董明亮 馬新蘋 郭金蘭 甘才斌 張步鑫

（1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院， 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng)453000； 2.河南省中醫(yī)院， 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 河南 鄭州450002）

金沸草為菊科植物旋覆花Inula japonicaThunb.的干燥地上部分［1］，分布于海拔150～500 m 的丘陵、荒地、路旁、山地密林間。金沸草味咸，性溫，具有疏肝氣、化痰飲、消腫毒的功效［2］。其主要化學(xué)成分為萜類、黃酮類、烯酮、醌類、有機酸等［3］。金沸草具有抗真菌、保肝、抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)等活性［4?5］。對金沸草有效部位進(jìn)行分離鑒定出15 個化合物，均為首次從金沸草中分離得到，其中化合物1、11、13、15 對角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCat 細(xì)胞）具有不同程度的抑制作用。

1 材料

Thermofisher DQ 型質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Bruker QA?500P 型超導(dǎo)核磁共振譜（德國Bruker 公司）；KTH?163 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州予達(dá)儀器有限公司）；SephadeX LH?20 凝膠（瑞典Pharmacia 公司）；HBS?1096A 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；PAUT1250NA 型全自動離心機（蚌埠谷雨分離機械制造有限公司）；BSA6202S?CW 型電子天平（德國賽多利斯公司）；DMSO 培養(yǎng)基（北京安諾倫生物科技有限公司）。所用試劑均為分析純。

金沸草購自新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，經(jīng)河南省中醫(yī)院張步鑫副教授鑒定為金沸草Inula japonicaThunb.。

2 提取與分離

取金沸草33.7 kg，回流提取3次，回收溶劑得金沸草浸膏4.7 kg。依次用石油醚、二氯甲烷、丙酮和正丁醇萃取，濃縮至浸膏，得石油醚層（Fr.A）306.5 g、二氯甲烷層（Fr.B）283.6 g、丙酮層（Fr.C）203.8 g、正丁醇層（Fr.D）236.5 g。Fr.B4 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚?丙酮（90∶10～50∶50～10∶90）梯度洗脫，得到Fr.B4?1～Fr.B4?7。Fr.B4?4 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚?乙酸乙酯（30∶70）洗脫，得化合物1（12 mg）、9（23 mg）、10（18 mg）。Fr.B7 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚?乙酸乙酯（70∶30～50∶50～30∶70）梯度洗脫，得到Fr.B7?1～Fr.B7?6。Fr.B7?5 經(jīng)Sephadex LH?20 柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物8（16 mg）、12（24 mg）。Fr.B9 經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（60∶40～40∶60）梯度洗脫，得Fr.B9?1～Fr.B9?7。Fr.B9?3 經(jīng)Sephadex LH?20柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物11（17 mg）、13（29 mg）。取Fr.C 過硅膠色譜柱，以石油醚?丙酮（80∶20～0∶100）梯度洗脫，得到Fr.C1～Fr.C9。Fr.C3 經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（90∶10～70∶30～10∶90）梯度洗脫，得到Fr.C3?1～Fr.C3?9。Fr.C3?4 經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷?丙酮（50∶50）洗脫，得化合物2（14 mg）、5（17 mg）。Fr.C3?7 經(jīng)Sephadex LH?20柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物15（17 mg）、14（21 mg）。Fr.C8 經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷?丙酮（80∶20～50∶50～20∶80）梯度洗脫，得到Fr.C8?1～Fr.C8?8。Fr.C8?3 經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（50∶50）洗脫，得化合物7（9 mg）、6（25 mg）。Fr.C8?6 經(jīng)Sephadex LH?20 柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物3（22 mg）、4（13 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：紫色粉末，ESI?MSm／z：765.1［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?2′），7.59（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），6.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.27（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），6.05（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：104.2（C?1），l59.2（C?2），134.7（C?3），180.6（C?4），162.5（C?5），98.4（C?6），165.3（C?7），95.4（C?8），161.2（C?9），103.5（C?10），122.8（C?1′），116.8（C?2′），146.4（C?3′），150.4（C?4′），117.3（C?5′），124.1（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］ mutabiloside 數(shù)值基本一致。

