二級質(zhì)譜由于丟失·CH3、CO2和·CH3＋CO2而產(chǎn)生m／z178.03、m／z148.95 和m／z133.03 的碎片離子，結(jié)合對照品保留時間以及二級圖譜，其被確定為阿魏酸。

3.3 香豆素類成分 從五味消毒飲中發(fā)現(xiàn)簡單香豆素類成分2個，為苷元秦皮乙素和其葡萄糖苷秦皮甲素。根據(jù)秦皮乙素的對照品保留時間和質(zhì)譜信息，化合物13 被鑒定為秦皮乙素?；衔? 在負離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m／z339.071 41，其分子式為C15H15O9，在其二級質(zhì)譜中，中性丟失葡萄糖殘基（m／z162）產(chǎn)生了苷元基 峰m／z177.02，繼而連續(xù)丟失CO 產(chǎn)生碎片m／z149.02 和m／z121.03，鑒定為秦皮甲素。其質(zhì)譜裂解規(guī)律和二級質(zhì)譜圖見圖4。

圖4 負離子模式下秦皮甲素質(zhì)譜裂解途徑（A）及其二級質(zhì)譜圖（B）Fig.4 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of esculin in negative ion mode

3.4 含氮類化合物 共鑒別5 個含氮類，包括3個核苷，1 個氨基酸和1 個酰胺類化合物。其中化合物1 和8 被鑒定為煙酰胺和色氨酸，化合物2、3、5 為核苷類物質(zhì)。核苷類物質(zhì)在質(zhì)譜中通常會失去核糖殘基（m／z132）而生成嘧啶或嘌呤基峰?；衔? 在負離子模式下生成準分子離子峰m／z243.061 39，計算其分子式為C9H11O6N2。在二級質(zhì)譜中，碎片離子m／z110.02 比準分子離子峰小132，證明了核糖的存在，其繼續(xù)失去一分子CO 形成m／z83.02 的碎片離子，最終化合物2 被鑒定為尿苷。含有氨基的核苷類物質(zhì)在質(zhì)譜中常常會失去NH3，化合物5 其負離子模式下準分子離子峰m／z282.083 68 的分子式為C10H12O5N5，在二級質(zhì)譜中，m／z133.01 為準分子離子峰連續(xù)中性丟失核糖殘基（m／z132）和NH3（m／z17）而形成的，結(jié)合保留時間鑒定化合物5 為鳥苷。

3.5 其他化合物 鑒別出了寡糖、脂肪酸、苯丙素類成分?；衔? 在負離子模式下準分子離子峰為m／z341.108 34，分子式為C12H21O11，在其二級質(zhì)譜中產(chǎn)生m／z161.02 和m／z113.02 等碎片離子，結(jié)合保留時間，化合物4 被鑒定為蔗糖。化合物60 和61 分別被鑒定為棕櫚酸和油酸，來源于野菊花、蒲公英和天葵子藥材，二者均產(chǎn)生中性丟失CO2后的碎片離子m／z237.22 和m／z211.20?；衔?9 在負離子模式下產(chǎn)生 ［M?H］－離子m／z207.101 41，分子式為C12H15O3，在負離子模式下丟失一分子烯丙基得到m／z167.05 碎片離子，同時伴隨脫·CH3后的碎片離子m／z193.09，結(jié)合對照品保留時間和二級質(zhì)譜圖，化合物59 被鑒定為α?細辛醚。

4 討論

經(jīng)典名方物質(zhì)基準的研究是順利開發(fā)經(jīng)典名方制劑的關鍵環(huán)節(jié)［43］，中藥復方中含有較為復雜的化學成分，明確化學成分的組成對于闡明其藥效物質(zhì)基礎、制定質(zhì)量標準和進一步研究制備工藝具有重要意義。近年來我國對于五味消毒飲的成分研究多集中在指紋圖譜的建立以及單成分的定量中，五味消毒飲的指紋圖譜對10 種成分進行了含量測定［44］；建立五味消毒飲口服液的HPLC 法特征指紋圖譜，并同時測定6 種主要指標成分的量［45］；采用HPLC 法同時測定五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素4 種活性成分［46］。

本研究采用UHPLC?Q?Exactive?Orbitrap 高分辨質(zhì)譜對五味消毒飲的物質(zhì)組成進行研究，比較全方基準物質(zhì)與單味藥材的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過獲得的準分子離子峰、二級碎片離子峰結(jié)合參考文獻和數(shù)據(jù)庫以及對照品信息共鑒定出61 個化合物，以黃酮類、酚酸類、香豆素類以及含氮類成分為主，其中黃酮和酚酸類成分存在于金銀花、野菊花、紫花地丁，香豆素類成分多來源于紫花地丁，含氮類多來源于天葵子中，說明五味消毒飲物質(zhì)基準未失去各味藥的主要成分，未產(chǎn)生新的成分。對于五味消毒飲的化學組成進行了較為系統(tǒng)的闡釋，并對藥材來源進行了歸屬，可為深入分析其藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)，為五味消毒飲制劑開發(fā)提供有力的數(shù)據(jù)支撐，也為其他經(jīng)典名方的研究提供了參考。