化合 物2：黃色粉末，ESI?MSm／z：324.8［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：12.79（1H，s，5?OH），9.51（4H，m，6，7，3′，4′?OH），7.38（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），7.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H?2′），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.59（1H，s，H?3），6.48（1H，s，H?8）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：117.1（C?1），164.3（C?2），101.7（C?3），177.2（C?4），152.4（C?5），131.8（C?6），151.8（C?7），94.2（C?8），151.8（C?9），103.2（C?10），118.5（C?1′），110.4（C?2′），146.8（C?3′），150.2（C?4′），115.3（C?5′），119.2（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 6?羥基木犀草素數(shù)值基本一致。

化合 物3：黃色粉末，ESI?MSm／z：351.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.73（1H，s，5?OH），7.73（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），7.12（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），7.05（1H，s，H?3），6.76（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.58（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），3.79（3H，s，7?OCH3），3.74（3H，s，3′?OCH3），3.71（3H，s，4′?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：131.5（C?1），165.2（C?2），104.7（C?3），181.6（C?4），161.9（C?5），102.4（C?6），163.8（C?7），92.5（C?8），157.4（C?9），105.7（C?10），123.6（C?1′），108.1（C?2′），154.7（C?4′），113.8（C?5′），119.2（C?6′），55.4（7?OCH3），54.2（3′?OCH3），56.5（4′?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 木犀草素?7，3′，4′?三甲醚數(shù)值基本一致。

化合 物4：黃色粉末，ESI?MSm／z：397.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.47（1H，s，5?OH），9.48（1H，brs，4′?OH），7.41（2H，s，H?2′，6′），7.18（1H，s，H?3），6.92（1H，s，H?8），4.07（3H，s，7?OCH3），3.84（6H，s，3′，5′?OCH3），3.71（3H，s，6?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.2（C?1），163.7（C?2），104.2（C?3），181.7（C?4），151.6（C?5），128.5（C?6），159.3（C?7），90.2（C?8），151.1（C?9），102.8（C?10），119.6（C?1′），103.7（C?2′），149.5（C?3′），139.2（C?4′），127.3（C?5′），103.7（C?6′），59.3（6?OCH3），57.2（7?OCH3），57.2（3′，5′?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 5，4′?二羥基?6，7，3′，5′?四甲氧基黃酮數(shù)值基本一致。

化合物5：黃色粉末，ESI?MSm／z：337.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.17（1H，s，5?OH），9.91（1H，brs，4′?OH），7.81（2H，d，H?2′，6′），6.93（2H，d，H?3，5′），6.71（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.29（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），3.94（3H，s，7?OCH3），3.81（3H，s，3′?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：146.2（C?1），164.7（C?2），104.6（C?3），174.9（C?4），159.2（C?5），98.1（C?6），166.3（C?7），91.4（C?8），156.8（C?9），103.2（C?10），120.6（C?1′），109.5（C?2′），147.2（C?3′），149.7（C?4′），114.7（C?5′），119.8（C?6′），55.8（7?OCH3），54.6（3′?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 5，4′?二羥基?7，3′?二甲氧基黃酮數(shù)值基本一致。

化合物6：黃色粉末，ESI?MSm／z：381.2 ［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.93（1H，s，?OH），6.84（2H，s，H?3，6′），6.52（1H，s，H?3′），6.48（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），4.03（6H，s，2′，5′?OCH3），3.97（3H，s，4′?OCH3），3.88（3H，s，7?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：125.2（C?1），161.8（C?2），109.2（C?3），127.3（C?4），161.8（C?5），97.2（C?6），166.1（C?7），91.3（C?8），110.4（C?1′），149.8（C?2′），96.8（C?3′），152.5（C?4′），153.6（C?5′），113.7（C?6′），101.6（C?4a），157.3（C?8a），55.8（7?OCH3），55.8（2′?OCH3），55.1（4′?OCH3），54.9（5′?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 5?羥基?7，2′，4′，5′?四甲氧基黃酮數(shù)值基本一致。

化合物7：無色針晶，ESI?MSm／z：188.7［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：11.46（1H，s，2?OH），8.27（1H，s，4?OH），6.31（1H，d，J＝1.8 Hz，H?5），6.18（1H，d，J＝1.8 Hz，H?3），2.58（3H，s，1?OCH3），2.51（3H，s，6?CH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：109.8（C?1），166.8（C?2），100.2（C?3），161.6（C?4），113.5（C?5），143.5（C?6），32.8（1?COCH3），24.6（6?CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 2，4?二羥基?6?甲基苯乙酮數(shù)值基本一致。

化合物8：黃色粉末，ESI?MSm／z：201.3［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.65（1H，d，J＝7.8 Hz，H?7），7.41（2H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），6.73（2H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），6.29（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），3.78（3H，s，9?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：128.3（C?1），130.2（C?2），116.2（C?3），162.5（C?4），116.2（C?5），130.2（C?6），145.1（C?7），115.2（C?8），168.1（C?9），52.3（9?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 對羥基肉桂酸甲酯數(shù)值基本一致。

化合 物9：黃色針晶，ESI?MSm／z：215.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.20（1H，brs，4?OH），7.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），6.79（1H，d，J＝7.8 Hz，H?7），6.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），5.63（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），3.92（1H，q，J＝7.8 Hz，H?1′），1.05（3H，t，J＝7.8 Hz，H?2′）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：124.7（C?1），133.5（C?2），113.5（C?3），142.7（C?4），113.5（C?5），133.7（C?6），142.6（C?7），114.2（C?8），165.8（C?9），59.3（C?1′），13.8（C?2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 對羥基肉桂酸乙酯數(shù)值基本一致。

化合物10：黃色粉末，ESI?MSm／z：189.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：8.03（1H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），4.41（1H，q，J＝7.8 Hz，H?2′），1.42（1H，t，J＝7.8 Hz，H?3′）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：123.6（C?1），131.8（C?2），114.9（C?3），159.4（C?4），114.9（C?5），131.8（C?6），168.2（C?1′），59.6（C?2′），15.1（C?3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 對羥基苯甲酸乙酯數(shù)值基本一致。

化合物11：白色粉末，ESI?MSm／z：401.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6），6.76（2H，d，J＝7.8 Hz，H?17，21），6.72（1H，d，J＝7.8 Hz，H?14），6.59（1H，d，J＝7.8 Hz，H?12），6.56（2H，d，J＝7.8 Hz，H?18，20），6.37（1H，d，J＝7.8 Hz，H?4），5.79（1H，s，H?9）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：199.3（C?1），109.3（C?2），168.1（C?3），106.2（C?4），164.1（C?5），112.7（C?6），141.6（C?7），197.2（C?8），54.3（C?9），102.4（C?10），160.2（C?11），108.3（C?12），156.8（C?13），109.6（C?14），142.8（C?15），129.4（C?16），131.2（C?17），115.4（C?18），158.3（C?19），115.4（C?20），131.2（C?21）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］ diptoindonesin D 數(shù)值基本一致。

化合物12：白色粉末，ESI?MSm／z：245.3［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.48（2H，m，H?3），7.69（2H，m，H?4），3.96（2H，m，H?5），1.17（3H，t，J＝7.8 Hz，H?6）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：159.2（C?1），129.4（C?2），130.6（C?3），129.1（C?4），69.3（C?5），19.1（C?6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］ 鄰苯二甲酸二乙酯數(shù)值基本一致。

化合物13：黃色油狀物，ESI?MSm／z：669.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.57（1H，s，5?OH），7.21（3H，m，H?2′，6′，7?），7.09（1H，brs，H?2?），6.94（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6?），6.71（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5?），6.61（1H，s，H?3），6.35（1H，s，H?6），6.18（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8?），4.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H?1″），3.68（3H，s，3?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：141.2（C?1），163.6（C?2），101.5（C?3），181.7（C?4），157.2（C?5），101.5（C?6），1643.6（C?7），108.3（C?8），157.2（C?9），108.3（C?10），119.4（C?1′），118.6（C?2′），144.2（C?3′），150.8（C?4′），115.7（C?5′），112.6（C?6′），77.2（C?1″），69.5（C?2″），71.3（C?3″），69.2（C?4″），80.3（C?5″），60.8（C?6″），126.7（C?1?），114.6（C?2?），147.1（C?3?），149.3（C?4?），114.6（C?5?），120.6（C?6?），145.7（C?7?），115.3（C?8?），164.9（C?9?），54.8（3?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］ 7?O?feruloylorientin 數(shù)值基本一致。

化合物14：黃色粉末，ESI?MSm／z：381.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.02（2H，d，J＝6.8 Hz，H?2′，2″），6.91（4H，m，H?6′，6″，5′，5″），4.73（2H，d，J＝4.8 Hz，H?2，6），3.92（8H，m，H?4β，8β），3.24（2H，m，H?1，5）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.1（C?1），112.3（C?2），151.3（C?3），148.2（C?4），115.4（C?5），119.3（C?6），86.2（C?7），56.1（C?8），73.4（C?9），134.1（C?1′），112.3（C?2′），151.3（C?3′），148.2（C?4′），115.4（C?5′），119.3（C?6′），86.2（C?7′），56.1（C?8′），73.4（C?9′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］ pinoresinol 基本一致。

化合物15：白色粉末，ESI?MSm／z：263.1［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.63（1H，d，J＝9.6 Hz，H?9），7.38（1H，d，J＝9.6 Hz，H?10），7.27（1H，d，J＝9.6 Hz，H?7），7.24（1H，d，J＝9.6 Hz，H?8），7.08（1H，dd，J＝9.6，4.8 Hz，H?6），6.75（1H，d，J＝9.6 Hz，H?1），6.62（1H，d，J＝9.6 Hz，H?3），3.94（3H，s.，4?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：112.3（C?1），158.2（C?2），102.7（C?3），155.1（C?4），130.1（C?5），113.8（C?6），155.4（C?7），119.3（C?8），128.1（C?9），126.1（C?10），116.5（C?4a），138.2（C?8a），136.1（C?10a），122.1（C?4β），59.1（4?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［19］moscatin 基本一致。

4 化合物對HaCat 細(xì)胞的影響

取2022 年1～2 月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院確診的尋常型銀屑病患者15例，經(jīng)患者知情同意，通過環(huán)鉆取上臂外側(cè)皮損組織，經(jīng)中性蛋白酶分離獲取原代角質(zhì)形成細(xì)胞，在培養(yǎng)基中孵育，得到第二代角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCat 細(xì)胞）。通過MTT 法［20］檢測化合物對HaCat 細(xì)胞的影響，取96 孔板，每孔加入約10 000 個HaCat 細(xì)胞，分別加入15 μL 化合物1～15（1、4、8 mg／L）、地塞米松（1、4、8 mg／L）、無血清培養(yǎng)基（設(shè)為對照組），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT 試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h吸棄上清液，加入DMSO 后輕輕振蕩使結(jié)晶溶解。采用酶標(biāo)儀檢測，計算細(xì)胞存活率。與對照組比較，化合物1、13、11、15 對HaCat 細(xì)胞具有抑制作用（P＜0.05），見表1。

表1 各化合物對HaCat 細(xì)胞存活率的影響（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

表1 各化合物對HaCat 細(xì)胞存活率的影響（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

5 討論

金沸草為臨床常用藥物，外用具有解毒消瘡的作用。不同品種金沸草可明顯減輕炎性細(xì)胞對瘡瘍模型豚鼠受損組織皮膚的浸潤，促進(jìn)皮膚表面的瘡瘍愈合［21］。本研究從金沸草中分離鑒定出15 個化合物，均為首次從金沸草中分離得到?；衔?、11、13、15 表現(xiàn)出不同程度的抑制HaCat 細(xì)胞增殖活性作用。本研究豐富了金沸草化學(xué)成分的資料庫，為探求抑制皮損部位的角質(zhì)形成細(xì)胞的新藥開發(fā)提供參考。